阅读说明：本技术 分析托酚酮的方法 (Method for analyzing tropolone ) 是由 B·A·维尔克斯 于 2018-12-04 设计创作，主要内容包括：本文公开了用于检测和/或定量样品中托酚酮的方法,例如在产物(例如,重组蛋白,如抗体)的最终制剂中或其生产期间产生的托酚酮。通过添加部分或完全氟化的烷基或芳基(例如五氟苯基丙基),其(共价)结合托酚酮样的化合物,将托酚酮及其衍生物(环庚三烯酮)从混合物分离。然后通过紫外或串联质谱法对其进行分析。还公开了托酚酮样的化合物和氟化烷基或芳基的反应混合物。(Disclosed herein are methods for detecting and/or quantifying tropolone in a sample, such as tropolone produced in a final formulation of a product (e.g., a recombinant protein, such as an antibody) or during production thereof. Tropolone and its derivatives (tropone) are separated from the mixture by addition of a partially or fully fluorinated alkyl or aryl group (e.g. pentafluorophenylpropyl) which (covalently) binds to the tropolone-like compound. It is then analyzed by uv or tandem mass spectrometry. Also disclosed are reaction mixtures of tropolone-like compounds and fluorinated alkyl or aryl groups.)

分析托酚酮的方法

本申请要求2017年12月5日提交的美国申请62/594,863的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

发明领域

本公开涉及在产物(例如重组蛋白，如抗体)生产期间对托酚酮进行检测和/或定量的方法。

背景技术

托酚酮(2-羟基-2,4,6-环庚三烯-1-酮)是一种在细胞培养基中使用以促进金属离子摄取的小分子，这对于细胞的生长是必需的，例如在生物制造中使用的那些细胞。因为托洛酮是在产品生产过程中添加到细胞培养物中的合成化学物质，所以管理生物产品的监管机构经常要求证明托洛酮的清除。

因此，需要以简单、快速、有效的方式对多种生物制药产品中的托洛酮进行分离、检测和定量的方法。

发明内容

本文所述的方法和组合物提供了从其他样品组分中快速且容易分离式I化合物(例如托酚酮)以及对式I化合物(例如托酚酮)、水平和清除进行测试。这样可以评估产物的纯度。本文所述的方法和组合物可以使式I化合物(例如托酚酮)的调节延迟(regulatorydelay)以及时间和资源消耗测试最小化。

因此，在本发明的一个方面中涉及从样品另一组分中分离式I化合物(例如托酚酮)的方法，所述方法包括：

在其中使式I化合物(例如托酚酮)与部分缔合(例如结合至该部分或被该部分保留)至大于组分的程度的情况下，使样品与部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基丙基)部分接触，

由此，将式I化合物，例如托酚酮与组分分离，其中式I为：

且其中：

X是O或S；

R¹是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、OR³、C(O)R⁵、C(O)OR³、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；

各R²独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；或者

两个R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；或者R¹和R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；

R³是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R^4a和R^4b独立地是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R⁵是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

各R⁶独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、卤素、氧代或氰基；和

n为0、1、2、4或5；

在另一方面中，本发明涉及一种评估含产物的样品中式I化合物(例如，托酚酮)存在(例如水平)的方法，该方法包括：

a)i)提供样品的等分试样，例如式I化合物(例如托酚酮)的耗尽相(例如流动相)，其中式I化合物(例如托酚酮)已与样品的另一种组分分离，或者

ii)使所述样品经受其中式I化合物例如托酚酮与样品的另一种组分分离的条件，例如以形成式I化合物(例如托酚酮)富集相或等分试样和式I化合物(例如托酚酮)耗尽相或等分试样；和

b)评估式I化合物(例如托酚酮)的存在(例如水平)，例如确定样品中式I化合物(例如托酚酮)的水平的值：

i)使用串联质谱(MS²)，或

ii)使用紫外线(UV)吸收(例如约242nm或约238nm的紫外线吸收)；

由此分析所述样品。

在另一方面中，本发明涉及一种反应混合物，其包含部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基丙基)部分以及含式I化合物(例如托酚酮)、另一组分和任选产物的样品。

在另一方面中，本发明涉及一种制备产物(例如重组多肽)的方法，所述方法包括：提供包含所述产物和任选的式I化合物(例如托酚酮)的样品，其中：

通过本文所述的方法分析样品，或

通过本文所述的方法将式I化合物(例如托酚酮)与样品的另一组分分离。

附图说明

图1显示了使用UV检测通过RP-HPLC分离的托酚酮的色谱图的两个视图；底部图是顶部图的放大图。

图2显示了使用Luna-NH₂色谱柱分离后表1中SRM跃迁的总离子流(TIC)曲线。

图3显示了使用Discovery HS F5-3(Supelco)色谱柱分离后表1中SRM跃迁(transition)的TIC痕迹。

图4显示了显示水中托酚酮标准物的校准曲线图并测定线性范围的曲线图，。

图5显示了三个处理中样品的TIC痕迹，各样品均未显示托酚酮峰。

图6显示了三个处理中样品的TIC痕迹，其中三个样品或者掺有托酚酮(顶部三个)，或者未掺有托洛酮(底部三个)。

图7显示了两个色谱图，使用紫外吸收为242nm(顶部)和238nm(底部)检测通过实施例2中确定的色谱方法处理的托酚酮标准物中的托酚酮。

图8A和8B显示了本公开的示例性LC方法的详细参数。

具体实施方式

为了使重组生物药物蛋白成为人类患者给药可接受的，重要的是从最终生物产物(例如重组多肽)中去除由制造和纯化过程产生的残留污染物。这些过程污染物包括在培养细胞和纯化生物产物过程中添加到培养基中的化合物。

美国和外国法规通常要求去除此类污染物。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求意图用于人体内使用的生物药物应尽可能不含外源性免疫球蛋白和非免疫球蛋白杂质，并要求进行测试以检测并定量潜在杂质。同样，国际协调会议(ICH)提供了有关生物技术/生物产品的测试程序和接受标准的指南。

托酚酮(2-羟基-2,4,6-环庚三烯-1-酮)是七元芳香环。其具有多种用途，包括用作化妆品和局部药物制剂中的抗氧化剂，用作防晒品中的紫外线吸收剂以及用作儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂。可以将托酚酮添加到细胞培养基中，以促进培养细胞中金属离子的摄取。在一些实施方式中，以小于或等于0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.25mg/ml、1.5mg/ml、1.75mg/ml、2mg/ml、2.25mg/ml、2.5mg/ml、2.75mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、或10mg/ml的浓度将托酚酮添加至细胞培养基。

在一些实施方式中，可以将式I化合物(例如托酚酮)添加到细胞培养基中，以促进培养细胞中金属离子的摄取。在一些实施方式中，以小于或等于0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.25mg/ml、1.5mg/ml、1.75mg/ml、2mg/ml、2.25mg/ml、2.5mg/ml、2.75mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、或10mg/ml的浓度将式I化合物(例如托酚酮)添加至细胞培养基。

作为添加到用于生产生物制品的细胞培养物中的合成化学品，许多监管机构要求：例如在可以宣布其对人体内使用安全之前，证明从生物制品中清除式I化合物(如托酚酮)。许多制造或生产生物产物的方法都包括亲和色谱步骤，例如，使用包含选择性保留所需生物产物的树脂的色谱柱，并且期望式I化合物(如托酚酮)在所需的生物产物洗脱之前会通过该亲和柱。可以使用以下步骤测定生物产物的样品中的残留的任意式I化合物(例如托酚酮)：(i)合适的色谱步骤，以将可能残留的式I化合物(例如托酚酮)与生物产物的其他组分分离，以及(ii)合适的检测和/或定量步骤，以确定式I化合物(例如托酚酮)的存在和丰度。本文描述了合适的色谱步骤和检测方法。

本公开尤其描述了对包含产物和任选的式I化合物(例如托酚酮)的样品进行分析的方法，以确定样品中存在的式I化合物(例如托酚酮)的水平的值，其中，与之前的可用方法(例如，RP-HPLC和UV/荧光检测)相比，本公开的方法在线性范围、精度、准确性和检测限中的一个或多个方面具有优势。在一些实施方式中，与之前的可用方法(例如，RP-HPLC和UV/荧光检测)相比，本公开的方法在各种产物和/或产物制剂的线性范围、精度、准确性和检测限中的一个或多个方面不受影响或未受重大有害影响(例如，大致不受影响)。例如，本公开的方法可以确定在含多种缓冲剂组分的样品中式I化合物(例如托洛酮)的水平的值，而准确性没有明显降低，而之前的可用方法可以确定用于含一种缓冲剂组分的样品中式I化合物(例如托酚酮)的水平的值，但在确定含另一缓冲剂组分的样品中式I化合物(例如托酚酮)的水平的值时，准确性降低。

在一些实施方式中，关于确定样品中存在的式I化合物(例如托酚酮)的水平的值，本公开方法具有约0.1μg/ml至10000μg/ml、0.2μg/ml至8000μg/ml、0.3μg/ml至7000μg/ml、0.4μg/ml至6000μg/ml、0.5μg/ml至5000μg/ml、0.5μg/ml至4000μg/ml、0.5μg/ml至3000μg/ml、0.5μg/ml至2000μg/ml、或0.5μg/ml至1000μg/ml(如0.5μg/ml至1000μg/ml)的线性范围。在一些实施方式中，关于确定样品中存在的式I化合物(例如托酚酮)的水平的值，本公开方法的线性范围的下限为约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、或1μg/ml(例如0.5μg/ml)。在一些实施方式中，关于确定样品中存在的式I化合物(例如托酚酮)的水平值，本公开方法的线性范围上限为约500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1200μg/ml、1400μg/ml、1600μg/ml、1800μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml、5000μg/ml、6000μg/ml、7000μg/ml、8000μg/ml、9000μg/ml、或10,000μg/ml(例如1000μg/ml)。

在一些实施方式中，关于确定样品中存在的式I化合物(例如托酚酮)的水平的值，本公开方法具有由重复样品之间标准偏差所表示的精度。在相同的实施方式中，精度可以小于或等于约50％、40％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％，例如17％、16.5％或16％。

在一些实施方式中，关于确定样品中存在的式I化合物(例如托酚酮)的水平的值，本公开方法具有由三个不同样品中平均单点添加回收率(spike recovery)所示的准确性。在相同的实施方式中，准确性可以大于或等于约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％，例如91％。

在一些实施方式中，关于确定样品中存在的式I化合物(例如托酚酮)的水平的值，本公开方法具有检测下限。在相同的实施方式中，检测下限可以为约1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml、5.5μg/ml、6μg/ml、6.5μg/ml、7μg/ml、7.5μg/ml、8μg/ml、8.5μg/ml、9μg/ml、9.5μg/ml、或10μg/ml。

本公开尤其还描述了制造产物(例如重组多肽)的方法，其中，产物的样品通过由本文所述的样品分析方法来分析式I化合物(例如托洛酮)的存在或水平。

在一些实施方式中，样品是化妆品制剂的样品，例如包括用于化妆品制剂的产品。

在一些实施方式中，样品是局部药物制剂的样品，例如包括用于药物制剂的产品。

在一些实施方式中，样品是防晒剂的样品，例如包括用于防晒剂的产品，如式I的化合物(例如托酚酮)，和/或用于防晒剂的另一产品，例如，另一种UV阻隔剂。

在一些实施方式中，样品是COMT抑制剂的样品，例如，其包括用作COMT抑制剂的产品，如式I的化合物(例如托酚酮)，和/或用作COMT抑制剂的另一产品。在一些实施方式中，样品是包含L-DOPA(例如，左旋多巴或L-3,4-二羟基苯丙氨酸)和/或芳族L-氨基酸脱羧酶抑制剂(例如DOPA脱羧酶抑制剂、DDCI或AAADI)的样品。

本公开尤其进一步描述了包含氟苯基部分(例如五氟苯基丙基基团)和样品的反应混合物，其中，所述样品包含式I的化合物(例如托酚酮)、另一组分和任选的产物。在一个实施方式中，该反应混合物可用于从组分和/或产物中分离式I化合物(例如托酚酮)，并且在其它实施方式中，随后用于检测式I化合物(例如托酚酮)的存在或确定其水平。反应混合物的部分可与基质缔合，例如结合或共价结合到基质，其中，所述基质包括不溶性基质，例如色谱基质、树脂、凝胶或珠粒，例如二氧化硅、琼脂糖、纤维素、右旋糖酐、聚丙烯酰胺、或乳胶基质、树脂、凝胶或珠粒。

定义

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施和/或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。在说明和要求保护本发明的过程中，将依据以下定义使用提供了定义的以下术语。

也应该理解的是，此处使用的术语只是为描述具体实施方式，而不是起限制作用。

本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。举例来说，“一种/个细胞”可以表示一个/一种细胞或超过一种/一个细胞。

如本文所用，“约”和“大约”应通常是指在给定测量的性质或精度的情况下所测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值范围或值的20％内，通常在10％内，更通常在5％内。

如本文所用，术语“半定量”是指通过质谱法对不同化学物质的比较评估，而无需参比各单独物质的特定标准。

如本文所用，术语“内源(的)”指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在其内部天然产生的任何物质。

如本文所用，术语“外源(的)”是指引入生物体、细胞、组织或系统的或在其外部产生的任何物质。因此，“外源核酸”是指被引入生物体、细胞、组织或系统或在其之外产生的核酸。在一个实施方式中，外源核酸的序列不是天然产生的，或不是天然存在于该外源核酸所引入的生物体、细胞、组织或系统之内。在一实施方式中，外源核酸的序列是非天然产生的序列，或编码非天然产生的产物。

如本文所用，术语“异源的”是指来自一种物种的任何物质被引入不同物种的生物体、细胞、组织或系统。

如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可互换使用，指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或DNA或其RNA的组合，以及其单链或双链形式的聚合物。术语“核酸”包括但不限于基因，cDNA或mRNA。在一个实施方式中，核酸分子是合成的(例如化学合成的或人工的)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的类似物或衍生物的分子，所述天然核苷酸的类似物或衍生物具有与参比核酸相似的结合特性并且以与天然或非天然产生的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直系同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代形式(Batzer等，NucleicAcid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键或除肽键以外的方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。在一个实施方式中，蛋白质可包含多于一个，例如，两个，三个，四个，五个或多于五个的多肽，其中每个多肽通过共价或非共价键/相互作用彼此结合。多肽包括包含通过肽键或通过除肽键以外的方式彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语指两条短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，也指长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，包括很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。

如本文所用，“产物”是指由经修饰或工程改造以产生产物的细胞产生(例如表达)的分子、核酸、多肽或其任何杂合体。在一个实施方式中，产物是天然产生的产物或非天然产生的产物，例如合成产物。在一个实施方式中，一部分产物是天然产生的，而另一部分产物是非天然产生的。在一个实施方式中，产物是多肽，例如，重组多肽。在个一实施方式中，产物适合于诊断或临床前用途。在另一个实施方式中，产物适合用于治疗用途，例如用于治疗疾病。在一个实施方式中，产物选自表1、表2、表3或表4。在一个实施方式中，经修饰或经工程改造的细胞包含控制产物表达或编码治疗性多肽的外源核酸。在其它实施方式中，经修饰或经工程改造的细胞包含其它分子，例如非核酸分子，其控制产物在细胞中的表达或构建。

在一个实施方式中，细胞的修饰包括引入外源核酸，该外源核酸包含控制或改变(例如增加)内源核酸序列表达(如内源基因)的核酸序列。在该实施方式中，经修饰的细胞产生由细胞天然或内源表达的内源多肽产物，但是与未修饰的细胞相比(例如，与多肽的内源产生或质量相比)，修饰增加了产物的产生和/或提高了产物的质量。

在另一实施方式中，细胞的修饰包括引入编码本文所述重组多肽的外源核酸。在该实施方式中，经修饰的细胞产生了可以天然产生或非天然产生的重组多肽产物。在该实施方式中，经修饰的细胞产生了也可以由细胞内源表达或非内源表达的重组多肽产物。在重组多肽产物也由细胞内源表达的实施方式中，与未修饰的细胞相比(例如，与多肽的内源产生或质量相比)，修饰增加了产物的产生和/或提高了产物的质量。

如本文所用，“重组多肽”或“重组蛋白”指可由本文所述的细胞产生的多肽。重组多肽是这样的多肽：编码该多肽的序列的至少一个核苷酸或控制该多肽表达的序列的至少一个核苷酸通过遗传工程改造(细胞或前体细胞)形成。例如，至少一个核苷酸被改变，例如，其被引入细胞中，或者它是遗传工程改造的重排的产物。在一个实施方式中，重组多肽的序列与多肽或蛋白质的天然产生同种型没有区别。在一个实施方式中，重组多肽的氨基酸序列与多肽或蛋白质的天然产生同种型序列不同。在一个实施方式中，重组多肽和细胞是相同物种。在一个实施方式中，重组多肽相对于细胞是内源的，换句话说，细胞来自第一物种，并且重组多肽相对于该第一物种是天然的。在一个实施方式中，重组多肽的氨基酸序列与由细胞内源基因组编码的多肽相同或基本相同，或相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施方式中，重组多肽和细胞来自不同的物种，例如，重组多肽是人多肽，细胞是非人(例如啮齿动物，如CHO)细胞或昆虫细胞。在一个实施方式中，重组多肽相对于细胞是外源的，换句话说，细胞来自第一物种，并且重组多肽来自第二物种。在一实施方式中，多肽是合成的多肽。在一实施方式中，多肽源自非天然产生的来源。在一个实施方式中，重组多肽是不同于来自人多肽或蛋白的天然产生同种型的氨基酸序列的人多肽或蛋白。在一个实施方式中，重组多肽在不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基上与人多肽或蛋白的天然产生同种型不同。在一个实施方式中，重组多肽与人多肽的天然产生同种型的不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15％的氨基酸残基。

本文使用的术语“获取”或“获得”是指得到物理实体或值(例如，数值)的过程，该过程通过“直接获取”或“间接获取”物理实体或值实现。“直接获取”意指执行过程(例如，执行合成或分析方法)以获得物理实体或值。“间接获取”是指从另一方或来源(例如，直接获得物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。直接获取物理实体包括：进行包括物理物质(例如原材料)中的物理变化的过程。示例性变化包括：来自两种或更多种原材料的物理实体、使得物质剪切或破碎、分离或纯化物质、使两种或更多种独立实体组合成混合物、进行包括破坏或形成共价或非共价键的化学反应。直接获取某一值包括：进行在样品或另一物质中包括物理变化的过程，例如，进行包括在物质(例如，样品、分析物或试剂(有时在本文中称为“物理分析”))中的物理变化的分析过程，进行分析方法，例如，包括以下一种或多种：从另一物质中分离或纯化一种物质，例如分析物、或其片段或其他衍生物；将分析物或其片段或其他衍生物与另一物质(例如缓冲液、溶剂或反应物)合并；或例如在分析物的第一和第二原子之间通过破坏或形成共价或非共价键来改变分析物或其片段或其他衍生物的结构；或在试剂的第一和第二原子之间通过改变试剂或其片段或其他衍生物的结构(例如通过破坏或形成共价或非共价键)。

如本文所用，“制造/制备方法”和“生产方法”可互换使用，并且是产生包含产物(例如重组多肽或治疗产品)的样品的一系列操作和/或条件中的一个或多个。

如本文使用，MS¹表示质谱。

如本文使用，MS²表示串联质谱。

本文引用的各专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。尽管已经参考特定方面公开了本发明，但是显然，本领域的其它技术人员可在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计出本发明的其它方面和变化形式。所附权利要求旨在解释为包括所有这样的方面和等同变化形式。

样品制备

用于本公开方法的样品可以通过制造和生产产物(例如重组多肽)的方法的许多步骤来产生。在一些实施方式中，样品包含培养上清液、细胞裂解物、产物纯化中间体(例如，从细胞蛋白或其他污染物中部分纯化的产物)、纯化的产物和最终配制的产物(例如，配制用于人体内使用)中的一种或多种。样品中包含的产物或通过制造和生产方法产生的产物可以是本文所述或本领域已知的任何产品。

色谱

适用于本文所述方法的色谱是本领域技术人员已知的，包括：例如，亲和色谱、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、疏水相互作用色谱。在一些实施方式中，色谱方法是HPLC反相色谱。色谱包括：高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、毛细管电泳、离子迁移。还参见例如，抗体的加工规模纯化(Process Scale Purification of Antibodies)，UweGottschalk 2011约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)ISBN:1118210743；抗体卷1：生产和纯化(Antibodies Vol 1Production and Purification)，G.Subramanian 2013，德国斯普林格公司(Springer Science&Business Media)；抗体生产和表征的基本方法(BasicMethods in Antibody Production and Characterization)，Gary C.Howard 2000CRC出版社(CRC Press)。

其他示例性色谱方法包括但不限于：强阴离子交换色谱(SAX)、液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、薄层色谱(TLC)、酰胺柱色谱及它们的组合。

在一些实施方式中，本公开的方法采用包括一种或多种(例如，一种、两种或更多种)流动相和固定相的LC。在一些实施方式中，LC包括使用一种流动相。在一些实施方式中，LC包括使用两种流动相(例如，第一流动相和第二流动相)。在一些实施方式中，流动相(例如，第一和/或第二流动相)包括在水中的甲酸，例如，在水中的约0.01％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％甲酸。在一些实施方式中，流动相(例如，第一和/或第二流动相)包括在乙腈中的甲酸，例如，在乙腈中的约0.01％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％甲酸，例如在乙腈中的0.1％甲酸。在一些实施方式中，“在乙腈中”是指溶液，例如，流动相，其中，溶液的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％(例如，溶剂)是乙腈，例如约100％的溶剂是乙腈。在一些实施方式中，固定相包含部分或完全氟化的烷基或芳基，例如氟苯基，如五氟苯基丙基。在一些实施方式中，固定相包含附着至部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基丙基)的硅胶颗粒。在一些实施方式中，固定相孔径约为 或(例如)。在一些实施方式中，LC包括使用DiscoveryHS F5固定相，例如Discovery HS F5柱。

不希望受理论限制，认为柱树脂的部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基)涂层改变了托酚酮保留在色谱柱上的方式。尽管更传统的反相色谱柱无法充分分离托洛酮与干扰组分，但部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基)树脂涂层被认为能更容易保留疏水基团，并因此更容易洗脱出亲水基团。

质谱法

适用于本文所述方法的质谱方法是本领域技术人员已知的，包括例如：电喷雾电离MS、基质辅助激光解吸/离子化MS(matrix-assisted laser desportion/ionizationMS，MALDI-MS)、飞行时间MS、傅里叶变换离子回旋共振MS、四极飞行时间MS、线性四极、四极离子阱MS、轨道阱、圆柱形离子阱、三维离子阱、四重质量过滤器(quadruple massfilter)、串联质谱、LC-MS、LC-MS/MS、傅里叶变换质谱(FTMS)、离子迁移分离质谱(IMS-MS)、电子转移解离(ETD-MS)及它们的组合。在一些实施方式中，质谱是串联质谱(MS²)。还参见，例如，蛋白质质谱(Protein Mass Spectrometry)，Julian Whitelegge，2008年，Elsevier；使用串联质谱进行蛋白质测序和鉴定(Protein Sequencing andIdentification Using Tandem Mass Spectrometry)，Michael Kinter，2005，约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)；使用质谱表征蛋白质治疗品(Characterization ofProtein Therapeutics using Mass Spectrometry)，Guodong Chen，2014年，德国斯普林格公司。

在一些实施方式中，适用于本文所述方法的质谱包括选择反应监测(SRM)，例如对所选择的前体和产物离子对进行监测，例如跃迁。在一些实施方式中，适用于本文所述方法的质谱包括多重反应监测(MRM)，例如对由一种或多种前体离子衍生的多种产物离子进行监测，例如，多种跃迁。在一些实施方式中，适用于本文所述方法的质谱包括平行反应监测(PRM)，例如在单一分析步骤中对多种转化进行监测，例如，使用高分辨率质谱仪进行。在一些实施方式中，适用于本文所述方法的质谱包括对如表1所述的跃迁进行监测，例如，在表1所述条件下进行。

可用于生物制造的化合物和托酚酮

在一些实施方式中，可以将化合物加入细胞培养基以增强细胞生长。例如，可以使用化合物以促进培养细胞中金属离子的摄取。在一些实施方式中，添加至细胞培养基的化合物是式(I)的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、外消旋体或溶剂合物：

其中：

X是O或S；

R¹是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、OR³、C(O)R⁵、C(O)OR³、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；

各R²独立地是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；或者

两个R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；或者R¹和R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；

R³是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R^4a和R^4b独立地是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R⁵是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

各R⁶独立地是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、卤素、氧代或氰基；和

n为0、1、2、4或5；

在一些实施方式中，X是O。在一些实施方式中，R¹是OR³(例如，OH)。在一些实施方式中，n为0。在一些实施方式中，式(I)的化合物是托酚酮(即，2-羟基-2,4,6-环庚三烯-1-酮)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，X是O。在一些实施方式中，R¹是OR³(例如，OH)。在一些实施方式中，R²是OR³或C(O)OR³(例如，OH或C(O)OH)。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为3，并且R²是OH、OH和C(O)OH。在一些实施方式中，式(I)的化合物是柔毛青霉酸(即，4,5,6-三羟基-3-氧代环庚-1,4,6-三烯-1-羧酸)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，X是O。在一些实施方式中，R¹是氢。在一些实施方式中，R²是OR³或C(O)OR³(例如，OH或C(O)OH)。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为3，2个R²是OH并且1个R²是C(O)OH。在一些实施方式中，式(I)的化合物是密挤青霉酸(stipitaticacid)(即，5,6-二羟基-3-氧代环庚-1,4,6-三烯-1-羧酸)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，X是O。在一些实施方式中，R¹是OR³(例如，OH)。在一些实施方式中，R²是OR³、C(O)R⁵或C(O)OR³(例如，OH或C(O)OH)。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为3，且1个R²为OH。在一些实施方式中，2个R²连接以形成杂环基环(例如，五元杂环基环，例如马来酸酐)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是柄状青霉酸(stipitatonicacid)(即，4,7-二羟基-1H-环庚[c]呋喃-1,3,6-三酮)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，X是O。在一些实施方式中，R¹是OR³(例如，OH)。在一些实施方式中，R²是OR³、C(O)R⁵或C(O)OR³(例如，OH或C(O)OH)。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为4，且2个R²为OH。在一些实施方式中，2个R²连接以形成杂环基环(例如，五元杂环基环，例如琥珀酸酐)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是软毛青霉二酸酐(puberulonicacid)(即，6,7,8-三羟基-1H-环庚[c]呋喃-1,3,5-三酮)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，X是O。在一些实施方式中，R¹是OR³(例如，OH)。在一些实施方式中，R²是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、或OR³(例如，OH)。在一些实施方式中，n为3。在一些实施方式中，n为3，且1个R²为OH。在一些实施方式中，2个R²连接以形成由一个或多个R⁶任选取代的杂环基环(例如，六元杂环基环，例如吡喃环)。在一些实施方式中，R⁶是OR³(例如，OH)或C₁-C₆烷基(例如，CH₃)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是黄瘤孢素(即，3,7,9-三羟基-3-甲基-3,4-二氢环庚[c]吡喃-1-酮)。在一些实施方式中，式(I)的化合物是或其药学上可接受的盐。

在一些实施方式中，式(I)的化合物是美国专利号3,135,768公开的化合物，其全部内容通过引用纳入本文。

所选的化学定义

具体官能团和化学术语的定义在下文进行更详细地描述。根据元素周期表(CAS版本《化学物理手册》(Handbook of Chemistry and Physics)，第75版，内页)来鉴定化学元素，并且具体官能团通常如本文所述定义。另外，有机化学的一般原理，以及特定的官能部分和反应性见述于Thomas Sorrell，《有机化学》(Organic Chemistry)，大学科学书籍(University Science Books)，Sausalit，1999；Smith和March，《March的高级有机化学》(March’s Advanced Organic Chemistry)，第5版，约翰·威利父子公司，纽约，2001年；Larock，《综合有机转型》(Comprehensive Organic Transformations)，VCH出版公司，纽约，1989年；和Carruthers，《有机合成的一些现代方法》(Some Modern Methods ofOrganic Synthesis)，第三版，剑桥大学出版社，剑桥，1987年。

除非另外说明，本文所述的结构也包括结构的所有同分异构(例如，对映体、非对映异构体和几何(或构象))形式；例如，各不对称中心的R和S构象，Z和E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本发明的化合物的单个立体化学异构体以及对映体、非对映异构体和几何(或构象)混合物在本发明的范围内。除非另外说明，本发明的化合物的所有互变异构体形式在本发明的范围内。另外，除非另有说明，否则本文描述的结构也意味着包括这样的化合物：该化合物的不同之处在于一个或多个同位素富集的原子的存在。例如，具有本发明结构的化合物(包括氢被氘或氚取代，或碳被¹³C或¹⁴C富集碳取代)在本公开的范围内。根据本发明，该化合物例如可用作分析工具、用作生物学试验中的探针或用作治疗剂。

在优选特定对映体的情况下，在一些实施方式中可以提供其基本不含相应对映体，并且也可以称为“光学富集(的)(optically enriched)”。本文所用术语“光学富集(的)”是指该化合物由显著较大比例的一种对映体构成。在某些实施方式中，化合物由至少约90重量％的优选对映体组成。在其它实施方式中，化合物由至少约95重量％、98重量％、或99重量％的优选对映体组成。优选的对映体可以通过本领域技术人员已知的任何方法从外消旋混合物中分离，包括手性高压液相色谱法(HPLC)，以及手性盐的形成和结晶或通过手性合成制备。参见，例如，Jacques等人，对映体、外消旋体和拆分(Enantiomers,Racemates and Resolution)(威利仪器公司(Wiley Interscience)，纽约，1981)；Wilen等人，四面体(Tetrahedron)33：2725(1977)；和Eliel,E.L.，E.L.碳化合物的立体化学(Stereochemistry of Carbon Compounds)(麦格劳希尔公司(McGraw-Hill)，纽约，1962年)；Wilen,S.H.，拆分剂和光学分辨率表(Tables of Resolving Agents and OpticalResolutions)，第268页(E.L.Eliel编，圣母大学出版社(Univ.of Notre Dame Pres)，印第安那州，1972年)。

本文所用的术语“烷基”是指单价饱和直链或支链烃，例如，1-12个、1-10个、或1-6个碳原子的直链或支链基团，本文中分别被称为C₁-C₁₂烷基、C₁-C₁₀烷基、和C₁-C₆烷基。烷基的实例包括大不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、仲戊基、异戊基、叔丁基、正戊基、新戊基、正己基、仲己基等。

术语“杂环基”是指单环或稠合、螺稠合和/或桥联的二环和多环体系，其中，至少一个环是饱和或部分不饱和的(但不是芳族的)并且包含杂原子。杂环基可以在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子处附着至其侧基，并且任何环原子可以任选地被取代。代表性的杂环基包括环体系，其中，(i)每个环都是非芳族的且至少一个环包含杂原子，例如，四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、十氢喹啉基、恶唑烷基、哌嗪基、二氧己环基(dioxanyl)、二氧戊环基(dioxolanyl)、二氮杂卓基(diazepinyl)、氧氮杂卓基(oxazepinyl)、硫氮杂卓基(thiazepinyl)、吗啉基和奎宁环基；(ii)至少一个环是非芳族的且包含杂原子，并且至少另一个环是芳族碳环，例如1,2,3,4-四氢喹啉基、1,2,3,4-四氢异喹啉基；(iii)至少一个环是非芳族的且包含杂原子，并且至少一个其他环是芳族的并且包含杂原子，例如3,4-二氢-1H-吡喃并[4,3-c]吡啶和1,2,3,4-四氢-2,6-萘啶。

如本文所述，本发明的化合物可以包含“任选取代(的)”部分。无论是否在术语“任选(地)”之前与否，术语“取代(的)”通常是指指定部分的一个或多个氢被合适的取代基取代。除非另有说明，否则“任选取代的”基团可在该基团的各可取代位置上具有合适的取代基，并且当任何给定结构中的超过一个位置可被选自指定基团的超过一个取代基取代时，在各位置的取代基可以相同或不同。在本发明中设想的取代基组合优选是导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些。本文所用术语“稳定”是指在经受一定条件以允许其产生、检测以及在某些实施方式中其回收、纯化以及用于本文所公开的一种或多种目的时，基本上不会改变的化合物。

本文所用术语“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断的范围内适于与人和低级动物的组织接触且没有过度毒性、刺激、过敏反应等的盐，并且与合理的效益/风险比相称。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1–19,中详细描述了药学上可接受的盐，该文献通过引用纳入本文。本发明化合物的药学上可接受的盐包括原子合适无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的盐的实例是用无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)、或有机酸(如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)、或通过使用本领域中已知的其它方法如离子交换所形成的氨基基团的盐。其它药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双氢萘盐盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。源自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐，铵盐和N⁺(C_1-4烷基)₄ ^-盐。代表性的碱或碱土盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其它药学上可接受的盐包括：无毒的铵盐、季铵盐、以及使用反离子(如卤离子、氢氧根离子、羧酸离子、硫酸根离子、磷酸根离子、硝酸根离子、低级烷基磺酸根离子和芳基磺酸根离子)与胺阳离子所形成的盐。

术语“溶剂合物”是指通常通过溶剂分解反应与溶剂缔合的化合物形式。该物理缔合包括氢键。常规的溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚等。式(I)的化合物可以例如以结晶形式制备或可以溶剂化。合适的溶剂合物包括药学上可接受的溶剂合物，并且还包括化学计量的溶剂合物和非化学计量的溶剂合物。在某些情况下，溶剂合物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物”涵盖溶液相和可分离的溶剂合物。代表性的溶剂合物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。

还应理解，具有相同分子式但其原子的键合性质或顺序或其原子在空间中的排列上不同的化合物被称为“异构体”。其原子在空间中的排列不同的异构体称为“立体异构体”。彼此不是镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”，而彼此是非可重叠镜像的立体异构体被称为“对映体”。例如，当化合物的中心不对称时，其键合到四个不同的基团上，则可能有一对对映体。对映体可以由其不对称中心的绝对构型来表征，并由Cahn和Prelog的R和S测序规则来描述述，或由分子围绕偏振光平面旋转并称为右旋或左旋的方式(即，分别为(+)或(-)异构体)来描述。手性化合物可以单独的对映体或其混合物形式存在。包含等比例对映体的混合物被称为“外消旋混合物”。

生产参数

本文所述方法可以用于对由制造和生产产物(例如重组多肽)的方法所产生样品进行分析。制造和生产的方法可以通过各种生产参数来表征。

如本文所使用的生产参数是生产过程中的参数或元素。可以选择的生产参数包括：例如，用于生产糖蛋白制备的细胞或细胞系、培养基、培养过程或生物反应器变量(例如，分批、分批补料或灌注)、糖蛋白制备的制剂和纯化过程。

主要生产参数包括：1)宿主的类型；2)宿主的遗传学；3)培养基类型、4)发酵平台；5)纯化步骤；6)制剂。如本文所使用的次要生产参数是在各主要生产参数内可调节或可变的生产参数。实例包括：根据所需的多糖性质选择宿主亚克隆；调节组成型或诱导型宿主基因水平；引入新的基因或启动子元件；培养基添加剂(例如表IV的部分列表)；生理化学生长性质；生长容器类型(例如，生物反应器类型，T形瓶)；细胞密度；细胞周期；具有所需多糖类型的产物的富集(例如通过凝集素或抗体介导的富集、离子交换色谱、CE或类似方法)；或类似的次要生产参数是本领域技术人员显而易见的。

培养基

本文所述的制造和生产方法可以包括确定和/或选择与所需一种或多种多糖性质具有正相关的培养基组分和/或培养基组分浓度。可以在糖蛋白生产过程中或在培养基发生变化时，根据培养条件添加或给予培养基组分。培养基组分包括直接添加至培养物中的组分以及作为细胞培养副产物的组分。

培养基组分包括：例如，缓冲剂、氨基酸含量、维生素含量、盐含量、矿物质含量、血清含量、碳源含量、脂质含量、核酸含量、激素含量、微量元素含量、氨含量、辅因子含量、指示物含量、小分子含量、水解产物含量和酶调节剂含量。

下面提供了各培养基组分的实例：

示例性缓冲剂包括：Tris、N-(三(羟基甲基)甲基)甘氨酸(Tricine)、HEPES、MOPS、PIPES、TAPS、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(bicine)、BES、TES、二甲砷酸盐、MES、醋酸盐、MKP、ADA、ACES、甘氨酰胺和乙酰氨基甘氨酸(acetamidoglycine)。培养基可以是无血清的，或可以包括动物来源的产物(例如胎牛血清(FBS)、牛犊血清(FCS)、马血清(HS)、人血清)，动物来源的血清替代品(例如Ultroser G、SF和HY；脱脂奶粉；牛EX-CYTE)、胎球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、血清白蛋白和转铁蛋白。当选择无血清培养基时，可以包含脂质，例如棕榈酸和/或硬脂酸。

脂质组分包括油、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、甘油酯、类固醇、磷脂质、鞘脂类和脂蛋白。可包含在培养基中或从培养基中消除的示例性氨基酸包括：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。可以存在于培养基中或从培养基中消除的维生素的例子包括维生素A(类视黄醇)、维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B3(烟酸)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆素(pyroxidone))、维生素B7(生物素)、维生素B9(叶酸)、维生素B12(氰基钴胺素)、维生素C(抗坏血酸)、维生素D、维生素E和维生素K。

可能存在于培养基中或从培养基中消除的矿物质包括：铋、硼、钙、氯、铬、钴、铜、氟、碘、铁、镁、锰、钼、镍、磷、钾、铷、硒、硅、钠、锶、硫、碲、钛、钨、钒和锌。示例性的盐和矿物质包括：CaCl2(无水)、CuSO4 5H2O、Fe(NO3).9H2O、KCl、KNO3、KH2PO4、MgSO4(无水)、NaCl、NaH2PO4H2O、NaHCO3、Na2SE3(无水)、ZnSO4.7H2O；亚油酸、硫辛酸、D-葡萄糖、次黄嘌呤2Na、酚红、腐胺2HCl、丙酮酸钠、胸苷、丙酮酸、琥珀酸钠、琥珀酸、琥珀酸、六水合硫酸钠、谷胱甘肽(还原的)、对氨基苯甲酸(PABA)、亚油酸甲酯、细菌蛋白胨G(bacto peptone G)、腺苷、胞苷、鸟苷、2'-脱氧腺苷HCl、2'-脱氧胞苷HCl、2'-脱氧鸟苷和尿苷。当所需多糖特征是岩藻糖基化降低时，生产参数可以包括在锰的存在(例如，以约0.1μM至50μM的浓度存在)下培养细胞，例如CHO细胞，如dhfr缺陷型CHO细胞。岩藻糖基化降低也可以例如通过在约350至500mOsm的渗透压下培养细胞(例如CHO细胞，例如dhfr缺陷型CHO细胞)来获得。渗透压可通过将盐添加至培养基或由于生产期间发生蒸发而使盐作为副产物产生的方式来进行调节。

激素包括例如生长抑制素、生长激素释放因子(GRF)、胰岛素、催乳激素、人生长激素(hGH)、生长激素(somatotropin)、雌二醇和孕酮。生长因子包括：例如，骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、骨源性生长因子(BDGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、[来自美国专利号6,838,284B2的生长因子]、氯高铁血红素(hemin)和NAD。可以培养基中可以存在或从培养基中可以消除的表面活性剂的实例包括吐温(Tween)-80和普朗尼克(pluronic)F-68。小分子可包括例如丁酸酯、氨、非天然糖、非天然氨基酸、氯喹和甜菜碱。

生理化学参数

生产参数还可包括生理化学参数。该条件可以包括：温度、pH、渗透压、剪切力或搅拌速率、氧化、喷涌速率(spurge rate)、生长容器、切向流、DO、CO₂、氮气、分批进料、氧化还原、细胞密度和进料策略。可以选择的生理化学参数的例子可以包括例如：pH、渗透压、剪切力或搅拌速率、氧化、喷涌速率、生长容器、切向流、批料溶解的O₂、CO₂、氮气、分批进料、氧化还原、细胞密度、灌注培养、进料策略、温度和培养时间。

其它生产参数是本领域技术人员已知的，参见例如抗体表达和生产(AntibodyExpression and Production)(2011)，Mohamed Al-Rubeai编；施普林格出版社(SpringerPublishing)。

产物和编码其的核酸

本文提供了分析样品的方法，例如通过例如重组多肽的制造和生产方法所产生的样品。制造和生产的方法可以包括：鉴定、选择或制备能够产生产物(例如本文所述的细胞和产物)的细胞或细胞系。本公开内容涵盖的产物包括但不限于：分子、核酸、多肽(例如重组多肽，如抗体、双特异性抗体、多特异性抗体)或其杂合物，其可以由例如在细胞中表达产生。在一些实施方式中，细胞进行工程改造或修饰以产生产物。该修饰包括引入控制或导致产物产生的分子。例如，通过引入编码多肽例(如重组多肽)的外源核酸来修饰细胞，并且在适合于例如多肽(例如重组多肽)的产生(如表达和分泌)的条件下培养细胞。

在一些实施方式中，培养的细胞用于产生蛋白质(例如抗体，例如单克隆抗体)和/或重组蛋白质，用于治疗用途。在一些实施方式中，培养的细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其他有用的生化中间体或代谢产物。例如，在一些实施方式中，可以产生分子量为约4000道尔顿(dalton)至大于约140,000道尔顿的分子。在一些实施方式中，这些分子可以具有一定范围的复杂性，并且可以包括翻译后修饰，其包括糖基化。

在一些实施方式中，所述多肽是：例如，肉毒素(BOTOX)、肉毒杆菌(Myobloc)、肉毒毒素制剂(Neurobloc)、丽舒妥(Dysport)(或其它血清型肉毒杆菌神经毒素)、阿葡糖苷酶α(alglucosidase alpha)、达托霉素(daptomycin)、YH-16、绒毛膜促性腺激素α(choriogonadotropin alpha)、非格司亭(filgrastim)、西曲瑞克(cetrorelix)、白介素-2(interleukin-2)、阿地白介素(aldesleukin)、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素α-n3(interferon alpha-n3)(注射)、干扰素α-nl(interferon alpha-nl)、DL-8234、干扰素(interferon)、桑托里(Suntory)(γ-1a)、干扰素γ(interferon gamma)、胸腺素α1(thymosin alpha 1)、他索纳明(tasonermin)、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽(nesiritide)、阿巴西普(abatacept)、阿来塞普(alefacept)、利比(Rebif)、阿法艾托特明(eptoterminalfa)、特立帕肽(teriparatide)、降血钙素(calcitonin)、依那西普(etanercept)、血红蛋白谷氨酸250(牛)(hemoglobin glutamer 250(bovine))、多确克津α(drotrecogin alpha)、胶原酶(collagenase)、卡培立肽(carperitide)、重组人表皮生长因(recombinant humanepidermal growth factor)、DWP401、达贝泊汀α(darbepoetin alpha)、重组人红细胞生成素ω(epoetin omega)、重组人红细胞生成素β(epoetin beta)、重组人红细胞生成素α(epoetin alpha)、地西卢定(desirudin)、重组水蛭素(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、诺纳革α(nonacog alpha)、霉诺耐(Mononine)、依他凝血素α(eptacogalpha)(激活)、重组因子VIII+VWF(recombinant Factor VIII+VWF)、重组体(Recombinate)、重组因子VIII(recombinant Factor VIII)、因子VIII(重组)、阿法美特(Alphnmate)、奥特革α(octocog alpha)、因子VIII、帕利夫明(palifermin)、英迪激酶(Indikinase)、替奈普酶(tenecteplase)、阿替普酶(alteplase)、派替普酶(pamiteplase)、瑞替普酶(reteplase)、那替普酶(nateplase)、孟替普酶(monteplase)、促卵泡素α(follitropin alpha)、rFSH、hpFSH、米卡芬净(micafungin)、培非格司亭(pegfilgrastim)、来格司亭(lenograstim)、那托芬净(nartograstim)、舍莫瑞林(sermorelin)、胰高血糖素(glucagon)、艾塞那肽(exenatide)、普兰林肽(pramlintide)、阿糖脑苷酶(iniglucerase)、加硫酶(galsulfase)、乐克托品(Leucotropin)、莫革斯汀(molgramostirn)、醋酸曲普瑞林(triptorelin acetate)、组氨瑞林(histrelin)(Hydron)、地洛瑞林(deslorelin)、组氨瑞林(histrelin)、那法瑞林(nafarelin)、亮丙瑞林(leuprolide)(ATRIGEL)、亮丙瑞林(DUROS)、戈舍瑞林(goserelin)、欧托品(Eutropin)、生长激素(somatropin)、美卡舍明(mecasermin)、恩法韦肽(enlfavirtide)、Org-33408、甘精胰岛素(insulin glargine)、谷氨酸胰岛素(insulin glulisine)、胰岛素(吸入)、赖脯胰岛素(insulin lispro)、德特尼胰岛素(insulin deternir)、胰岛素(insulin(RapidMist))、美卡舍明林菲培(mecasermin rinfabate)、阿那白滞素(anakinra)、西莫白介素(celmoleukin)、99mTc-阿普西肽(99mTc-apcitide)、麦乐贝齐(myelopid)、倍泰龙(Betaseron)、醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)、格旁(Gepon)、沙格司亭(sargramostim)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、人白细胞衍生的α干扰素(humanleukocyte-derived alpha interferons)、倍尔来福(Bilive)、胰岛素(重组)、重组人胰岛素(recombinant human insulin)、门冬胰岛素(insulin aspart)、美卡色宁(mecasenin)、罗扰素-A(Roferon-A)、干扰素-α2(interferon-alpha 2)、苜蓿酮(Alfaferone)、复合α干扰素-1(interferon alfacon-1)、干扰素α(interferon alpha)、阿温耐克斯重组人黄体生成素(Avonex'recombinant human luteinizing hormone)、链道酶α(dornase alpha)、曲弗明(trafermin)、齐考诺肽(ziconotide)、他替瑞林(taltirelin)、阿法地博特明(diboterminalfa)、阿托西班(atosiban)、贝卡普勒明(becaplermin)、依替巴肽(eptifibatide)、扎马拉(Zemaira)、CTC-111、夏伐克(Shanvac)-B、奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanreotide)、安克斯丁(ancestirn)、半乳糖苷酶β(agalsidase beta)、半乳糖苷酶α(agalsidase alpha)、拉罗尼酶(laronidase)、醋肽铜(prezatide copper acetate)、拉布立酶(rasburicase)、兰尼单抗(ranibizumab)、阿提姆尼(Actimmune)、PEG-内含子(PEG-Intron)、确可宁(Tricomin)、重组人甲状旁腺激素(recombinant humanparathyroid hormone)(PTH)1-84、重组人红细胞生成素δ(epoetin delta)、，转基因抗凝血酶III(transgenic antithrombin III)、格兰迪托品(Granditropin)、透明质酸酶(Vitrase)、重组胰岛素(recombinant insulin)、干扰素-α(interferon-alpha)、GEM-21S、伐普肽(vapreotide)、艾度硫酸酯酶(idursulfase)、奥纳帕确特(omnapatrilat)、重组血清白蛋白(recombinant serum albumin)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、羧肽酶(glucarpidase)、人重组C1酯酶抑制剂(human recombinant C1 esterase inhibitor)、拉诺普酶(lanoteplase)、重组人生长激素(recombinant human growth hormone)、恩夫韦肽(enfuvirtide)、VGV-1、干扰素(α)(interferon(alpha))、卢辛坦特(lucinactant)、艾帕它迪(aviptadil)、艾替班特(icatibant)、艾卡拉肽(ecallantide)、，欧米甘安(omiganan)、奥革比(Aurograb)、醋酸培西加南(pexigananacetate)、ADI-PEG-20、LDI-200、地加瑞克(degarelix)、白介假单胞菌外毒素(cintredelinbesudotox)、Favld、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽(liraglutide)、特立帕肽(teriparatide)、替法可近(tifacogin)、AA4500、T4N5脂质体乳液(T4N5 liposome lotion)、卡妥索单抗(catumaxomab)、DWP413、ART-123、魁萨琳(Chrysalin)、去氨普酶(desmoteplase)、安地普酶(amediplase)、绒促卵泡素α(corifollitropin alpha)、TH-9507、替度鲁肽(teduglutide)、戴麦德(Diamyd)、DWP-412、生长激素、重组G-CSF、胰岛素(insulin)、胰岛素(Technosphere)、胰岛素(AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素β(interferon beta)、干扰素α-n3(interferon alpha-n3)、贝拉西普(belatacept)、透皮胰岛素贴片(transdermal insulin patches)、AMG-531、MBP-8298、Xerecept、奥培巴康(opebacan)、AIDSVAX、GV-1001、林福斯堪(LymphoScan)、豹蛙酶(ranpirnase)、利普散(Lipoxysan)、鲁丝普利肽(lusupultide)、MP52、西普勒塞尔-T(sipuleucel-T)、CTP-37)、英色吉(Insegia)、维特斯朋(vitespen)、人凝血酶(humanthrombin)、凝血酶(thrombin)、TransMID、蛇毒纤溶酶(alfimeprase)、普瑞凯希(Puricase)、特利加压素(terlipressin)、EUR-1008M、重组FGF-I、BDM-E、罗替加肽(rotigaptide)、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(duramycin)、SCV-07、OPI-45、内皮它丁(Endostatin)、血管抑素(Angiostatin)、ABT-510、包曼比瑞克抑制剂(Bowman BirkInhibitor)、XMP-629、99mTc-Hynic-膜联蛋白V、卡海拉利肽F(kahalalide F)、CTCE-9908、替维瑞克(teverelix)、奥扎瑞克(ozarelix)、罗咪酯肽(rornidepsin)、BAY-504798、白介素4(interleukin4)、PRX-321、肽扫描(Pepscan)、依波介素(iboctadekin)、rh乳铁蛋白(rhlactoferrin)、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽(cilengitide)、白蛋白干扰素(Albuferon)、比费西克斯(Biphasix)、IRX-2、ω干扰素(omega interferon)、PCK-3145、CAP-232、帕瑞肽(pasireotide)、huN901-DMI、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、MART-1、gp100、络氨酸酶(tyrosinase)、奈米非肽(nemifitide)、rAAT、CGRP、培那西普(pegsunercept)、胸腺素β4(thymosinbeta4)、普厉肽平辛(plitidepsin)、GTP-200、雷莫拉宁(ramoplanin)、GRASPA、OBI-1、AC-100、鲑鱼降钙素(salmon calcitonin)埃利根(eligen)、艾沙瑞林(examorelin)、卡莫瑞林(capromorelin)、卡得瓦(Cardeva)、韦拉繁明(velafermin)、131I-TM-601、KK-220、T-10、乌拉立肽(ularitide)、地来司他(depelestat)、海明肽(hematide)、克瑞沙林(Chrysalin)、rNAPc2、重组因子V111(PEG化脂质体))、bFGF、PEG化的重组葡萄球菌激酶变体(PEGylated recombinant staphylokinasevariant)、V-10153、超声波降解尿激酶原(SonoLysis Prolyse)、NeuroVax、CZEN-002、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、艾塞那肽(exenatide)控释(Medisorb)、AVE-0010、GA-GCB、阿伏瑞林(avorelin)、ACM-9604、利那洛肽醋酸酯(linaclotid eacetate)、CETi-1、赫莫斯盘(Hemospan)、VAL、速效胰岛素(注射用)(Viadel)、鼻内胰岛素(埃利根)、重组甲硫氨酰人瘦素(recombinant methionyl human leptin)、皮创克纳(pitrakinra)、多白介素(Multikine)、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10、塔拉特弗利(talactoferrin)、rEV-131、rEV-131、重组人胰岛素(recombinant human insulin)、RPI-78M、奥普瑞白介素(oprelvekin)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、伐拉司特(valategrast)、干扰素α-n3(interferon alpha-n3)、IRX-3、RDP-58、塔弗隆(Tauferon)、胆盐刺激脂肪酶(bile salt stimulated lipase)、美瑞帕酶(Merispase)、丙氨酸磷酸酶(alalinephosphatase)、EP-2104R、美拉诺坦-II(Melanotan-II)、布美诺肽(bremelanotide)、ATL-104、重组人微纤溶酶(recombinant human microplasmin)、AX-200、SEMAX、ACV-1、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽A(dynorphin A)、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、ALTU-135、重组神经氨酸酶(recombinant neuraminidase)、Vacc-5q、Vacc-4x、Tat类毒素(TatToxoid)、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)(Novasome))、奥斯塔柏林-C(Ostabolin-C)、PTH类似物((PTH analog)、MBRI-93.02、MTB72F、MVA-Ag85A、FARA04、BA-210、重组瘟疫FIV(recombinant plague FIV)、AG-702、OxSODrol、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7、PR1肽抗原(PR1 peptide antigen)、突变ras疫苗(mutant ras vaccine)、HPV-16E7脂肽疫苗(HPV-16E7 lipopeptide vaccine)、拉比新(labyrinthin)、WT1-肽、IDD-5、CDX-110、朋曲斯(Pentrys)、诺雷林(Norelin)、CytoFab、P-9808、VT-111、艾罗卡肽(icrocaptide)、替柏明(telbermin)、芦平曲韦(rupintrivir)、瑞替克鲁(reticulose)、rGRF、HA、α-半乳糖苷酶A(alpha-galactosidase A)、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张素(angiotensin)、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07、DRF-7295、ABT-828、ErbB2-特异性免疫毒素(ErbB2-specific immunotoxin)、DT3SSIL-3、TST-10088、PRO-1762、Combotox、缩胆囊素-B/胃泌素受体结合肽(cholecystokinin-B/gastrin-receptor binding peptides)、111In-hEGF、AE-37、曲妥珠单抗(trasnizumab)-DM1、拮抗剂G(Antagonist G)、IL-12、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647、L-19基ra(L-19based ra)、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/1540/KLH、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-1(多肽)、NA17.A2(多肽)、(CBP-501)、重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin)、FX-06、AP-214、WAP-8294A、ACP-HIP、SUN-11031、多肽YY[3-36]、FGLL、阿塞西普(atacicept)、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34、F-18-CCR1、AT-1100、JPD-003、PTH(7-34)(Novasome)、耐久霉素(duramycin)、CAB-2、CTCE-0214、糖PEG化促红细胞生成素(GlycoPEGylated erythropoietin)、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、氨基康定(aminocandin)、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(teverelix)、EP-51216、hGH、OGP-I、西夫韦肽(sifuvirtide)、TV4710、ALG-889、Org-41259、rhCC10、F-991、胸腺五肽(thymopentin)、r(m)CRP、肝选择性胰岛素(hepatoselective insulin)、苏靶林(subalin)、L19-IL-2融合蛋白(L19-IL-2fusion protein)、弹力素((elafin)、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、血小板生成素受体激动剂(thrombopoietin receptor agonist)、AL-108、AL-208、神经生长因子拮抗剂(nerve growth factor antagonists)、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、特立帕肽(teriparatide)(埃利根)、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合物(LFn-p24fusion)、EP-1043、gpE1、gpE2、MF-59、hPTH(1-34)、768974、SYN-101、PGN-0052、阿维库明(aviscumnine)、BIM-23190、多表位酪氨酸酶肽(multi-epitope tyrosinase peptide)、恩卡斯替母(enkastim)、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管靶向TNF(vascular-targeted TNF)、去氨加压素(desmopressin)、奥那西普(onercept)、和TP-9201。

在一些实施方式中，多肽是阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA)、英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE^TM)、利妥昔单抗(rituximab)(RITUXAN^TM/MAB THERA^TM)、依那西普(etanercept)(ENBREL^TM)、贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN^TM)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN^TM)、派革利革斯丁(pegrilgrastim)(NEULASTA^TM)、或任何其它合适的多肽，包括生物类似物(biosimilar)和生物改良品(biobetter)。

其他合适的多肽在如下表中以及US2016/0097074的表1中列出：

表1

在一些实施方式中，多肽是激素、凝血因子/血液凝结因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白疫苗、或肽，如表2所示。

表2：示例性产品

在一些实施方式中，该蛋白是多特异性蛋白，例如表3中所示的双特异性抗体。

表3：双特异性形式

表4

表4

表4

表4

表4

表4

在一些实施方式中，该多肽是由癌细胞表达的抗原。在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方式中，重组或治疗性多肽选自：HER2、CD20、9-O-乙酰基-GD3、βhCG、A33抗原、CA19-9标记物、CA-125标记物、钙网蛋白、碳酸酐酶IX(MN/CAIX)、CCR5、CCR8、CD19、CD22、CD25、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD63、CD70、CC123、CD138、癌胚抗原(CEA；CD66e)、桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、内皮唾液酸蛋白、肝配蛋白A2(ephrin A2)(EphA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、ErbB2、胎儿乙酰胆碱受体、成纤维细胞活化抗原(FAP)、岩藻糖基(fucosyl)GM1、GD2、GD3、GM2、神经节苷脂GD3、Globo H、糖蛋白100、HER2/neu、HER3、HER4、胰岛素样生长因子受体1、Lewis-Y、LG、Ly-6、黑色素瘤特异性软骨素硫酸盐蛋白聚糖(melanoma-specificchondroitin-sulfate proteoglycan，MCSCP)、间皮素、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、

MUC5_AC、MUC5_B、MUC7、MUC16、II型穆勒抑制物(MIS)受体(Mullerian inhibitorysubstance(MIS)receptor type II)、浆细胞抗原、poly SA、PSCA、PSMA、音猬因子(sonichedgehog)(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原、TNF-α前体及其组合。

在一些实施方式中，该多肽是激活受体，并且选自：2B4(CD244)、α₄β₁整联蛋白、β₂整联蛋白、CD2、CD16、CD27、CD38、CD96、CD100、CD160、CD137、CEACAM1(CD66)、CRTAM、CS1(CD319)、DNAM-1(CD226)、GITR(TNFRSF18)、激活形式的KIR、NKG2C、NKG2D、NKG2E、一种或多种天然细胞毒性受体、NTB-A、PEN-5及其组合，任选地其中，β₂整联蛋白包括CD11a-CD 18、CD11b-CD 18或CD11c-CD 18，任选地其中，激活形式的KIR包括KIR2DS1、KIR2DS4或KIR-S，并且任选地其中，天然细胞毒性受体包括NKp30、NKp44、NKp46或NKp80。

在一些实施方式中，该多肽是抑制受体，并且选自：KIR、ILT2/LIR-l/CD85j、抑制形式的KIR、KLRG1、LAIR-1、NKG2A、NKR-P1A、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9、及其组合，任选地其中，抑制形式的KIR包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2或KIR-L。

在一些实施方式中，该多肽是激活受体，并且选自：CD3、CD2(LFA2、OX34)、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、CD137(4-1BB)、CD226、CD229(Ly9、SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC、BLAME)、CD352(Lyl08、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、NKG2D、SLAM(CD150、SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ、TIM1(HAVCR、KIM1)及其组合。

在一些实施方式中，该多肽是抑制受体，并且选自：PD-1(CD279)、2B4(CD244、SLAMF4)、B71(CD80)、B7H1(CD274、PD-L1)、BTLA(CD272)、CD160(BY55、NK28)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CD358(DR6)、CTLA-4(CD152)、LAG3、LAIR1、PD-1H(VISTA)、TIGIT(VSIG9、VSTM3)、TIM2(TIMD2)、TIM3(HAVCR2、KIM3)、及其组合。

其它示例性蛋白质包括但不限于：Leader等人“蛋白质治疗剂：概述和药理学分类”(Protein therapeutics:a summary and pharmacological classification)，NatureReviews Drug Discovery，2008，7：21-39(通过引用纳入本文)的表1-10中描述的任何蛋白质；或者本文所述重组多肽的任何偶联物、变体、类似物或功能性片段。

其他重组蛋白产品包括非抗体支架或替代性蛋白支架，例如但不限于：DARPin、亲和体和模拟抗体蛋白(adnectins)。可以将该非抗体支架或替代性蛋白支架进行工程化以鉴定一种或两种或更多种(例如1、2、3、4或5种或更多种)不同的靶或抗原或与之结合。

本文还提供了核酸，例如编码产物(例如多肽，例如本文所述的重组多肽)的外源核酸。可以使用本领域已知的重组方法来获得编码所需重组多肽的核酸序列，例如，通过从表达所需核酸序列的细胞中筛选库，例如，基因，通过使用标准技术，通过从已知包含相同序列的载体中获得核酸序列，或直接从包含其的细胞和组织中分离出来。或者，可以合成产生编码重组多肽的核酸，而不是克隆。重组DNA技术和工艺在本领域中是非常先进且成熟的。因此，熟悉本文所述重组多肽氨基酸序列的普通技术人员可以容易地设想或产生编码重组多肽的核酸序列。

在一些实施方式中，外源核酸控制宿主细胞内源表达的产物的表达。在该实施方式中，外源核酸包含一个或多个增加内源产物表达的核酸序列(在本文中也称为“内源产物转录激活序列”)。例如，增加内源产物表达的核酸序列包含组成型激活启动子或较强的启动子，例如，在所需位点增加转录，例如增加所需内源基因产物的表达。在引入包含内源产物转录激活序列的外源核酸之后，所述外源核酸被整合到细胞的染色体基因组中，例如，在编码内源性产物的基因组序列附近的预先选择的位置处，使得内源产物转录激活序列增加所需内源性产物的转录激活或表达。修饰细胞的其他方法，例如引入外源核酸以增加内源性产物的表达见述于例如美国专利第号5,272,071；由此通过引用全文纳入本文。

通常通过将编码重组多肽或其部分的核酸操作性地连接至启动子，并将构建体纳入表达载体中，来实现本文所述产物的表达。载体可适合于复制和整合真核细胞或原核细胞。典型的克隆载体包含其他调控元件，例如转录和翻译终止子、起始序列和可用于调控所需核酸序列表达的启动子。

可以将本文描述核酸序列克隆到多种类型的载体中，所述核酸序列编码产物(例如重组多肽)或包含可以控制内源产物表达的核酸序列。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于：质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括：表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。在一些实施方式中，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且见述于例如Sambrook等人，2012，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第1-4卷，纽约冷泉港出版社；以及其他病毒学和分子生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含：在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择性标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。源自病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为其允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。

载体还可以包括：例如，促进分泌的信号序列，聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)，允许原核生物复制和游离基因复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域中其它已知的那些)和/或允许选择的元件，例如选择标记物或报道基因。

在一实施方式中，包含编码多肽(例如重组多肽)的核酸序列的载体还包含：负责募集聚合酶的启动子序列，以使得能够进行转录起始以表达多肽，例如重组多肽。在一实施方式中，适用于本文所述方法的启动子序列通常与增强子相关，以驱动大量转录并因此递送靶外源mRNA的大量复制。在一实施方式中，该启动子包括巨细胞病毒(CMV)主要即刻早期启动子(major immediate early promoter)(Xia，Bringmann等人，2006)和SV40启动子(Chernajovsky，Mory等人，1984)，两者均源自同名病毒或由其衍生的启动子。在包含于表达载体(包括劳斯肉瘤病毒长末端重复物(Rous Sarcoma virus long terminal repeat，RSV-LTR)和莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukaemia virus，MoMLV)LTR)中后，其他几种较不常见的病毒启动子已成功用于驱动转录(Papadakis，Nicklin等人，2004)。在另一实施方式中，特异性内源哺乳动物启动子可以用于驱动感兴趣基因的组成转录(Pontiller，Gross等人，2008)。CHO特异性中华仓鼠延伸因子1-α(CHEF1α)启动子为基于病毒的序列提供了高产量的替代选择(Deer，Allison 2004)。除启动子外，本文所述的载体还包含如上所述的增强子区域；靠近核心启动子的特定核苷酸基序区域，其可以募集转录因子以上调转录速率(Riethoven 2010)。与启动子序列相似，这些区域通常由病毒衍生，并包含在启动子序列中，例如hCMV和SV40增强子序列，或者可以另外包含在例如腺病毒衍生序列中(Gaillet，Gilbert等，2007)。

在一实施方式中，载体包含编码本文所述的产物(例如多肽，例如重组多肽)的核酸序列，该载体还包含编码选择标记物的核酸序列。在一实施方式中，选择标记物包括谷氨酰胺合成酶(GS)；和二氢叶酸还原酶(DHFR)，例如赋予甲氨蝶呤(MTX)抗性的酶；或抗生素标记物，例如赋予抗生素抗性的酶，例如潮霉素、新霉素(G418)、博来霉素、嘌呤霉素或杀稻瘟素。在另一个实施方式中，选择标记物包含Selexis选择系统(例如，从Selexis SA公司可购得的SUREtechnology Platform^TM和Selexis Genetic Elements^TM)或Catalant选择系统或与之兼容。

在一实施方式中，包含编码本文所述重组产物的核酸序列的载体包含选择标记物，所述选择标记物可用于鉴定包含编码本文所述重组产物的核酸的一种或多种细胞。在一实施方式中，如本文所述，选择标记物可用于鉴定一种或多种细胞，所述一种或多种细胞包括将编码重组产物的核酸序列整合到基因组中。已经整合了编码重组蛋白的核酸序列的一种或多种细胞的鉴定可用于选择和工程化稳定表达该产物的细胞或细胞系。

使用的合适载体是可购得的，包括与隆萨生物制剂公司(Lonza Biologics,Inc,)可购得的GS Expression System^TM、GS Xceed^TM基因表达系统或CHOK1SV技术相关的载体，例如，见述于如Fan等人，Pharm.Bioprocess(2013)；1(5):487-502的载体，所述文献通过引用全文纳入本文。GS表达载体包含GS基因或其功能片段(例如GS微型基因)，以及一个或多个(例如1、2或3个或更多个)高效转录盒，用于表达感兴趣的基因，例如编码本文所述的重组多肽的核酸。GS微型基因包含基因组CHO GS基因的内含子6，例如由其组成。在一个实施方式中，GS载体包含与SV40L启动子操作性连接的GS基因和一个或两个polyA信号。在另一实施方式中，GS载体包含与SV40L启动子操作性连接的GS基因、SV40剪接和聚腺苷酸化信号。在该实施方式中，例如用于表达本文描述的感兴趣基因或重组多肽的转录盒包括：hCMV-MIE启动子和来自hCMV-MIE基因的5'非翻译序列，包括第一内含子。可以基于GS表达载体来构建其他载体，例如，其中，其他选择标记物代替本文所述表达载体中的GS基因。

适用于本文所述方法的载体包括但不限于其他市售载体，例如pcDNA3.1/Zeo，pcDNA3.1/CAT，pcDNA3.3TOPO(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，之前是英杰公司(Invitrogen))；pTarget，HaloTag(Promega公司)；pUC57(GenScript公司)；pFLAG-CMV(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；pCMV6(Origene公司)；pEE12或pEE14(隆萨生物制剂公司)，或pBK-CMV/pCMV-3Tag-7/pCMV-Tag2B(Stratagene公司)。

细胞和细胞培养

在一个实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞是除哺乳动物细胞之外的细胞。在一个实施方式中，所述细胞是小鼠、大鼠、中华仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿、狗、马、雪貂或猫。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，例如，人细胞或啮齿动物细胞，例如仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞来自鸭、鹦鹉、鱼、昆虫、植物、真菌或酵母。在一个实施方式中，细胞是古细菌(Archaebacteria)。在一个实施方式中，所述细胞是放线菌种，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

在一个实施方式中，该细胞是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方式中，所述细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS细胞、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN细胞、或CHO-衍生细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞(隆萨生物制剂公司)。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1SV(隆萨生物制剂公司)。

在另一实施方式中，所述细胞是HeIa，HEK293，HT1080，H9，HepG2，MCF7，Jurkat，NIH3T3，PC12，PER.C6，BHK(幼仓鼠肾细胞)，VERO，SP2/0，NS0，YB2/0，Y0，EB66，C127，L细胞，COS，例如，COS1和COS7，QC1-3，CHOK1，CHOK1SV，Potelligent CHOK1SV，CHO GS敲除，CHOK1SV GS-KO，CHOS，CHO DG44，CHO DXB11和CHOZN，或源自其的任意细胞。在一个实施方式中，所述细胞是干细胞。在一个实施方式中，所述细胞是本文所述的任何细胞的分化形式。在一个实施方式中，所述细胞是源自培养的任何原代细胞的细胞。

在一实施方式中，所述细胞是本文所述的任何细胞，其包含编码重组多肽的外源核酸，例如表达重组多肽，例如选自表1或表2的重组多肽。

大规模生产

本文描述的方法可用于分析样品，例如，由制造和生产的装置、设施和方法产生的样品。本文所述的制造和生产的装置、设施以及方法适合于培养任何所需的细胞系，包括原核和/或真核细胞系。此外，在一些实施方式中，制造和生产的装置、设施以及方法适用于培养悬浮细胞或锚定依赖性(贴壁)细胞，并且适用于构造用于生产药物和生物制药产品(例如多肽产品，核酸产物(例如DNA或RNA)，或细胞和/或病毒，例如用于细胞和/或病毒治疗的那些)的生产操作。

在一些实施方式中，细胞表达或产生产物，例如重组治疗或诊断产物。细胞产生产物的实例包括但不限于：抗体分子(例如，单克隆抗体，双特异性抗体)，抗体模拟物(与抗原特异性结合但与抗体在结构上不相关的多肽分子，例如DARPins、亲和体、模拟抗体蛋白或IgNAR)，融合蛋白(例如Fc融合蛋白，嵌合细胞因子(chimeric cytokine))，其他重组蛋白(例如糖基化蛋白，酶，激素)，病毒治疗剂(例如抗癌溶瘤病毒，用于基因治疗的病毒载体和病毒免疫疗法)，细胞治疗剂(例如多能干细胞，间充质干细胞和成体干细胞)，疫苗或脂质包裹的颗粒(例如外泌体，病毒样颗粒)，RNA(例如siRNA)或DNA(例如质粒DNA)，抗生素或氨基酸。在一些实施方式中，所述装置、设施和方法可用于生产生物仿制药。

如上所述，在一些实施方式中，本文所述的方法可用于分析样品，例如，由制造和生产的装置、设施和方法产生的样品。制造和生产的装置、设施和方法允许生产真核细胞，例如哺乳动物细胞，或低等真核细胞(lower eukaryotic cell)，例如酵母细胞或丝状真菌细胞，或原核细胞，例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞，和/或由真核细胞大规模合成的真核或原核细胞的产物，例如蛋白质，肽，抗生素，氨基酸，核酸(例如DNA或RNA)。除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包括任何所需体积或生产产量，包括但不限于实验室规模产量，半工业规模产量和完整生产规模产量。

在一些实施方式中，制造和生产的装置、设施和方法允许以大规模生产细胞和细胞的产物，特别是通过细胞(例如哺乳动物细胞)合成的蛋白、肽(如上文详细讨论的)、抗体或氨基酸。

各种各样的烧瓶、瓶子、反应器和控制器允许生产和扩大细胞培养系统。可以至少部分地基于其与一种或多种所需聚糖性质的相关性来选择系统。细胞可以例如分批、分批进料，灌注或连续培养的方式生长。可以选择的生产参数包括：例如，培养基的添加或去除，包括何时(培养时间期间的早、中或晚)以及培养基的收获频率；增加或降低细胞培养物搅拌的速度；升高或降低培养细胞的温度；添加或去除培养基以调节培养密度；选择开始或停止细胞培养的时间；以及选择改变细胞培养参数的时间。可以为分批、分批进料，灌注或连续培养条件中的任意选择参数。

在一些实施方式中，用于大规模生产的培养细胞是真核细胞，例如动物细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是例如人细胞系、小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系或杂交瘤细胞系。优选哺乳动物细胞是CHO细胞系。

在一些实施方式中，用于大规模生产培养的细胞用于产生上文详细讨论的抗体(例如单克隆抗体)和/或重组蛋白，用于治疗用途。在一些实施方式中，细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其他有用的生化中间体或代谢产物。

在一些实施方式中，用于大规模生产的细胞是的真核细胞，生化标记物，感兴趣的重组肽或核苷酸序列，蛋白，酵母，昆虫细胞，稳定的或病毒感染的禽细胞或哺乳动物细胞，例如CHO细胞，猴细胞，用于医疗、研究或商业目的的裂解产物等。

在一些实施方案中，用于大规模生产的细胞是原核细胞，革兰氏阳性细胞株，例如芽孢杆菌和链霉菌。在一些实施方案中，宿主细胞是厚壁菌门(phylum Firmicutes)，例如，宿主细胞是芽孢杆菌。可以使用的芽孢杆菌是例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，解淀粉芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌等。在一些实施方式中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌可从如下获得：例如芽孢杆菌遗传储备中心，生物科学556，西12街484号，哥伦布OH43210-1214。

在一些实施方案中，用于大规模生产的原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌属(Salmonella spp.)或大肠杆菌(E.coli)，例如可购得的菌株TG1、W3110、DH1、XL1-Blue和Origami。。

合适的宿主细胞是可购得的，例如购自培养物保藏中心如DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH，布伦瑞克，德国)。

在一实施方式中，细胞培养按分批培养，分批进料培养，灌注培养或连续培养进行。在一个实施方式中，所述细胞培养是悬浮培养。在一个实施方式中，将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如置于模型生物体或人对象中。

在一个实施方式中，培养基不含血清。不含血清和不含蛋白质的培养基是可购得的，例如，隆萨生物制剂公司。

哺乳动物细胞系的合适培养基和培养方法是本领域熟知的，如美国专利号5,816,038所述。例如，用于实验室烧瓶或低密度细胞培养且满足特定细胞类型需求的标准细胞培养基的实例为：洛斯维·帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培养基(Morre,G.，美国医学会杂志(Journal of the American Medical Association)，199，第519页，1967年)，L-15培养基(Leibovitz,A.等人，Amer.J.of Hygiene，78,1p.173ff,1963)，杜贝克改良的Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)，伊戈尔最低限度必需培养基(Eagle's minimal essential medium，MEM)，汉姆的F12培养基(Ham's F12 medium)(Ham，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sc.53,p288 ff.1965)或Iscoves修饰的缺少白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的DMEM(Iscoves等人，J.Exp.med.1,p.923ff.,1978)。例如，汉姆的F10或F12培养基是专门为CHO细胞培养而设计的。在EP-481791中描述了其他特别适合CHO细胞培养的培养基。已知该培养基可以补充胎牛血清(FBS，也称为胎牛血清FCS)，后者提供了大量激素和生长因子的天然来源。如今，哺乳动物细胞的细胞培养是科学教科书和手册中详细描述的例行操作，例如，其详细包括：例如，R.IanFresney，《动物细胞的培养》(Culture of Animal cells)，手册，第4版，Wiley-Liss/N.Y.，2000年。

其他合适的培养方法是技术人员已知的，并且可能取决于重组多肽产物和所利用的宿主细胞。确定或优化适于表达和产生细胞表达的重组多肽的条件在普通技术人员的技术范围内。

在一个方面中，用于大规模生产的细胞或细胞系包含编码产物(例如重组多肽)的外源核酸。在一个实施方式中，细胞或细胞系表达产物，例如治疗或诊断产物。用于对细胞进行遗传修饰或基因工程以表达所需多肽或蛋白质的方法是本领域众所周知的，包括例如转染、转导(例如病毒转导)或电穿孔。

用于将核酸(例如本文所述的外源核酸或载体)引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人，2012，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第1-4卷，纽约冷泉港出版社。

用于将核酸(例如本文所述的外源核酸或载体)引入宿主细胞的的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠粒和脂质基系统，包括水包油乳液，胶束，混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载剂的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。现有技术的核酸靶向递送的其他方法是可用的，例如用靶向纳米颗粒的多核苷酸递送或其他合适的亚微米大小的递送系统。

在一些实施方式中，需要将外源核酸整合到宿主细胞的核酸中，例如宿主细胞的基因组或染色体核酸。用于确定是否已经将外源核酸整合到宿主细胞的基因组中的方法可以包括GS/MSX选择方法。GS/MSX选择方法使用通过重组GS基因对谷氨酰胺营养缺陷体的互补，以从细胞中选择蛋白的高水平表达。简而言之，GS/MSX选择方法包括在载体上包含编码谷氨酰胺合成酶的核酸，所述载体包含编码重组多肽产物的外源核酸。甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的给予选择了编码重组多肽和GS的外源核酸已稳定整合到基因组中的细胞。由于GS可以由某些宿主细胞例如CHO细胞内源表达，因此可以优化用MSX选择的浓度和持续时间，以鉴定出高产量的细胞，其中编码重组多肽产物的外源核酸稳定整合到宿主基因组中。GS选择及其系统在以下文献中进行进一步描述：Fan等人，Pharm.Bioprocess.(2013)；1(5):487-502，所述文献通过引用全文纳入本文。

用于鉴定和选择外源核酸已稳定整合到宿主细胞基因组中的细胞的其他方法可包括但不限于：在外源核酸上包含报告基因并评估细胞中报告基因的存在，以及进行外源核酸的PCR分析和检测。

在一个实施方式中，与仅使用用于稳定表达的选择方法选择的细胞(例如整合编码重组多肽的外源核酸)相比，使用本文所述方法选择、鉴定或产生的细胞能够产生更高产量的蛋白产物。在一个实施方式中，与未与蛋白质降解抑制剂接触的细胞或仅选择用于稳定表达的细胞(例如整合编码重组多肽的外源核酸)相比，使用本文所述方法选择、鉴定或产生的细胞产生2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍或10倍或更多的产物，例如重组多肽。

细胞系和重组多肽生产方法

回收和纯化产物(例如重组多肽)的方法在本领域中是成熟的。为了回收重组多肽产物，使用物理、或化学、或物理化学方法。物理或化学或物理化学方法可以是过滤方法、离心方法、超速离心方法、提取方法、冻干方法、沉淀方法、结晶方法、色谱方法或其两种或更多种方法的组合。在一个实施方式中，色谱方法包括尺寸排阻色谱(或凝胶过滤)，离子交换色谱，例如阴离子或阳离子交换色谱，亲和色谱，疏水相互作用色谱和/或多峰色谱中的一种或多种。

本文所述的方法适合于对通过培养任何所需细胞(包括原核细胞和/或真核细胞)的生产和制备方法所产生的样品进行分析。制造和生产的方法可以在例如反应器(例如生物反应器)中进行。此外，在一些实施方式中，样品和产物可以使用适用于培养悬浮细胞或锚定依赖性(贴壁)细胞的制造和生产的装置、设施以及方法来生产，并且适合于构造用于生产分子产物(例如多肽产物)或细胞和/或病毒的生产操作，如用于细胞和/或病毒治疗的那些。

在一些实施方式中，细胞表达或产生产物，例如重组治疗或诊断产物。如下文更详细描述，细胞产生的产物的实例包括但不限于：抗体分子(例如，单克隆抗体，双特异性抗体)、融合蛋白(例如，Fc融合蛋白，嵌合细胞因子)、其他重组蛋白(例如糖基化蛋白，酶，激素)或脂质包裹的颗粒(例如外泌体，病毒样颗粒)。在一些实施方式中，所述装置、设施和方法可用于生产生物仿制药。

在一些实施方式中，装置、设施和生产方法允许以大规模生产真核细胞(例如哺乳动物细胞)和/或真核细胞的产物，例如，通过真核细胞合成的蛋白、肽、抗体或氨基酸。除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包括任何所需体积或生产产量，包括但不限于实验室规模产量，半工业规模产量和完整生产规模产量。

此外，除非本文另有说明，否则装置、设施和方法可以包括任何合适的反应器，包括但不限于：搅拌釜、气升(airlift)、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床、喷动床和/或搅拌釜生物反应器。例如，在一些方面中，示例性生物反应器单元可以进行以下一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料，合适气体(例如氧气)的注入，发酵或细胞培养基的流动，气相和液相的分离，温度的维持，pH值的维持，搅拌(例如搅拌)，和/或清洁/消毒。示例性反应器单元(例如发酵单元)可以包含1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或更多个的生物反应器。在多个实施方式中，该生物反应器可以适用分批、分批进料、灌注或连续发酵工艺。可以使用任何合适的反应器直径。在一些实施方式中，生物反应器的体积可以为约100mL至约50,000L。非限制实例包括：100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升、和/或50,000升的体积。另外，合适的反应器可以是多用途、单用途、一次性或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包括金属合金，例如不锈钢(例如316L或任何其他合适的不锈钢)以及因康镍合金(Inconel)、塑料和/或玻璃。在一些实施方式中，合适的反应器可以是圆形的，例如圆柱形的。在一些实施方式中，合适的反应器可以是方形的，例如矩形的。在一情况下，方形反应器可提供优于圆形反应器的有点，例如易于使用(例如，由技术人员进行装载和设置)、反应器内容物的更大混合和均质性以及较低的占地面积。

在一些实施方式中，除非本文另有说明，否则本文所述的装置、设施和生产方法还可包括未以其它方式提及的任何合适单元操作和/或设备，例如用于该产物分离、纯化和分离的操作和/或设备。可以使用任何合适的设施和环境，例如传统的构件式(stick-built)设施、模块化设施或任何其他合适的构造、设施和/或布局。例如，在一些实施方式中，可以使用模块化无尘室。另外，除非另有说明，本文描述的装置、系统和方法可以容纳在单个位置或设施中和/或在其中进行，或者可替代性地容纳在单独或多个位置和/或设施中和/或在其中进行。

通过非限制性实例而非限制，美国公开号2013/0280797；美国公开第号2012/0077429；美国公开号2011/0280797；美国公开号2009/0305626；和美国专利号8,298,054；美国专利号7,629,167；和美国专利号No.5,656,491描述了可能合适的示例性设施、设备和/或系统，所述文献通过引用全文纳入本文。

在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是例如人或啮齿动物或牛细胞系或细胞株。该细胞、细胞系或细胞株的实例为：例如，小鼠骨髓瘤(NS0)细胞系，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系，HT1080，H9，HepG2，MCF7，MDBK Jurkat，NIH3T3，PC12，BHK(幼仓鼠肾细胞)，VERO，SP2/0，YB2/0，Y0，C127，L细胞，COS，例如COS1和COS7，QC1-3，HEK-293，VERO，PER.C6，Hela，EB1，EB2，EB3，溶瘤或杂交瘤细胞系。优选哺乳动物细胞是CHO细胞系。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，所述细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS细胞、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN细胞、或CHO-衍生细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1SV(隆萨生物制剂公司)。真核细胞也可以是禽细胞、细胞系或细胞株，例如细胞，EB14，EB24，EB26，EB66或EBv13。

在一个实施方式中，所述真核细胞是干细胞。干细胞可以是：例如，多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)，成年干细胞，诱导性多能干细胞(iPSC)，组织特异性干细胞(例如造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。

在一些实施方式中，培养的细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是例如人细胞系、小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系或杂交瘤细胞系。优选哺乳动物细胞是CHO细胞系。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，所述细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS细胞、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN细胞、或CHO-衍生细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞。CHO FUT8敲除细胞是例如SV(隆萨生物制剂公司)。

在一些实施方式中，所述细胞是酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisae)，里氏木霉(T.reesei))，昆虫细胞(例如Sf9)，藻类细胞(例如蓝藻细菌)，或植物细胞(例如烟草(tobacco)，苜蓿(alfalfa)，小立碗藓(Physcomitrella patens))。在一个实施方式中，所述细胞是啮齿动物细胞。在另一实施方式中，所述细胞是HeLa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS，例如，COS1和COS7、QC1-3，CHO-K1。

在一些实施方式中，所述细胞是干细胞。在一实施方式中，所述细胞是本文所述的任何细胞的分化形式。在一实施方式中，所述细胞是源自培养的任何原代细胞的细胞。

在一些实施方式中，该细胞是肝细胞，例如人肝细胞、动物肝细胞或非实质细胞。例如，该细胞可以是血小板代谢合格的的人肝细胞，血小板诱导合格的人肝细胞，血小板Qualyst Transporter Certified^TM人肝细胞，悬浮合格人肝细胞(包括10个供体和20个供体合并的肝细胞)，人肝枯否细胞(human hepatic kupffer cell)，人肝星状细胞，狗肝细胞(包括单个和合并的比格犬肝细胞(Beagle hepatocyte))，小鼠肝细胞(包括CD-1和C57BI/6肝细胞)，大鼠肝细胞(包括Sprague-Dawley、Wistar Han和Wistar肝细胞)，猴肝细胞(包括食蟹猴或恒河猴肝细胞)，猫肝细胞(包括短毛家猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白兔肝细胞)。示例性肝细胞可购自三角科技实验室有限公司(Triangle ResearchLabs,LLC)，北卡罗纳州Davis Drive研究三角科技园6，美国27709。

在一个实施方式中，该真核细胞是低等真核细胞，例如，酵母细胞(例如毕赤酵母属(Pichia genus)(例如毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，克氏毕赤酵母(Pichia kluyveri)和安氏毕赤酵母(Pichia angusta))，康呷塔乐属(Komagataella genus)(例如巴斯德康呷塔乐酵母(Komagataella pastoris)，必氏康呷塔乐酵母(Komagataella pseudopastoris)或帕氏呷塔乐酵母(Komagataellaphaffii))，酿酒酵母属(Saccharomyces genus)(例如出芽酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)，酿酒酵母(cerevisiae)，克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))，克鲁维酵母属(Kluyveromyces genus)(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))，假丝酵母属(Candida genus)(例如产朊假丝酵母(Candida utilis)，可可假丝酵母(Candidacacaoi)，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))，地霉属(Geotrichum genus)(例如发酵地霉(geotrichum fermentans))，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选的是毕赤酵母种类。毕赤酵母菌株的实例是X33、GS115、KM71、KM71H；和CBS7435。

在一个实施方案中，真核细胞是真菌细胞(例如曲霉菌属(Aspergillus)(例如黑曲霉(A.niger)，烟曲霉(A.fumigatus)，米曲霉(A.orzyae)，红蛋曲霉(A.nidula))，支顶孢属(Acremonium)(例如嗜热支顶孢(A.thermophilum))，毛壳菌属(Chaetomium)(例如嗜热毛壳菌(C.thermophilum))，金孢菌属(Chrysosporium)(例如嗜热金孢菌(C.thermophile))，冬虫夏草属(Cordyceps)(例如蛹虫草菌(C.militaris))，棒囊壳属(Corynascus)、栉霉属(Ctenomyces)、镰刀菌属(Fusarium)(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))，小丛壳属(Glomerella)(例如禾生小丛壳(G.graminicola))，肉座菌属(Hypocrea)(例如丝状真菌红褐肉座菌(H.jecorina))，稻瘟病菌属(Magnaporthe)(例如稻瘟病菌(M.orzyae))，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉属(M.thermophile))，丛赤壳属(Nectria)(例如红球丛赤壳菌(N.heamatococca))，脉孢霉属(Neurospora)(例如粗糙脉孢菌(N.crassa)，青霉菌属(Penicillium)，侧孢霉属(Sporotrichum)(例如嗜热侧孢霉(S.thermophile))，棱孢壳属(Thielavia)(例如太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)、异梭孢壳霉(T.heterothallica)，木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))或轮枝孢属(Verticillium)(例如大丽花轮枝孢(V.dahlia))。

在一个实施方式中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9，Mimic^TMSf9，Sf21，HighFive^TM(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞)，藻类细胞(例如，双眉藻属，硅藻纲(bacillariophyceae)，杜氏藻属，小球藻属，衣藻属，蓝藻属(蓝细菌)，微拟球藻，螺旋藻或棕鞭草(Ochromonas))，或植物细胞(例如来自单子叶植物(例如玉米，水稻，小麦或狗尾草)或来自双子叶植物(例如木薯，马铃薯，大豆，番茄，烟草，苜蓿，小立碗藓或拟南芥)的细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是细菌或原核细胞。

在一些实施方式中，原核细胞是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌，链霉菌，链球菌，葡萄球菌或乳杆菌。可以使用的芽孢杆菌是例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，纳豆芽孢杆菌(B.natto)，或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。在一些实施方式中，细胞是枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌可从例如芽孢杆菌遗传储备中心，生物科学556，西12街484号，哥伦布OH 43210-1214。

在一个实施方式中，原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌属(Salmonellaspp.)或大肠杆菌(Escherichia coli)，例如TG1，TG2，W3110，DH1，DHB4，DH5a，HMS 174，HMS174(DE3)，NM533，C600，HB101，JM109，MC4100，XL1-Blue和Origami，以及衍生自大肠杆菌B菌株的那些，例如BL-21或BL21(DE3)，所有这些都是可购得的。

合适的宿主细胞是可购得的，例如购自培养物保藏中心如DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH，布伦瑞克，德国)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

在一些实施方式中，培养的细胞用于产生蛋白质(例如抗体，例如单克隆抗体)和/或重组蛋白质，用于治疗用途。在一些实施方式中，培养的细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其他有用的生化中间体或代谢产物。例如，在一些实施方式中，可以产生分子量为约4000道尔顿(dalton)至大于约140,000道尔顿的分子。在一些实施方式中，这些分子可以具有一定范围的复杂性，并且可以包括翻译后修饰，其包括糖基化。

多个实施方式

1.一种使式I化合物如托酚酮与样品中另一组分分离的方法，所述方法包括：

在其中使式I化合物(例如托酚酮)与部分缔合(例如结合至该部分或被该部分保留)至大于组分的程度的情况下，使样品与部分或完全氟化的烷基或芳基(例如氟苯基，如五氟苯基丙基)部分接触，

由此，将式I化合物，例如托酚酮与组分分离，其中式I为：

且其中：

X是O或S；

R¹是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、OR³、C(O)R⁵、C(O)OR³、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；

各R²独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；或者

两个R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；或者R¹和R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；

R³是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R^4a和R^4b独立地是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R⁵是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

各R⁶独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、卤素、氧代或氰基；和

n为0、1、2、4或5；

2.如段落1所述的方法，其中，所述部分包括五氟苯基丙基。

3.如段落1或2所述的方法，其中，五氟苯基丙基与基质缔合，例如，结合，例如共价结合。

4.如段落3所述的方法，其中，所述基质包括不溶性基质，例如色谱基质，例如二氧化硅凝胶。

5.如段落1-4中任一项所述的方法，所述方法还包括：在其中化合物优先洗脱的情况下，使所述部分与一种或多种流动相(例如，一种或两种流动相)接触。

6.如段落1-5中任一项所述的方法，其中，所述方法包括：使得样品经受液相色谱(LC)分离。

7.一种评估含产物的样品中式I化合物如托酚酮的存在如水平的方法，所述方法包括：

a)i)提供样品的等分试样，例如式I化合物(例如托酚酮)的耗尽相(例如流动相)，其中式I化合物(例如托酚酮)已与样品的另一种组分分离，或者

ii)使样品经受其中式I化合物例如托酚酮与样品的另一种组分分离的条件，例如以形成式I化合物(例如托酚酮)富集相或等分试样和式I化合物(例如托酚酮)耗尽相或等分试样；和

b)评估式I化合物(例如托酚酮)的存在(例如其水平)，例如确定样品中式I化合物(例如托酚酮)的水平的值：

i)使用串联质谱(MS²)，或

ii)使用紫外线(UV)吸收(例如约242nm或约238nm的紫外线吸收)；

由此分析所述样品，

其中，式I是：

且其中：

X是O或S；

R¹是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、OR³、C(O)R⁵、C(O)OR³、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；

各R²独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；或者

两个R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；或者R¹和R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；

R³是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R^4a和R^4b独立地是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R⁵是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

各R⁶独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、卤素、氧代或氰基；和

n为0、1、2、4或5；

8.如段落7所述的方法，其中，a)包括：提供样品的等分试样，例如式I化合物例如托酚酮的耗尽相，例如流动相，其中，式I化合物例如托酚酮已与样品的另一种组分分离。

9.如段落7所述的方法，其中，a)包括：使样品经受其中式I化合物例如托酚酮与样品的另一种组分分离的条件，例如以形成式I化合物例如托酚酮的富集相或等分试样和式I化合物例如托酚酮的耗尽相或等分试样。

10.如段落7-9中任一项所述的方法，其中，a)包括：使得样品经受液相色谱(LC)分离。

11.如段落7-10中任一项所述的方法，其中，a)包括：在其中使式I化合物例如托酚酮与部分缔合(例如结合至该部分或被该部分保留)至大于组分的程度的条件下，使样品与部分或完全氟化的烷基或芳基部分接触，所述部分或完全氟化的烷基或芳基为例如氟苯基，如五氟苯基丙基。

12.如段落11所述的方法，其中，所述部分包括五氟苯基丙基。

13.如段落7-12中任一项所述的方法，其中，b)包括：评估式I化合物例如托酚酮的水平或存在，例如，使用串联质谱(MS²)确定样品中式I化合物例如托酚酮的水平的值。

14.如段落7-12中任一项所述的方法，其中，b)包括：评估式I化合物例如托酚酮的水平或存在，例如，使用紫外线(UV)吸收，例如约242nm或约238nm的紫外线吸收，来确定样品中式I化合物例如托酚酮的水平的值。

15.如段落7、11或12中任一项所述的方法，所述方法包括a)i)和b)i)。

16.如段落7、11或12中任一项所述的方法，所述方法包括a)i)和b)ii)。

17.如段落7、11或12中任一项所述的方法，所述方法包括a)ii)和b)i)。

18.如段落7、11或12中任一项所述的方法，所述方法包括a)ii)和b)ii)。

19.如段落7-18中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法具有约0.1-10000μg/ml、0.2-8000μg/ml、0.3-7000μg/ml、0.4-6000μg/ml、0.5-5000μg/ml、0.5-4000μg/ml、0.5-3000μg/ml、0.5-2000μg/ml、或0.5-1000μg/ml的线性范围，例如0.5-1000μg/ml。

20.如段落7-19中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的线性范围的下限为约0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.35μg/ml、0.4μg/ml、0.45μg/ml、0.5μg/ml、0.6μg/ml、0.7μg/ml、0.8μg/ml、0.9μg/ml、或1μg/ml，例如0.5μg/ml。

21.如段落7-20中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的线性范围的上限为约500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1200μg/ml、1400μg/ml、1600μg/ml、1800μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml、5000μg/ml、6000μg/ml、7000μg/ml、8000μg/ml、9000μg/ml、或10,000μg/ml，例如1000μg/ml。

22.如段落7-21中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的精度(例如，由重复样品之间标准偏差所表示)可以小于或等于约0％、40％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％，例如17％、16.5％、或16％。

23.如段落7-22中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的准确度(例如，由三个不同样品中平均单点添加回收率所表示)可以大于或等于约70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％，例如91％。

24.如段落7-23中任一项所述的方法，其中，关于确定样品中存在的式I化合物例如托酚酮的水平的值，所述方法的检测下限为约1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml、5.5μg/ml、6μg/ml、6.5μg/ml、7μg/ml、7.5μg/ml、8μg/ml、8.5μg/ml、9μg/ml、9.5μg/ml、或10μg/ml，例如5μg/ml。

25.如段落6或10中任一所述的方法，其中，LC是反相色谱。

26.如段落6或10中任一所述的方法，其中，LC不是反相色谱。

27.如段落6或10中任一所述的方法，其中，LC包括使用固定相，所述固定相包含部分或完全氟化的烷基或芳基，例如氟苯基，如五氟苯基丙基。

28.如段落27所述的方法，其中，LC包括使用含氟苯基的固定相。

29.如段落27所述的方法，其中，LC包括使用含五氟苯基丙基的固定相。

30.如段落6、10或25-29中任一项所述的方法，其中，LC包括使用第一流动相和第二流动相。

31.如段落30所述的方法，其中，第一流动相包括在水中的甲酸，例如，在水中的约0.01％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％甲酸。

32.如段落31所述的方法，其中，第一流动相包括在水中的约0.1％的甲酸。

33.如段落30所述的方法，其中，第二流动相包括在乙腈中的甲酸，例如，在乙腈中的约0.01％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、或1％甲酸。

34.如段落33所述的方法，其中，第二流动相包括在乙腈中的约0.1％的甲酸。

35.如段落33或34中任一项所述的方法，其中，第二流动相包含至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的乙腈，例如约100％乙腈。

36.如段落6、10或25-35中任一项所述的方法，其中，LC包括：使用含五氟苯基丙基的固定相以及使用第一流动相和第二流动相，其中，第一流动相包含在水中的约0.1％的甲酸，并且第二流动相包含在乙腈中的约0.1％的甲酸。

37.如段落6、10或25-36中任一项所述的方法，其中，LC包括：使用Discovery HSF5-3柱。

38.如段落7-13、15、17和19-37中任一项所述的方法，其中，使用MS²包括选择反应监测(SRM)。

39.如段落7-13、15、17和19-37中任一项所述的方法，其中，使用MS²包括多反应监测(MRM)，例如平行反应监测(PRM)。

40.如段落38或39中任一项所述的方法，其中，SRM或MRM(例如，PRM)用于监测来自表1的跃迁i、ii、iii、iv、v和vi中选择的一种或多种跃迁。

41.如段落40所述的方法，其中，SRM或MRM(例如，PRM)用于监测跃迁i。

42.如段落40所述的方法，其中，SRM或MRM(例如，PRM)用于监测跃迁ii。

43.如段落40所述的方法，其中，SRM或MRM(例如，PRM)用于监测跃迁iii。

44.如段落40所述的方法，其中，SRM或MRM(例如，PRM)用于监测跃迁iv。

45.如段落40所述的方法，其中，SRM或MRM(例如，PRM)用于监测跃迁v。

46.如段落40所述的方法，其中，SRM或MRM(例如，PRM)用于监测跃迁vi。

47.一种反应混合物，所述反应混合物包含部分或完全氟化的烷基或芳基部分以及含式I化合物例如托酚酮、另一组分和任选产物的样品，所述部分或完全氟化的烷基或芳基为例如氟苯基，如五氟苯基丙基，其中式I由下式给出：

且其中：

X是O或S；

R¹是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、OR³、C(O)R⁵、C(O)OR³、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；

各R²独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；或者

两个R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；或者R¹和R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；

R³是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R^4a和R^4b独立地是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R⁵是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

各R⁶独立地是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基、卤素、氧代或氰基；和

n为0、1、2、4或5；

48.一种产品的制造方法，所述产品为例如重组多肽，所述方法包括：提供包含所述产品和任选的式I化合物例如托酚酮的样品，其中：

所述样品通过段落7-43、45或46中任一项所述的方法进行分析，或者

通过段落1-6中任一项所述的方法将式I化合物例如托酚酮与样品的另一组分分离，

其中，式I是由下式给出：

且其中：

X是O或S；

R¹是氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、OR³、C(O)R⁵、C(O)OR³、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；

各R²独立地是C₁-C₆烷基、C₁-C₆杂烷基、N(R^4a)(R^4b)、C(O)N(R^4a)(R^4b)、或N(R^4a)C(O)R⁵；或者

两个R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；或者R¹和R²连接形成任选被一个或多个R⁶取代的杂环基环；

R³是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R^4a和R^4b独立地是氢、C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

R⁵是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基；

各R⁶独立地是C₁-C₆烷基或C₁-C₆杂烷基、卤素、氧代或氰基；和

n为0、1、2、4或5；

49.如段落48所述的方法，其中，制造方法包括：由多个细胞(例如，多个CHO细胞，例如，多个GS-CHO细胞)表达和分泌。

50.如段落1-49中任一项所述的方法或反应混合物，其中，样品包含培养上清液。

51.如段落1-49中任一项所述的方法或反应混合物，其中，样品包含细胞裂解液。

52.如段落1-51中任一项所述的方法或反应混合物，其中，样品包含培养上清液和细胞裂解液。

53.如段落1-52中任一项所述的方法或反应混合物，其中，样品通过产品的制造方法产生，所述产品例如是重组多肽。

54.如段落1-53中任一项所述的方法或反应混合物，其中，样品包含最终产品，例如，配制用于递送(例如，给予患者)的最终产品。

55.如段落1-54中任一项所述的方法或反应混合物，其中，产品或重组多肽是均聚或杂聚多肽，例如激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选抗体或抗体片段，例如人抗体或人源化抗体或其片段，例如源自小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或牛抗体的人源化抗体或其片段，通常为源自兔来源的人源化抗体或其片段。

56.如段落1-55中任一项所述的方法或反应混合物，其中，产品或重组多肽是治疗性多肽。

57.如段落1-56中任一项所述的方法或反应混合物，其中，产品或重组多肽是表1、表2、表3或表4中所公开的。

58.如段落1-57中任一项所述的方法或反应混合物，其中，产品或重组多肽是抗体。

59.如段落58所述的方法或反应混合物，其中，所述抗体是单克隆抗体。

60.如段落58或59中任一项所述的方法或反应混合物，其中，单克隆抗体是治疗性抗体。

61.如段落49-60中任一项所述的方法或反应混合物，其中，细胞是哺乳动物细胞。

62.如段落61所述的方法或反应混合物，其中，所述细胞是小鼠、大鼠、中华仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿、狗、马、雪貂或猫。

63.如段落61所述的方法或反应混合物，其中，所述细胞是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。

64.如段落63所述的方法或反应混合物，其中，所述CHO细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS细胞、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN细胞、或CHO-衍生细胞。

65.如段落61所述的方法或反应混合物，其中，所述细胞是HeIa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS，例如，COS1和COS7、QC1-3，或源自其的任意细胞。

实施例

参照以下实验性实施例进一步详细描述本发明。除非另有说明，这些实施例仅用于说明目的，而不是意图进行限制性。因此，本发明不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文所提供教导而变得显而易见的任何和所有变型。

无须赘述，相信本领域的普通技术人员可以使用之前的描述和以下示例性实施例来制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1：设备和试剂

下述设备、试剂和缩略词用于实施例2-6。

缩略词：

BDS 原料药(Bulk drug substance)

LC-MS/MS 液相色谱串联质谱

LOD 检测限

LLOD 检测下限

SRM 选择反应监测

RSD 相对标准偏差

设备：

Phenomenex Luna-NH2 150x 2mm，5μm色谱柱，部件号：00F-4378-B0，序列号H15-228806和H15-045780。

Supelco Discovery HS F5 150x 2.1mm 3μm，产品编号：567503-U，柱编号：149000-03，BL：8129

Waters Acquity UPLC系统ID 270419。

Waters Xevo TQ-MS.系统ID 270418.

5±3℃储存：室G100，斯劳公司(Slough)。

软件：

Waters MassLynx^TM质谱软件

Waters TargetLynx^TM应用管理器

材料和试剂：

托酚酮，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，部件号：15702-5G，批号：BCBR4016V

洗脱液1——配方：10mM磷酸钠/40mM氯化钠，pH 7.5

洗脱液2——配方：10mM磷酸钠/40mM氯化钠/400mM柠檬酸钠，pH6.1

BASM–配方：30mM组氨酸/盐酸组氨酸，225mM山梨糖醇，pH 6.0

实施例2：方法的开发

现有的RP-HPLC分离方法和UV检测用于分离和检测具有典型配方组分的典型样品中的托酚酮。UV色谱图显示存在多个峰，这归因于样品缓冲剂组分，以及处于使托酚酮快速、准确地鉴定和定量难度大的水平下(图1)。

使用IntelliStart软件，开发了SRM跃迁。将托酚酮溶解在50％的乙腈中，并以扫描的正电离和负电离模式直接注入质谱仪。其结果如表1所示。

表1 表1：IntelliStart开发的SRM跃迁

使用Luna-NH2(Phenomenex)LC色谱柱，使用40mM pH 9.45的乙酸铵/5％乙腈作为流动相A，乙腈作为流动相B，测试这些SRM用于色谱分离检测。该配置显示出没有分析物保留(图2)，因此该色谱柱未用于进一步的实验。

将LC色谱柱切换为Discovery HS F5-3(Supelco)，使用水中的0.1％甲酸作为流动相A，使用乙腈中的0.1％甲酸作为流动相B。使用该配置，两个SRM都显示了单个尖锐峰(在5.18分钟处洗脱)，对于溶于50:50流动相A:B的托酚酮注入而言(图3)。

实施例3：方法性能——线性范围、精度和准确度

测试了实施例2的开发的LC-MS方法的以下方法性能参数：线性范围、精度和准确度。使用5点校准曲线(0.5μg/mL、1.0μg/mL、100.0μg/mL、500.0μg/mL和1000.0μg/mL)来评估线性范围，并在2天中进行分析(1次注射，然后三次重复注射)。分析另外一校准点(0.1μg/mL)，但发现低于该方法的LOD，因此未绘制峰面积(图4)。在0.5μg/mL–1000.0μg/mL范围内，线性度为R²＝0.9911。

使用重复注射的标准曲线的相对标准偏差(RSD)的平均值计算精度，得出值16.56％。

通过单点单点添加回收率实验对3个不同的加工样品进行计算，得出平均回收率为91.4％。

实施例4：方法性能–测试过程中样品

实施例2和3中开发并测试的方法对来自所制备生物产品纯化的各个阶段的三个样品进行进一步测试。所测试的三个过程中样品来自不同配方的各个下游阶段(SartobindQ和Sartobind苯基柱以及原料药(BDS))。样品以纯净注射的形式进行分析，并且在任何样品中均未显示托酚酮信号(图5)。

作为方法性能评估的一部分，将托酚酮标准品以0.05mg/mL的浓度添加到这些过程中样品中(图6)。该实验证实了从各种配方的过程中样品中回收了托酚酮。这也证实了在该方法的检测下限(LLOD)(5.0μg/mL)之上，测试样品中不存在托酚酮。

实施例5：UV检测和方法

如实施例2(图1)所示，使用242nm紫外检测的以前的方法显示了从样品基质中检测到的干扰峰(样品缓冲剂峰)。考虑使用238nm吸收是否可以增加托酚酮峰响应。使用在实施例2-4中建立并测试的新色谱条件代替MS，测试UV检测，并且缓冲剂峰干扰的问题似乎已得到解决(图7)。顶部痕迹图显示了在242nm处的UV检测，底部痕迹图显示了在238nm处的UV检测，在这两个波长下，似乎之前在7.0分钟(图1)处看到的缓冲剂峰已经移动保留时间，并且不再干扰托酚酮峰(5.28分钟)。随着峰分辨率(resolution)提高，MS检测对于新分析法可能不是必需的，尽管其将提供比UV检测更高的特异性。

实施例6：结论

使用LC-MS开发了一种用于检测过程中和纯化样品中的托酚酮的新型分析法。不进行优化，这可以通过改变色谱减少干扰峰并提高检测特异性来改进以前使用的RP-HPLC-UV方法。

对方法性能参数的线性范围、准确度和精度进行了评估，并且结果如下：

·线性度：R²＝0.9911

·精度＝16.56％RSD

·准确度＝91.4％回收率

与242nm相比，使用238nm的检测波长观察到托酚酮峰强度略有增加。使用Discovery HS-F5色谱柱和相关流动相获得的改进的色谱性能解决了先前提到的配方缓冲液干扰问题。可以仅使用该LC配置以及UV检测。