阅读说明：本技术 调控番茄果实品质的转录因子及其应用 (Transcription factor for regulating and controlling tomato fruit quality and application thereof ) 是由 庄焜扬 孟庆伟 吕巍 马娜娜 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及涉及植物生物技术领域,具体涉及调控番茄果实品质的转录因子及其应用。本发明研究发现,EIL2转录因子能够直接结合到LCYB的启动子上抑制其表达,减少番茄红素的转化；WHY1转录因子又能够结合到EIL2的启动子上抑制其表达,从而促进了LCYB的转录,推进番茄红素向β-胡萝卜素的转化；EIL2还能够通过直接结合启动子元件的方式抑制肌醇单磷酸酶(IMP,肌醇合成限速酶)及肌醇加氧酶(MIOX,肌醇途径合成抗坏血酸的限速酶)基因的表达,减少抗坏血酸的合成。WHY1则能够通过抑制EIL2促进抗坏血酸的合成。本发明的WHY1-EIL2介导的调控机制对番茄果实番茄红素及抗坏血酸的积累有重要的意义。(The invention relates to the technical field of plant biology, in particular to a transcription factor for regulating and controlling tomato fruit quality and application thereof. The research of the invention finds that the EIL2 transcription factor can be directly combined with the promoter of the LCYB to inhibit the expression of the LCYB transcription factor and reduce the conversion of lycopene; the WHY1 transcription factor can be combined with a promoter of EIL2 to inhibit the expression of the transcription factor, so that the transcription of LCYB is promoted, and the conversion of lycopene to beta-carotene is promoted; the EIL2 can also inhibit the expression of genes of inositol monophosphatase (IMP, inositol synthesis rate-limiting enzyme) and inositol oxygenase (MIOX, rate-limiting enzyme for synthesizing ascorbic acid by inositol pathway) by directly combining with a promoter element, and reduce the synthesis of ascorbic acid. WHY1 can promote ascorbic acid synthesis by inhibiting EIL 2. The WHY1-EIL2 mediated regulation mechanism has important significance on the accumulation of lycopene and ascorbic acid in tomato fruits.)

调控番茄果实品质的转录因子及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及调控番茄果实品质的转录因子及其应用。

背景技术

番茄一直以来都以其独特的风味、丰富的营养价值深受人们的喜爱，在我国北方地区有着广泛的种植。番茄果实的生长发育是一个类胡萝卜素大量积累、淀粉及糖大量水解的过程，代谢产物丰富。其中，番茄红素和抗坏血酸(AsA)是两种人类所需的十分重要的抗氧化物质，对维持人的身体健康尤为重要。因此，明确番茄果实体内番茄红素及AsA的合成代谢的分子调控机制对提高番茄果实品质具有重要意义。

番茄红素是类胡萝卜素代谢途径中的中间产物。在番茄红素的合成及代谢途径中，影响番茄红素积累的关键在于PSY1介导的生物合成及LCYB介导的降解(Shewmaker etal.,1999；Ronen et al.2000)。此外，八氢番茄红素去饱和酶(PDS)和ζ-胡萝卜素去饱和酶(ZDS)及胡萝卜素异构酶(CRTISO)亦在其中发挥着重要的作用(Cunningham and Gantt,1998；Isaacson et al.,2002)。随着番茄红素代谢途径的阐明和生物合成相关基因的克隆，使得运用基因工程技术提高番茄红素产量成为可能。以CaMV 35S启动子组成型地大量表达PSY1基因，能够促进番茄果实中番茄红素的积累(Fray et al.,1995)。另一方面，通过RNAi干扰技术抑制LYCB的表达，可以通过减少番茄红素的降解来提高番茄果实中番茄红素的含量(Rosati et al.,2000)。目前，人们已经对植物番茄红素代谢途径中的主要基因进行了大量的研究，然而其基因表达调控和色素积累详细的机制并不清楚。因此，解析番茄红素相关基因表达调控的主效机制对提高番茄红素含量具有重要意义。

抗坏血酸(维生素C)在生物体内具有重要的抗氧化作用，是植物和动物生长、发育和繁殖过程中所必需的物质(Gilbert et al.,2009)。人类和一些灵长类动物由于抗坏血酸合成途径最后一个关键酶(L-古洛糖醛酸-1，4-内酯氧化酶)基因的缺失，自身无法合成抗坏血酸，必须从食物特别是新鲜水果蔬菜中摄取(Watanabe et al.,2006)。鉴于抗坏血酸在生物体内的重要功能，提高蔬菜和水果中抗坏血酸的含量的研究显得十分重要。番茄因其果实内富含柠檬酸和苹果酸所呈的酸性条件，更利于抗坏血酸的稳定。L-半乳糖途径是番茄抗坏血酸合成的主要途径(Smirnoff et al.,1996)。但饲喂实验表明：半乳糖醛酸途径和肌醇途径可能也在番茄抗坏血酸合成中发挥着作用(Badejo et al.,2012；Lorenceet al.,2004)。这些不同的合成途径可能在番茄不同生长发育时期发挥着不同的作用。目前大部分研究都集中于L-半乳糖途径主要基因功能的解析及分子调控，而肌醇途径的作用及调控机制并不清楚。因此，解析番茄果实中合成抗坏血酸的肌醇途径调控机制可为提高番茄果实抗坏血酸含量提供新的视角。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供调控番茄果实品质的转录因子及其应用。本发明研究发现了抑制番茄红素代谢及调控肌醇-抗坏血酸代谢途径的新机制，对于提高番茄果实中番茄红素和抗坏血酸含量具有十分重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供如下1)或2)所述的转录因子在调控番茄果实品质中的用途：

1)转录因子EIL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)转录因子WHY1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述用途中，所述转录因子WHY1通过直接结合到EIL2的启动子上抑制EIL2表达来调控番茄果实的品质。

上述用途中，所述调控番茄果实品质包括：调控番茄果实中番茄红素和抗坏血酸含量。

本发明的第二方面，提供编码上述转录因子的基因在调控番茄果实品质中的用途；所述基因包括：

编码转录因子EIL2的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或

编码转录因子WHY1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述用途中，所述调控番茄果实品质包括：调控番茄果实中番茄红素、抗坏血酸、脱落酸、乙烯合成前体及乙烯的含量。

本发明的第三方面，提供一种调控番茄果实中番茄红素含量的方法，包括以下步骤：

上调EIL2的表达或者下调WHY1的表达，以提高番茄果实中番茄红素的含量；

或，下调EIL2的表达或者上调WHY1的表达，以降低番茄果实中番茄红素的含量。

本发明的第四方面，提供一种调控番茄果实中抗坏血酸含量的方法，包括以下步骤：

下调EIL2的表达或者上调WHY1的表达，以提高番茄果实中抗坏血酸的含量；

或，上调EIL2的表达或者下调WHY1的表达，以降低番茄果实中抗坏血酸的含量。

上述方法中，通过抑制EIL2的表达来促进肌醇单磷酸酶(IMP)和肌醇加氧酶(MIOX)的表达，从而激活抗坏血酸合成的肌醇途径，增加抗坏血酸的含量。

上述方法中，上调或下调EIL2的表达，以及上调或下调WHY1的表达，均为常规的基因工程技术，例如通过RNAi干扰载体、Crisper Cas9载体或者过表达载体来实现。

本发明的第五方面，提供上述转录因子或者编码转录因子的基因在培育转基因番茄中的用途。

上述用途中，所培育的转基因番茄与番茄出发植株相比，番茄果实的色泽和品质发生改变。

本发明的有益效果：

本发明利用反向遗传学首次在番茄中发现并证实了一条新的果实色泽和抗坏血酸(AsA)代谢相关的基因调控路径。番茄红素环化酶(LCYB)介导了番茄红素向β-胡萝卜素的转化，从而影响了番茄果实的着色。而EIL2转录因子能够结合到LCYB的启动子上抑制其表达，减少番茄红素的转化；WHY1转录因子又能够结合到EIL2的启动子上抑制其表达，从而促进了LCYB的转录，推进番茄红素向β-胡萝卜素的转化。这提供了一条新的控制番茄红素降解的分子机制。另一方面，AsA是番茄果实中重要的抗氧化物质，对人体健康十分重要。EIL2还能够通过直接结合启动子元件的方式抑制肌醇单磷酸酶(IMP，肌醇合成限速酶)及肌醇加氧酶(MIOX，AsA肌醇途径限速酶)的表达，减少AsA的合成。WHY1则能够通过抑制EIL2促进AsA的合成。本发明所发现的WHY1-EIL2介导的调控机制对番茄果实番茄红素及抗坏血酸的积累有重要的意义。

附图说明

图1：A图为WHY1 RNAi番茄株系(WR4)果实中WHY1表达量的鉴定；图B为EIL2RNAi番茄株系(ER1、ER2、ER3)果实中EIL2表达量的鉴定；图C为WHY1与EIL2 RNAi杂交株系(W*E1、W*E2、W*E3)果实中EIL2及WHY1表达量的鉴定；图D为各转基因番茄株系果实色泽的表型。图E为各转基因番茄株系果实色泽的表型。图E为各转基因番茄株系果实中番茄红素含量的测定。图F为各转基因番茄株系果实中抗坏血酸含量的测定。

图2：EIL2对番茄脱落酸生物合成影响的考察结果；图中，WT-Y：野生型转色期的果实，ER-Y：EIL2 RNAi株系转色期的果实；WT-R：野生型成熟期的果实；ER-R：EIL2RNAi株系成熟期的果实。

图3：EIL2在番茄果实不同的发育时期对乙烯合成前体(ACC)及乙烯的含量调节的考察结果；图中，WT-Y：野生型转色期的果实，ER-Y：EIL2 RNAi株系转色期的果实；WT-R:野生型成熟期的果实；ER-Y：EIL2 RNAi株系成熟期的果实。

图4：A图为WHY1-GAD与EIL2pro-LacZ的酵母单杂交实验；WHY1-GAD+-::LacZ及-GAD+P1::LacZ为阴性对照组。图B为EIL2-GAD与LCYBpro-LacZ的酵母单杂交实验；EIL2-GAD+-::LacZ及-GAD+P1::LacZ为阴性对照组。图C为EIL2-GAD和IMPpro-LacZ的酵母单杂交实验；EIL2-GAD+-::LacZ及-GAD+P1::LacZ为阴性对照组。图D为EIL2-GAD和MIOXpro-LacZ的酵母单杂交实验；EIL2-GAD+-::LacZ及-GAD+P1::LacZ为阴性对照组。图E为WHY1-FLAG与EIL2启动子的LUC激活实验；-FLAG+EIL2-pro-LUC为阴性对照。图F为EIL2-FLAG与LCYB启动子的LUC激活实验；EIL2能够抑制LCYB的表达；-FLAG+LCYB-pro-LUC为阴性对照。图G为EIL2-FLAG与IMP启动子的LUC激活实验；EIL2能够抑制IMP的表达；-FLAG+IMP-pro-LUC为阴性对照。图H为EIL2-FLAG与MIOX启动子的LUC激活实验；EIL2能够抑制MIOX的表达；-FLAG+MIOX-pro-LUC为阴性对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，在蔬菜和水果中，番茄红素和抗坏血酸均具有很强的抗氧化能力且有益于人们的身体健康。相较于工业及生物发酵合成的番茄红素和抗坏血酸产品，直接从果蔬中获得更容易被人们所接受。因此，解析番茄红素及维生素C合成及代谢的分子调控机理对内源提高其含量具有重要的意义。但目前人们对植物中番茄红素代谢途径中基因表达调控机制及抗环血酸肌醇合成途径的作用及调控机制的研究较少。

基于此，本发明对控制番茄中番茄红素代谢及抗坏血酸合成的分子机制进行了深入研究。本发明研究发现：ETHYLENE INSENSITIVE 3-LIKE 2(EIL2)是一个控制番茄红素降解及抗坏血酸合成的“开关”。一方面它可以通过抑制番茄红素环化酶(LYCB)的表达减少番茄红素向β-胡萝卜素的转变，增加番茄红素在果实中的积累；另一方面可以通过抑制它的表达来促进肌醇单磷酸酶(IMP)和肌醇加氧酶(MIOX)的表达，从而激活抗坏血酸合成的肌醇途径，增加抗坏血酸的含量。而WHIRLY1转录因子在这个过程中可以作为“钥匙”来控制EIL2的表达。

由此，本发明提供了一条抑制番茄红素代谢及调控肌醇-抗坏血酸(AsA,VitaminC)代谢途径的新机制。在番茄果实成熟过程中，细胞核中的WHIRLY1(WHY1)转录因子能够通过抑制EIN3-like2(EIL2)的表达解除EIL2对番茄红素环化酶(LYCB)表达的抑制效果，促进番茄红素向β-胡萝卜素的转变，呈现黄色果实的表型。另一方面，EIL2被抑制后，也解除了其对肌醇单磷酸酶(IMP，肌醇合成限速酶)及肌醇加氧酶(MIOX)的抑制，促进了肌醇途径合成维生素C的进行，增加了果实中维生素C的含量。这为通过生物工程提高番茄果实内源的番茄红素及抗坏血酸提供了可行性及理论基础。

进一步研究发现，WHY1能够直接结合到EIL2的启动子上抑制其表达。而EIL2能够直接结合到LCYB、IMP及MIOX的启动子上并抑制它们的表达。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：各转基因株系的获得及表型分析

1.实验方法：

1.1、WHY1及EIL2 RNAi株系的获得

通过BLAST分析分别获得WHY1和EIL2编码区特异的序列(https:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html数据库，WHY1的编号为Solyc05g007100，EIL2的编号为Solyc01g009170)，并将该序列扩增连入PC336植物RNAi干扰载体(山东农业大学提供)中。通过https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/设计的Crisper Cas9的靶点序列并将其构建到PYAO表达载体(中国科学院遗传与发育生物学研究所)上。上述载体通过冻融法转化到农杆菌菌株LBA4404，而后以农杆菌介导的叶盘法转入番茄(Micro-TOM)，获得WHY1及EIL2的RNAi沉默株系以及WHY1的突变体株系。获得的株系用qRT-PCR检测其表达量。

1.2、WHY1与EIL2 RNAi杂交株系的获得

以EIL2 RNAi株系作为母本，WHY1 RNAi株系作为父本进行番茄的杂交。在EIL2RNAi株系花瓣未展开前去除其雄蕊，将WHY1 RNAi株系的花粉涂在EIL2 RNAi株系的柱头上后套袋。获得的株系用qRT-PCR检测其表达量。

1.3、各株系的表型观察和生理指标的测定

抗坏血酸含量的测定均采用北京索莱宝公司相关的试剂盒。武汉迈维代谢公司提供了番茄果实代谢组的分析。

2.种植方式：番茄(Micro-TOM)在温室中种植，日照时间为16小时，黑暗培养8小时，培养温度为常温25℃，空气湿度为60-70％；温室地点在山东农业大学作物生物学国家重点实验室。

3.实验结果

结果见图1，A图显示WHY1 RNAi番茄株系(WR4)果实中WHY1的表达量远低于野生型株系(WT)；图B显示EIL2 RNAi番茄株系(ER1、ER2、ER3)果实中EIL2的表达量远低于WT；图C为WHY1与EIL2 RNAi杂交株系(W*E1、W*E2、W*E3)果实中EIL2及WHY1的表达量均低于WT；图D为各转基因番茄株系果实色泽的表型，以EIL2RNAi株系、WHY1与EIL2 RNAi杂交株系、WT、WHY1 RNAi株系的顺序红色逐渐加深。图E为各转基因番茄株系果实色泽的表型。图E为各转基因番茄株系果实中番茄红素含量的测定。测定结果与上述表型趋势一致。图F为各转基因番茄株系果实中抗坏血酸含量的测定，测定结果趋势与番茄红素变化趋势相反。图中的WC9和WC10表示WHY1的突变体株系。

上述试验结果表明，WHY1-EIL2调控途径参与了番茄果实中番茄红素代谢及抗坏血酸的合成。

试验还表明：EIL2能够促进脱落酸的生物合成(图2)，能够在果实不同的发育时期调节乙烯合成前体(ACC)及乙烯的含量(图3)。

实施例2：

1.实验方法：

1.1、酵母单杂交实验

分别将WHY1及EIL2编码区全长序列构建入GAD载体；将EIL2、LCYB、IMP、MIOX的启动子序列(编码区前约1900bp，分成两段；上述基因均记载在https:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html数据库中，具体为：Solyc05g007100(WHY1)、Solyc01g009170(EIL2)、Solyc04g040190(LCYB)、Solyc11g012410(IMP)、Solyc06g062430(MIOX))连入LacZ2u酵母表达载体。然后将构建好的WHY1-GAD+EIL2pro-LacZ、EIL2-GAD+LCYBpro-LacZ、EIL2-GAD+IMPpro-LacZ及EIL2-GAD+MIOXpro-LacZ分别转入酵母EGY48菌株。具体操作参照Zhuang et al.,(2019)。

1.2、荧光素酶(LUC)激活实验

分别将WHY1及EIL2编码区全长序列构建入pZP211-FLAG植物表达载体；将EIL2、LCYB、IMP、MIOX的启动子序列(编码区前约1800bp)连入pZP211-LUC植物表达载体。将构建好的WHY1-FLAG/-FLAG+EIL2pro-LUC、EIL2-FLAG/-FLAG+LCYBpro-LUC、EIL2-FLAG/-FLAG+IMPpro-LUC及EIL2-FLAG/-FLAG+MIOXpro-LUC分别转入农杆菌GV3101中后进行瞬时转化烟草实验。具体操作参照Zhuang et al.,(2020)。

2.种植方式：烟草(本氏烟)在温室中种植，日照时间为16小时，黑暗培养8小时，培养温度为常温25℃，空气湿度为60-70％；温室地点在山东农业大学作物生物学国家重点实验室。

3.实验结果

结果见图4，其中A图为WHY1-GAD与EIL2pro-LacZ的酵母单杂交实验。WHY1能够结合到EIL2启动子的P2区域。图B为EIL2-GAD与LCYBpro-LacZ的酵母单杂交实验。EIL2能够结合到LCYB启动子的P1及P2区域。图C为EIL2-GAD和IMPpro-LacZ的酵母单杂交实验。EIL2能够结合到IMP启动子的P2区域。图D为EIL2-GAD和MIOXpro-LacZ的酵母单杂交实验。EIL2能够结合到MIOX启动子的P2区域。图E为WHY1-FLAG与EIL2启动子的LUC激活实验。WHY1能够抑制EIL2的表达。图F为EIL2-FLAG与LCYB启动子的LUC激活实验。EIL2能够抑制LCYB的表达。图G为EIL2-FLAG与IMP启动子的LUC激活实验。EIL2能够抑制IMP的表达。图H为EIL2-FLAG与MIOX启动子的LUC激活实验。EIL2能够抑制MIOX的表达。

上述试验结果表明，WHY1能够直接结合到EIL2的启动子上抑制其表达。而EIL2能够直接结合到LCYB、IMP及MIOX的启动子上并抑制它们的表达。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 调控番茄果实品质的转录因子及其应用

<130> 2020

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 614

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Met Met Phe Glu Asp Ile Gly Phe Cys Ala Asp Leu Asp Phe Phe

1 5 10 15

Pro Ala Pro Leu Lys Glu Ala Glu Thr Val Ala Ala Val Pro Pro Ile

20 25 30

Val Pro Glu Pro Met Met Asp Asp Asp Asp Ser Asp Glu Glu Ile Asp

35 40 45

Val Asp Glu Leu Glu Lys Arg Met Trp Arg Asp Lys Met Lys Leu Lys

50 55 60

Arg Leu Lys Glu Met Ser Lys Gly Lys Glu Gly Val Asp Ala Val Lys

65 70 75 80

Gln Arg Gln Ser Gln Glu Gln Ala Arg Arg Lys Lys Met Ser Arg Ala

85 90 95

Gln Asp Gly Ile Leu Lys Tyr Met Leu Lys Met Met Glu Val Cys Lys

100 105 110

Ala Gln Gly Phe Val Tyr Gly Ile Ile Pro Glu Lys Gly Lys Pro Val

115 120 125

Thr Gly Ala Ser Asp Asn Leu Arg Glu Trp Trp Lys Asp Lys Val Arg

130 135 140

Phe Asp Arg Asn Gly Pro Ala Ala Ile Ala Lys Tyr Gln Ala Asp Asn

145 150 155 160

Ala Ile Pro Gly Lys Asn Glu Gly Ala Asn Pro Ile Gly Pro Thr Pro

165 170 175

His Thr Leu Gln Glu Leu Gln Asp Thr Thr Leu Gly Ser Leu Leu Ser

180 185 190

Ala Leu Met Gln His Cys Asp Pro Pro Gln Arg Arg Phe Pro Leu Glu

195 200 205

Lys Gly Val Ser Pro Pro Trp Trp Pro Asn Gly Gln Glu Asp Trp Trp

210 215 220

Pro Gln Leu Gly Leu Pro Asn Asp Gln Gly Pro Pro Pro Tyr Lys Lys

225 230 235 240

Pro His Asp Leu Lys Lys Ala Trp Lys Val Gly Val Leu Thr Ala Val

245 250 255

Ile Lys His Ile Ser Pro Asp Ile Ala Lys Ile Arg Lys Leu Val Arg

260 265 270

Gln Ser Lys Cys Leu Gln Asp Lys Met Thr Ala Lys Glu Ser Ala Thr

275 280 285

Trp Leu Ala Ile Ile Asn Gln Glu Glu Val Leu Ala Arg Glu Leu Tyr

290 295 300

Pro Asp Arg Cys Pro Pro Leu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Thr Phe

305 310 315 320

Thr Met Asn Asp Ser Ser Glu Tyr Asp Val Glu Gly Ala Ile Asp Asp

325 330 335

Pro Ile Phe Asp Val Gln Glu Gln Lys Pro Asn His Leu Ser Leu Leu

340 345 350

Asn Val Asn Val Glu Met Phe Lys Glu Lys Leu Pro Leu Leu Gln Gln

355 360 365

Ser Gln Pro Met Lys Gly Asp Ile Phe Ala Asn Leu Asp Phe Thr Arg

370 375 380

Lys Arg Lys Pro Ala Asp Asp Leu Thr Phe Leu Met Asp Pro Lys Thr

385 390 395 400

Tyr Thr Cys Glu Cys Leu His Cys Pro His Ser Glu Leu Arg Asn Gly

405 410 415

Phe Pro Asp Arg Ser Ser Arg Asp Asn His Gln Leu Thr Cys Leu Phe

420 425 430

Arg Asn Thr Ser Gln Phe Val Val Pro Asn Phe His Met Glu Glu Val

435 440 445

Lys Pro Val Val Phe Pro Gln Gln Tyr Ala Glu Pro Lys Arg Ala Ser

450 455 460

Leu Pro Val Asn Pro Ala Pro Pro Ser Phe Asp Thr Ser Gly Leu Gly

465 470 475 480

Val Pro Ala Asp Gly Gln Arg Val Ile Asn Glu Leu Met Ser Phe Tyr

485 490 495

Glu Ser Asn Val Gln Gly Asn Lys Ser Ser Met Ala Gly Asn Ser Val

500 505 510

Met Ser Lys Glu Gln Pro Leu Gln Gln Pro Ser Ile Gln Gln Asn Asn

515 520 525

Tyr Leu Gln Ser Gln Gly Asn Val Leu Glu Gly Ser Ile Phe Gly Asp

530 535 540

Thr Asn Ile Ser Ala Asn Asn Ser Met Phe Val Gln Gly Asp Arg Phe

545 550 555 560

Asp Gln Ser Lys Val Leu Thr Ser Pro Phe Asn Ala Ser Ser Thr Asp

565 570 575

Asp Phe Asn Phe Met Phe Gly Ser Pro Phe Asn Met Gln Ser Thr Asp

580 585 590

Leu Ser Glu Cys Leu Ser Gly Ile Ser His Asp Asp Val Thr Lys Gln

595 600 605

Asp Ala Ser Val Trp Tyr

610

<210> 2

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Val Phe Ser Leu Ser Ala Ser Pro Ala Ser Gly Phe Ser Leu

1 5 10 15

Asn Pro Thr Lys Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Phe Ser Ser Ser Ile Asn

20 25 30

Thr Ile Phe Ala Pro Leu Thr Ser Asn Thr Thr Lys Ser Phe Ser Gly

35 40 45

Leu Thr Tyr Lys Ala Ala Leu Pro Arg Asn Leu Ser Leu Thr Cys Arg

50 55 60

His Ser Asp Tyr Phe Glu Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gly

65 70 75 80

Ala Ser Thr Pro Lys Val Phe Val Gly Tyr Ser Ile Tyr Lys Gly Lys

85 90 95

Ala Ala Leu Thr Val Glu Pro Arg Ser Pro Glu Phe Ser Pro Leu Asp

100 105 110

Ser Gly Ala Phe Lys Leu Ser Lys Glu Gly Met Val Met Leu Gln Phe

115 120 125

Ala Pro Ala Ala Gly Val Arg Gln Tyr Asp Trp Ser Arg Lys Gln Val

130 135 140

Phe Ser Leu Ser Val Thr Glu Ile Gly Ser Ile Ile Ser Leu Gly Ala

145 150 155 160

Lys Asp Ser Cys Glu Phe Phe His Asp Pro Asn Lys Gly Arg Ser Asp

165 170 175

Glu Gly Arg Val Arg Lys Val Leu Lys Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly

180 185 190

Ser Gly His Phe Phe Asn Leu Ser Val Gln Asn Lys Leu Ile Asn Leu

195 200 205

Asp Glu Asn Ile Tyr Ile Pro Val Thr Lys Ala Glu Phe Ala Val Leu

210 215 220

Val Ser Ala Phe Asn Phe Val Met Pro Tyr Leu Leu Gly Trp His Thr

225 230 235 240

Ala Val Asn Ser Phe Lys Pro Glu Asp Ala Ser Arg Ser Asn Asn Thr

245 250 255

Asn Pro Arg Ser Gly Ala Glu Leu Glu Trp Asn Arg

260 265

<210> 3

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgatgatgt ttgaagacat tgggttttgt gctgatcttg atttcttccc tgctccgctg 60

aaggaggcgg aaacagtagc tgctgttcca ccaattgtgc cggagccgat gatggatgat 120

gatgatagtg atgaggagat cgatgtggat gagctggaga agaggatgtg gagggataag 180

atgaagctga aaaggctgaa agaaatgagc aagggcaagg aaggtgttga tgctgtcaaa 240

caacgccagt ctcaggagca agctaggagg aagaagatgt ccagggctca agatgggatc 300

ttgaagtaca tgttgaagat gatggaagtc tgtaaggctc agggttttgt ttatggaatt 360

atcccggaga aaggcaaacc ggtgactggg gcatcggata atctcaggga gtggtggaag 420

gataaagtga ggtttgatcg caatggacct gctgcgatag caaagtacca agctgacaat 480

gccatccctg gcaagaacga gggtgctaat ccgattggtc caacccctca taccttgcag 540

gagcttcaag ataccaccct tggttctcta ctgtcagctt taatgcaaca ttgtgatcct 600

cctcagaggc gatttccatt ggaaaaaggt gtatcacctc catggtggcc aaatggacag 660

gaggattggt ggcctcagtt gggactgcca aatgatcaag gtcctccacc ttacaagaag 720

cctcatgatc tgaagaaggc ttggaaggtt ggtgtcctca cagcggtgat caagcacatc 780

tcccctgata ttgctaagat acgcaagctg gtaaggcaat cgaagtgctt gcaggataag 840

atgacagcaa aggaaagtgc aacttggctt gccatcatca atcaggagga agttttggct 900

cgcgaacttt atcctgatcg ctgtccacct ttgtcctcag gtggtagtag tggaaccttc 960

actatgaacg acagcagtga gtatgatgtt gaaggtgcta ttgatgaccc tatctttgat 1020

gttcaagagc aaaaaccaaa ccatctcagt ttgctgaatg tcaatgttga gatgttcaag 1080

gagaagctgc ctctgctaca gcagtctcag ccaatgaagg gtgacatttt tgccaactta 1140

gatttcactc gcaagaggaa gccggctgat gacttgactt tcctgatgga tccgaagaca 1200

tatacttgcg agtgtcttca ttgccctcat agtgagcttc gcaatggttt tccagacaga 1260

tccagcagag acaatcatca gctaacttgc ctcttcagga atacttctca atttgtagtt 1320

ccaaactttc acatggagga ggtcaagcca gttgtcttcc ctcaacagta tgctgagcca 1380

aagcgggctt cgcttccggt caacccagct ccaccctcct ttgatacatc tggacttggg 1440

gttcctgcag atgggcagag ggtgatcaat gagcttatgt cattctatga aagtaatgtg 1500

caaggaaaca aaagttcaat ggcggggaac tctgtgatgt ccaaagagca gcctcttcaa 1560

caacctagca ttcaacagaa caattacctt caaagccaag ggaatgtgtt ggagggaagc 1620

atctttgggg acaccaacat ttctgctaac aactccatgt ttgtgcaggg tgatcggttt 1680

gatcagagca aggttttaac ttcaccattc aatgcaagct ctactgatga tttcaatttc 1740

atgtttggat ctccattcaa catgcaatcc actgatctct ctgaatgtct ttctgggatt 1800

tcacatgatg acgtgacgaa gcaagatgcc tcggtttggt actag 1845

<210> 4

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtctgtct tctctctttc tgcttcccct gcttcaggtt ttagtctaaa ccctactaaa 60

acctcttctt atctctcttt ttcctcttcc attaatacca tttttgctcc tttaacttcc 120

aacacaacaa aaagcttttc tggtttgacc tataaagcag ctttgcctag aaatctttct 180

ttaacatgtc gccattctga ttattttgaa ccccaacagc aacagcagca gctacagggg 240

gcatctacgc ctaaggtttt tgttggatac tcaatataca aagggaaggc agctctcact 300

gtggagcctc ggtcaccaga gttctcacct ttagattcag gggccttcaa gctgtcaaaa 360

gagggtatgg tgatgcttca atttgcaccc gctgctggtg ttcgtcaata tgattggagt 420

agaaagcagg tcttctcgct gtcagtgact gaaattggat ctatcatcag ccttggggca 480

aaagattcat gtgagttttt ccatgatcca aacaaaggaa gaagtgatga aggtagagtc 540

aggaaagtgt tgaaggttga gccacttcca gatggctccg gtcacttctt taatctcagt 600

gttcagaaca agcttattaa tttggacgag aacatttaca tcccagttac aaaggcagag 660

ttcgcagttc ttgtctccgc attcaatttt gttatgccat accttttagg ttggcacact 720

gctgtaaatt ccttcaagcc tgaagacgcc agtcgctcaa acaatactaa tccaagatca 780

ggtgctgaac ttgaatggaa tcgatag 807