SiMYB61蛋白及其相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用

文档序号：1307963 发布日期：2020-08-11 浏览：6次 >En<

阅读说明：本技术 SiMYB61蛋白及其相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用 (Application of SiMYB61 protein and related biological material thereof in regulation and control of plant stress resistance ) 是由陈明孙黛珍马有志黎毛毛张玥玮唐文思周永斌徐兆师陈隽于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了SiMYB61蛋白及其相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。本发明为水稻逆境基因工程提供了新的基因,同时通过遗传转化导入粳稻优良品种,培育抗逆转基因新品种,可以有效地提高水稻的抗逆性,减少逆境胁迫对水稻生产的影响,将有重要的经济效益和社会效益。(The invention discloses an application of SiMYB61 protein and related biological materials thereof in regulation and control of plant stress resistance. The invention provides a new gene for rice stress genetic engineering, and simultaneously introduces japonica rice fine varieties through genetic transformation to culture new stress-resistant transgenic varieties, so that the stress resistance of rice can be effectively improved, the influence of stress on rice production is reduced, and important economic and social benefits are achieved.)

技术领域

本发明涉及SiMYB61蛋白及其相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用。

背景技术

我国是世界上单位化肥投入粮食产出最低的国家之一，氮肥利用率仅为30～35％(发达国家为45％)，磷肥利用率仅在10～20％。按目前用量如节省10％的氮肥、20％的磷肥，每年可节省241亿元的资金。氮、磷化肥的低效利用，使农业面源污染成为水系富营养化、土壤酸化与重金属污染最重要的因素，威胁生态安全与可持续发展。因此，我国迫切需要培育养分高效利用的农作物新品种，从而大幅度提高我国氮、磷化肥的利用效率。

培育抗逆性的水稻新品种，提高其自身的抗逆性，是在减少化肥施用量、干旱缺水条件下提高水稻产量水平的重要措施。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗逆性相关的SiMYB61蛋白及其相关生物材料与应用。

第一方面，本发明首先保护SiMYB61蛋白或其相关生物材料在如下(a1)和/或(a2)中的应用：

(a1)调控植物产量相关性状；

(a2)调控植物抗逆性；

所述相关生物材料为能够表达所述SiMYB61蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述SiMYB61蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.4的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

所述核酸分子具体可为SiMYB61蛋白的编码基因。所述SiMYB61蛋白的编码基因是如下任一所述的DNA分子：

(B1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(B2)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(B3)SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(B4)在严格条件下与(B1)或(B2)或(B3)限定的DNA分子杂交且编码所述SiMYB61蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)或(B2)或(B3)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述SiMYB61蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述表达盒具体可为由ubiquitin组成型启动子、上述SiMYB61蛋白的编码基因和终止子nos 3’组成的表达盒。所述表达盒具体可为将重组载体采用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切得到的。所述重组载体具体可为SEQ ID NO.3克隆到载体LP0471118-Bar-ubi-EDLL的BamHI和SpeI位点得到的重组载体。

所述重组菌可为将上述表达盒或重组载体导入农杆菌菌株中得到的。所述农杆菌菌株具体可为农杆菌菌株EHA105。

所述应用中，所述植物产量相关性状包括穗数、穗长、每穗粒数和/或生物量；所述生物量包括稻草重和/或稻谷重。

所述植物抗逆性为植物对于低氮胁迫的抗性。

所述调控为正向调控。

第二方面，本发明保护SiMYB61蛋白或其相关生物材料在植物育种中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述SiMYB61蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述SiMYB61蛋白如前文所示。

所述应用中，所述育种的目的是为了选育产量高和/或抗逆性高的植物。所述产量高具体可体现为穗数多和/或穗长高和/或每穗粒数多和/或生物量高。所述生物量包括稻草重和/或稻谷重。所述耐逆性具体为对低氮胁迫的抗性。所述低氮胁迫的抗性高体现为低氮胁迫下产量高和/或株高高。所述低氮胁迫的抗性高体现为含氮量高。

第三方面，本发明保护一种提高植物产量和/或提高植物耐逆性的方法，包括使受体植物中SiMYB61蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。

所述产量具体为穗数、穗长、每穗粒数、粒重和/或生物量。

所述生物量包括稻草重和/或稻谷重。

所述耐逆性具体为对低氮胁迫的抗性。

所述耐逆性提高具体可体现为低氮胁迫下产量提高和/或株高提高。

所述低氮胁迫的抗性高体现为含氮量高。

所述SiMYB61蛋白如前文所示。

第四方面，本发明保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达SiMYB61蛋白的核酸分子，得到所述SiMYB61蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比产量和/或抗逆性提高。

所述产量具体为穗数、穗长、每穗粒数、粒重和/或生物量。

所述生物量包括稻草重和/或稻谷重。

所述耐逆性具体为对低氮胁迫的抗性。

所述耐逆性提高具体可体现为低氮胁迫下产量提高和/或株高提高。

所述低氮胁迫的抗性高体现为含氮量高。

所述“向受体植物中导入能够表达SiMYB61蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述SiMYB61蛋白的编码基因的表达盒实现的。

所述SiMYB61蛋白的编码基因如前文所示。

以上任一所述每穗粒数为每穗实粒和/或每穗总粒。

以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为水稻或谷子。

所述水稻具体可为水稻品种Kitaake。

所述谷子具体可为豫谷一号。

本发明为水稻逆境基因工程提供了新的基因，同时通过遗传转化导入粳稻优良品种，培育抗逆转基因新品种，可以有效地提高水稻的抗逆性，减少逆境胁迫对水稻生产的影响，将有重要的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为转SiMYB61基因抗逆水稻的SSR检测结果。Marker：DL1000 Marker；阴性对照：Kitaake；阳性对照：植物表达载体psSiMYB61。

图2为18年田间检测数据统计结果。

图3为转基因植株与野生型表型对比。

图4为19年田间正常处理条件下检测数据统计结果。

图5为19年田间低氮胁迫条件下检测数据统计结果。

图6为19年田间稻草及稻谷重量检测数据统计结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

LP0471118-Bar-ubi-EDLL载体：记载于文献：宁蕾,王曙光,琚鹏举,柏星轩,葛林豪,齐欣,姜奇彦,孙现军,陈明,孙黛珍.过表达谷子SiANT1对水稻耐盐性的影响[J].中国农业科学,2018,51(10):1830-1841.公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

豫谷一号：记载于文献：宁蕾,王曙光,琚鹏举,柏星轩,葛林豪,齐欣,姜奇彦,孙现军,陈明,孙黛珍.过表达谷子SiANT1对水稻耐盐性的影响[J].中国农业科学,2018,51(10):1830-1841.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

bar基因表达载体pSBAR：记载于文献：苏瑞波.利用改进的最小表达框技术获得抗旱转基因小麦[D].内蒙古农业大学,2012.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

农杆菌菌株EHA105：北京擎科新业生物技术有限公司。

水稻品种Kitaake：记载于文献：宁蕾,王曙光,琚鹏举,柏星轩,葛林豪,齐欣,姜奇彦,孙现军,陈明,孙黛珍.过表达谷子SiANT1对水稻耐盐性的影响[J].中国农业科学,2018,51(10):1830-1841.；公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

实施例1、SiMYB61蛋白及其编码基因的获得

从逆性谷子豫谷一号确认中克隆得到一个抗逆相关基因，命名为SiMYB61基因，其基因组序列如SEQ ID NO.1所示，转录序列如SEQ ID NO.2所示，CDS如SEQ ID NO.3所示。SiMYB61基因编码的蛋白质(SiMYB61蛋白)如SEQ ID NO.4所示。

实施例2、SiMYB61蛋白及其编码基因在水稻育种中的应用

一、线性最小表达框的制备

1、植物表达载体psSiMYB61的获得

提取豫谷一号的总RNA，并反转录为cDNA。以所述cDNA为模板，采用引物F和引物R进行PCR扩增，利用Clotech公司的无缝克隆试剂盒(货号：639649)按照说明书步骤将SiMYB61的CDS序列(SEQ ID NO.3)克隆到载体LP0471118-Bar-ubi-EDLL的BamHI和SpeI位点，得到植物表达载体psSiMYB61(已经测序验证)。

引物F：5’-AGACCGATCTGGATCATGGGGAAGCACTCCTGC-3’；

引物R：5’-CGATCGATCCACTAGCTAGATATTCTCGAAAGACAAGGACATTCTCTG-3’。

2、线性最小表达框的制备

采用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切步骤1得到的植物表达载体psSiMYB61，回收约3500bp的片段，得到SiMYB61基因线性最小表达框，线性最小表框由ubiquitin组成型启动子(1800bp)、SiMYB61基因(1275bp)和终止子nos 3’(300bp)组成。最小表达框转化法可以去除载体骨架序列，不带有氨苄青霉素抗性基因，转基因水稻与受体没有显著差异，没有致病性，降低了插入植物基因组外源片段的安全风险。

采用bar基因作为标记基因，制备标记基因表达框：采用Hind III酶切bar基因表达载体pSBAR，回收酶切产物，即为标记基因表达框；所述标记基因表达框由玉米ubiquitin启动子、标记基因bar和nos终止子组成。

二、水稻转化

1、将步骤一制备的SiMYB61基因线性最小表达框和标记基因表达框转化农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌。

2、取授粉后12～14天的水稻品种Kitaake的未成熟胚，70％乙醇中浸泡1分钟，然后用10％的次氯酸钠消毒15分钟，经无菌水3～5次冲洗后，超净台上取出幼胚，接种于SD₂培养基(MS基本培养基(不含维生素)+2mg/L 2,4-D+1mg/LVB1+150mg/LAsn天冬酰胺+30g/L蔗糖+2.4g/L植物凝胶，pH＝5.8)上诱导幼胚愈伤组织7天，然后将诱导的愈伤组织转到高渗培养基(MS基本培养基+5mg/L 2,4-D+0.4mol/L甘露醇+3g/L植物凝胶)上高渗处理4～6小时。

3、完成步骤2后，将愈伤组织进行农杆菌侵染，将愈伤组织浸泡于OD₆₀₀＝0.8的重组农杆菌菌液中，180r/min振荡侵染30min左右。

4、完成步骤3后，将愈伤组织在高渗培养基上继续培养16～18小时，然后将侵染后的愈伤组织转到SD₂培养基上暗培养两星期。

5、完成步骤4后，将愈伤组织转接至含有2～3毫克/升的除草剂Bialaphos的选择培养基上(MS基本培养基(不含维生素)+2mg/L 2,4-D+1mg/LVB1+150mg/LAsn天冬酰胺+30g/L蔗糖+2.4g/L植物凝胶+2-3mg/L的除草剂Bialaphos，pH＝5.8)进行愈伤组织筛选、分化和壮苗，得到T0代的转基因水稻植株。

三、转基因阳性水稻的鉴定

采用SDS方法提取待测T0代水稻叶片DNA，以所述DNA为模板，根据SiMYB61基因序列设计扩增部分序列的引物进行PCR扩增，采用引物F和引物R进行PCR扩增，将PCR扩增产物通过0.8％的琼脂糖胶检测，紫外拍照。采用水稻品种Kitaake替代T0代水稻进行上述操作，作为阴性对照；采用植物表达载体psSiMYB61作为阳性对照。

F：5’-TGGCAACTTGAGCCATCTCC-3’；

R：5’-GTTGATGTTGAGAGAGTT-3’。

PCR反应体系见表1。PCR反应条件：94℃变性5min；94℃50sec，62℃50sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

表1

成分	用量(ul)
		(Takara)10xPCRbuffer(Mg<sup>2+</sup>Plus)	2.50
(Takara)25mMMg<sup>2+</sup>	0.05
		(Takara)2.5mMdNTPMixture	2.00
引物F	0.80
		引物R	0.80
(Takara)r-TaqDNAPloymerase(5U/ul)	0.25
		模板	1.00
ddH<sub>2</sub>O	17.6
		总计	25

结果如图1所示。经过PCR检测中，获得5株阳性植株，阳性率为2％。经过温室加代、筛选和鉴定，选择选择转SiMYB61水稻纯合株系，依次命名为OE21、OE44用于下述实验。

四、转基因水稻表型检测

1、2018年田间表型检测

待测植株：水稻品种Kitaake(WT)、转基因株系OE21、转基因株系OE44。

试验地点：江西省高安江西省农业科学院水稻研究所转基因试验基地。

秧田管理与大田生产相同(不添加氮肥)，各试验材料能够正常生长。

每份材料分别收获8株，三次重复，分别测定各材料的生物产量、稻谷产量。

利用凯氏定氮法分别测定参试材料的稻谷含N量、稻草含N量。检测方法具体参考文献“杨亚丽,蔡顺林.流动分析法与凯氏定氮法测定植物全氮的比较[J].玉溪师范学院学报,2016,32(08):51-54.”和“戴宏林,吴小骏.用凯氏定氮法测定植物干样品中的氮含量[J].江苏农学院学报,1995(03):70.”中的方法。

各材料分别取3株进行室内考种，考察其单株有效穗数(单穗在5粒以上为有效穗)、每穗实粒、每穗总粒、结实率等。

结果如图2所示。图2中，稻谷含氮量、稻草含氮量的单位为g/8株，为8株稻谷/稻草重的氮含量。稻草全氮含量的单位为百分数(％)，是指稻草含氮量/此8株稻草的重量。

结果显示，在不施氮肥的处理下，与对照水稻品种Kitaake相比，转基因水稻株系的干谷重、稻草干重均高于对照。单株有效穗数、每穗实粒数、每穗总粒数均高于对照。稻谷含N量、稻草含N量也均高于对照。

2、2019田间数据

待测植株：水稻品种Kitaake(WT)、转基因株系OE44。

试验地点：江西省高安江西省农业科学院水稻研究所转基因试验基地。

秧田管理与大田生产相同。各试验材料能够正常生长。

试验设每亩施纯氮12公斤和不施氮肥两个处理，每个处理设两个重复。

每份材料栽6行，每行8兜，行株距5×6寸，单本栽插。

试验面积4.0亩。大田其它肥水管理与当地生产相同。

每份材料每个处理分别收获20株，三次重复，分别测定各材料稻草重、稻谷重。

各材料每个处理每份材料分别收获8株，三次重复，分别测定各材料的生物产量、稻谷产量。

各材料每个处理分别取3株进行室内考种，考察其单株有效穗数、每穗实粒、每穗总粒等。

表型观察结果如图3所示。

统计结果如图4(正常处理)、图5(低氮处理)和图6所示。

上述结果显示，在正常施氮肥条件下，转基因植株的生物量(稻草重、稻谷重)、穗长、每穗总粒明显高于受体植株。在低氮胁迫下，转基因植株的生物量(稻草重、稻谷重)、株高、穗数、穗长、每穗实粒、每穗总粒也高于受体植株。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

山西农业大学

<120> SiMYB61蛋白及其相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2271

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 1

tgataggaca taaggacaca cacgcttaca gagaagcaac aaagggaagg gctaagagcc 60

tgaggctccc acaaccacca gctttaaaag aaggggggca attggggagg gaggcctgca 120

aagaaaagga gaagagtgcc cttaagccta ccagtgcctt cctccaaatc ctgatattag 180

tagccactag ttgctgccgt tctcccacaa gctctactct atcagacacc actatatgag 240

cccgtataag cagttcatcc acaataatcc cacccttgaa ccacaaattg ttgagaggtg 300

ttcttagaac cagaggatta cctgtgaaga attctgtgct gctcctcaag gtgtgtgcag 360

attgcagagc tcagcttcag cttctgcatt gctttcaatg gggaagcact cctgctgtta 420

caagcagaag ctgaggaagg ggctctggtc tcctgaggaa gacgagaagc tcatgaacca 480

cataaccaag catgggcatg gctgctggag cactgttcca aagcttgcag gtacaatcaa 540

aatcctgcac actttattct tctcaattat ccattcccac tgtttcctat tcatctccaa 600

ggccacttct tctcccaatc ttctcatacc tgcccaatta atgattgcag ggcttcaaag 660

gtgtggcaag agctgcaggc tgaggtggat aaattacctg aggcctgacc ttaaaagagg 720

tgcattctct caggaggagg aagaccttat cattgaactt catgctgtct tgggcaacag 780

gtaaatttaa tcccaaatca cactgtcaga attttgcacc tattgcttca aagcaagctt 840

tccttaacta tgcctttttc acgtaaatga acaggtggtc tcagattgca acacggttgc 900

ctggaagaac tgataacgag atcaagaatc tctggaattc aagcatcaag aagaagctcc 960

ggcagaaagg catcgacccc aacacccaca agccccttgc tgaggttgat cgcaaaatag 1020

ctccaacaat cagtactgag agaacctccg agtccagcga tattgaccct tcaagtggtg 1080

gtgcacttgg caacttgagc catctcctca gtgagacagc acaatcacca gagctgctgc 1140

cagtgctcgg taagcatcgc aaagaaacta ctagtttggc acatctaagg gtgccatcga 1200

aggagctatt ccttgaccag cttgtttctg gtaatgataa cctccccagc tgccgctcaa 1260

caggcccaat tccaaatttc cctttccagc agttgatgtg ttacagcaat gaatttggcg 1320

gcaagcatgg aggcagcacg aatccactct ggtttaacca gaatgagtca agctgcagca 1380

ccatttccac tgtgatgcca ccagtttcgc catcaactct ctcaacatca acaggactca 1440

ataggtcacc ggacaatcca cactctggag gtactggcat tcagagtaac caattctact 1500

gggacaccac taatcctagc agcagtagca gtaaaggaag cagtggaagc aatagcttgg 1560

gatttgagct gcaaagcaca agctcaattc tggagaatag tatcttccca tggacagatt 1620

tatcgccaga taaaaatagc cacctagagg aagaactcaa gtggcctgac ctgctccatg 1680

gaaccttcac agatacacca gcaaccatgc agaatcttag ccaatcactg tatgaagatg 1740

tggtcaaagc cgagaaccaa ttcaacatgg agggcctctg tgcagcttgg tctcaaaatt 1800

tgcagccaca gcaacatctg caggtagcat cagatttgta tgacaaggat ttgcagagaa 1860

tgtccttgtc tttcgagaat atctaggcaa catgtttcag catgcatgga acagaacaat 1920

agcagaaagc tgagttaatg aagcctagaa aacacaacat ttcttcacag atttatttgc 1980

aggctatgtg gaggtgtttg cgtaggtaca ttcttatgat gatacagaga tcaacaatga 2040

taactgttca tcagttaaag atactgcagt acatgaaaaa aaggagacaa agtatgaatt 2100

tatattacag cataatgtat agcctagaga aaagtatgtc tcgaagttta ctttcctttc 2160

acttaaagtt gctgtcttta tctgtacatg catgcagctc gactttttgt atacgtgagt 2220

catggttgat ctttttctac caaataaatg aggcaaggat gtggaacact g 2271

<210> 2

<211> 2057

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 2