牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用
阅读说明：本技术 牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用 (Specific detection antigen of echinococcosis granulosus of cattle and application thereof ) 是由 陈启军 杨娜 姜宁 丁莹莹 桑晓宇 冯颖 陈冉 王新一 于 2020-04-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用,所述牛细粒棘球蚴病的特异性抗原是如下(a1)或(a2)的蛋白质：(a1)氨基酸序列如SEQ ID.1所示的蛋白质；(a2)将(a1)限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加,具有丝氨酸蛋白酶抑制剂作用且可与牛细粒棘球病血清抗体特异性结合的蛋白质。本发明表达了Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein重组蛋白,并作为试纸条检测线包被抗原；同时,通过时间分辨荧光免疫层析技术结合了免疫标记和免疫层析的特点,以时间分辨荧光微球作为示踪物,制备免疫层析试纸条在临床上操作简单、诊断快速、灵敏度高、特异性强。(The invention discloses a specific detection antigen of echinococcosis granulosus of cattle and application thereof, wherein the specific antigen of echinococcosis granulosus of cattle is a protein (a1) or (a2) as follows: (a1) protein with amino acid sequence shown as SEQ ID.1; (a2) and (b) a protein which has the serine protease inhibitor effect and can be specifically combined with the bovine granulomatosis serum antibody by substituting and/or deleting and/or adding one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein defined in (a 1). The invention expresses the Kazal-type serine protease inhibitor domain-conjugation protein recombinant protein and is used as a test strip detection line coating antigen; meanwhile, the time-resolved fluorescence immunochromatography technology is combined with the characteristics of immune labeling and immunochromatography, and the time-resolved fluorescence microspheres are used as tracers to prepare the immunochromatography test strip which is simple to operate clinically, rapid in diagnosis, high in sensitivity and strong in specificity.)
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用。
背景技术
细粒棘球蚴病为一种严重的全球性的人畜共患病，人或反刍动物主要通过误食了细粒棘球绦虫排出的虫卵而发病，被称为“虫癌”。目前，关于细粒棘球蚴病诊断技术的研究投入较少，最常用的诊断方法就是解剖查看虫体检查，随着分子技术和免疫技术的发展，现在有分子诊断，比如LAMP，免疫学诊断，如ELISA试剂盒法、胶体金等，但从临床应用发现，这些方法检测的准确性不高、方便性不强，无法便于基层工作者操作检测。动物感染细粒棘球蚴时，传统的诊断方法为屠宰时诊断，然而，在屠宰过程中，典型的囊状组织也许是炎性导致的肉芽肿，导致诊断错误；血清学诊断包括胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附试验。这些方法通常使用的是天然棘球囊液，但使用天然棘球囊液的缺点是易于其他患病动物的血清发生交叉反应，制备昂贵且难以进行商品化。虽然，细粒棘球蚴病在人类诊断方面已有很多研究，但在诊断动物方面的研究甚少，且动物在自然感染该病时，抗体反应不明显，易导致诊断错误。因此提高细粒棘球蚴的免疫诊断，寻找一种可靠的抗原，建立一种高效、准确、特异性好而又简便的诊断技术至关重要。
发明内容
为此，本发明提供一种牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
蛋白质，如下(a1)或(a2)的蛋白质：
(a1)氨基酸序列如SEQ ID.1所示的蛋白质；
(a2)将(a1)限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂作用且可与牛细粒棘球病血清抗体特异性结合的蛋白质。
编码上述所述的蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子是编码所述的蛋白质的基因，所述基因是如下任一所述的DNA分子：
(b1)编码序列如SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述的蛋白质的DNA分子；
(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码权利要求1所述的蛋白的DNA分子。
上述所述的蛋白质在制备检测牛细粒棘球蚴病的免疫层析试纸条中的应用，其中，所述试纸条包括底板、以及位于所述底板上依次固定连接样品垫、结合垫、设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，所述检测线靠近所述结合垫一端，所述质控线靠近所述吸水垫一端，所述检测线处包被有权利要求1所述的蛋白质；
所述结合垫上包被有微球标记的抗牛IgG的抗体；
所述质控线处包被有兔抗山羊IgG抗体。
所述检测抗原为在SEQ.ID.1所示的氨基酸序列的氨基末端添加6个组氨酸的蛋白。
所述检测线处抗原蛋白质的包被浓度为1mg/mL。
本发明具有如下优点：
本发明表达了Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein重组蛋白，并作为试纸条检测线包被抗原；同时，时间分辨荧光免疫层析技术结合了免疫标记和免疫层析的特点，以时间分辨荧光微球作为示踪物，制备免疫层析试纸条在临床上操作简单、诊断快速、灵敏度高、特异性强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein-pGEX-4T-1重组质粒双酶切验证电泳图；
图2为本发明的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein-GST重组蛋白质SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明的Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein-GST重组蛋白质Western-blot鉴定图；
图4为本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图，其中：1-PVC底板；2-样品垫；3-结合垫；4-吸水纸；5-硝酸纤维素薄膜；6-检测线T；7-质控线C；
图5为本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的特异性检测结果图，其中：1-牛细粒棘球蚴病阳性血清，2-牛肝片吸虫病阳性血清，3-牛脑包虫病阳性血清；
图6为本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的特异性检测结果图，其中：1-4：血清依次按1:500、1:1000、1:2000、1:4000稀释；5为样品稀释液。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein重组蛋白的制备
1、pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein表达载体的构建
Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein隶属于SPI家族，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用，该蛋白在机体内起到调节炎症反应、先天性免疫和抗菌防御的作用。该Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
构建原核表达载体pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitordomain-containing protein。该表达载体是由上海生物技术有限公司合成，并对该表达载体进行双酶切验证。
双酶切的步骤如下：
(1)将装有目的基因的表达载体冻干粉的离心管3000rpm/常温离心1min。
(2)用50μL无菌ddH2O溶解冻干粉，之后用涡旋仪轻轻混匀，掌上离心机瞬离30s。
(3)用NANODROP测浓度。
(4)用限制性内切酶BamHⅠ和NotI双酶切表达载体质粒pGEX-4T-1-Kazal-typeserine protease inhibitor domain-containing protein，双酶切体系表如表1所示，反应条件为37℃/10min。
表1
pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitor domain-containingprotein重组表达质粒，目的基因为756bp，用BamHI/NotI限制性内切酶酶切后鉴定，其双酶切验证结果如图1所示。
将构建的原核表达载体pGEX-4T-1-Kazal-type serine protease inhibitordomain-containing protein转入BL21(DE3)表达感受态中，进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后，进行蛋白大量诱导表达，利用20mM还原性谷胱甘肽洗脱与蛋白结合后的Gluthathione-Sephgrose-4B，进而获得高纯度的重组抗原。
2、蛋白质表达纯化
1)、双酶切验证过后，将重组质粒转化表达感受态
(1)取50μL冰浴完毕的BL21(DE3)放入1.5mL无菌离心管中，置于冰盒中融化(切勿用手搓化)，用移液器吸取5μL表达质粒加入其中，在冰上静置30min。
(2)冰浴后，用浮漂将离心管放入水浴锅42℃热激45s，然后，将管转移到冰上，冰浴2min。
(3)在无菌超净台内，在每个离心管中加400-500μL无菌液体LB培养基，220rpm，在37℃摇床培养1h。
(4)先将对应抗性的LB固体平皿置于37℃预热，待平皿内的水蒸气完全挥发后取出备用。
(5)根据实验需求，吸取适量转化之后的感受态细胞，呈散点似的滴加在预热好的平皿中，均匀涂布感受态细胞，放入37℃培养箱。
(6)在37℃恒温培养箱中过夜培养。
2)Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein-pGEX-4T-1的GST标签重组蛋白质的小量诱导表达步骤：
(1)用无菌白枪头挑取转化后BL21(DE3)的单个菌落，PCR鉴定正确后，接种于10mL含有相应抗性的液体LB培养基，200rpm，37℃恒温培养箱，过夜培养。
(2)次日，在无菌操作台中保菌后，用移液器吸取100μL的菌液接种于10mL含有相对抗性的液体LB培养基中，37℃，200rpm条件下培养，当菌液OD600nm＝0.6-0.8时，可加入IPTG诱导。
(3)加蛋白诱导剂前，在无菌操作台中，吸100μL未诱导全菌，作为阴性对照。之后，加入0.1M IPTG诱导剂，使IPTG终浓度为0.1mM、0.3mM、0.6mM，在不同的温度进行诱导(16℃、22℃、32℃)。
(4)集取16℃低温培养22h、22℃培养18h、32℃恒温培养8h的菌液，收集好的菌液置于15mL除酶管中，在4℃离心机4000rpm离心15min，弃掉上清，菌体沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取50μL菌液作为诱导后全菌样品，余下的菌液用小型超声破碎仪破碎，仪器的破碎功率为25w，超声2s，停歇3s，观察菌体清澈即可，破碎后的菌液置于1.5mL EP管中，在4℃离心机中5000rpm离心10min，取100μL上清(诱导后上清)后，弃掉上清，沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取100μL作为诱导后沉淀。
(5)将不同温度和不同IPTG浓度下的上清、沉淀、全菌，分别加入20μL1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮10min后，取出备用。
(6)将制备好的不同温度和不同IPTG浓度的全菌、上清、沉淀的蛋白样品，各取10μL加样于10％SDS-PAGE蛋白胶电泳中，蛋白电泳槽的设置功率为：电压150V，时间50min。
(6)将切好的蛋白胶放入预先倒入G250-考马斯亮蓝染色液的蛋白染色盒中，在水平摇床上摇晃20min。
(7)将染色完毕的蛋白胶，放入脱色液中，过夜脱色后，用照胶仪观察重组蛋白的表达情况，同时确定转入表达感受态目的基因是否表达、表达量以及表达形式为可溶性存在于上清中还是包涵体存在于沉淀中。
3、Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein-pGEX-4T-1的GST标签重组蛋白质的大量表达与纯化
甘油保菌交叉划线于带有Amp抗性的培养皿上，37℃恒温培养箱，过夜培养，参照GST标签小量诱导表达步骤：
(1)提前30min冷却机设置为3℃预冷，启动高压破碎仪，等待气压缓冲完毕后，用75％酒精、ddH2O、PBS依次通过破碎管，两遍后，排气、排废液。
(2)根据菌体沉淀量，加入适量的PBS，用涡旋器将菌体沉淀完全重悬，倒入高压破碎管中反复破碎3-4次后，用超高速4℃离心机，12000rpm离心5min，留取上清备用。
(3)将空纯化柱，先用PBS润洗两遍，留有少量的PBS，根据上清液的量，吸取适量的Glutathione SepHarose 4B，缓缓加入纯化柱中，待Glutathione SepHarose 4B完全下沉到底部时，打开底部开关，排出废液后，在使用5倍柱体积PBS过柱洗涤填料，共洗涤3遍。
(4)将步骤(2)收集的上清加入处理完毕后的Glutathione SepHarose 4B填料中，置于水平旋转仪上，4℃缓慢操作2h。
(5)将结合完毕后的上清与Glutathione SepHarose 4B的混合物倒入纯化柱中，待Glutathione SepHarose 4B完全沉淀后，打开底部开关，调整流速，待GlutathioneSepHarose 4B完全在纯化柱内时，过柱完毕。
(6)用无菌的PBS洗去未结合的杂蛋白，每次加入5mL，将Glutathione SepHarose4B轻轻用移液器吹起来，纯化柱稍倾斜旋转1-2min后，待Glutathione SepHarose 4B完全在纯化柱底部时，打开开关使PBS流尽，洗6遍。
(7)首先加入1mL的GST洗脱液，将Glutathione SepHarose 4B轻轻用移液器吹起来，纯化柱稍倾斜旋转1-2min后，收集洗脱液。其次在加入2mL的GST洗脱液，重复前面的步骤，收集洗脱液。NANODROP测最后一次洗脱液浓度后，决定是否要进行第三遍洗脱。
(8)将纯化完成的目的蛋白质、洗杂液、洗脱后的Glutathione SepHarose 4B进行SDS-PAGE蛋白电泳。
4、Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein-pGEX-4T-1的GST标签重组蛋白质的Western-blot鉴定
(1)SDS-PAGE电泳跑胶
(2)根据蛋白胶的大小，裁剪适当大小的PVDF膜，并用甲醇激活2min，将定性滤纸剪成合适大小，浸泡在转膜液中，赶出滤纸与滤纸间的气泡，转膜时，夹子的黑面水平放在下面，上面依次为吸水网-3层定性滤纸-蛋白胶-PVDF膜-3层定性滤纸-吸水网，确保无气泡后，将夹子合上，放入转膜槽内，并且夹子的黑面对转膜槽的黑面，夹子的透明面对转膜槽的红面，检查好正负极，开始转膜，设置的功率为：电流200mA，时间为85min。
(3)转膜后，将PVDF膜放入提前配制完毕的含有封闭液(5％脱脂奶)的塑料盒中，放入37℃培养箱中，摇床上摇动封闭1h。
(4)用含有GST-tag单抗(1:10000)的5％脱脂奶封闭，4℃孵育过夜。
(5)PBST洗膜，每次5min，洗4次。
(6)用PBST稀释AP山羊抗小鼠IgG 1:15,000稀释，37℃孵育50min。
(7)重复步骤(5)。
(8)配取适量的BCIP/NET显色试剂，进行避光显色2-3min，观察结果并扫描。
(9)Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein-pGEX-4T-1验证结果，如图2和图3所示，其中，图2为Kazal-type serine proteaseinhibitor domain-containing protein-GST重组蛋白质的SDS-PAGE电泳图，图3为Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein-GST重组蛋白质的Western-blot鉴定图。
实施例2、牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备
一、牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条试纸条的制备
如图4所示，本实施例提供的时间分辨荧光免疫层析试纸条包括PVC底板以及位于PVC底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜5、吸水垫。其中，硝酸纤维素膜的一端与结合垫一端叠压，硝酸纤维膜的另一端与吸水纸的一端叠压，样品垫的一端与结合垫的另一端叠压；结合垫上包被有荧光微球标记的山羊抗牛IgG抗体，硝酸纤维素薄膜上靠近结合垫一侧设检测线6，靠近吸水垫的设有质控线7，检测线6上包被有Kazal-type serineprotease inhibitor domain-containing protein重组抗原，质控线上包被兔抗山羊IgG二抗。取75μL用样品稀释液稀释后的血清待检样本，滴加在样品垫加样孔内，待15min后，用紫外灯照射试纸条观察结果，如果滴加待检样品后检测线和质控线均显色，证明该样品为阳性；如果滴加待检样品后只有质控线显色，证明该样品为阴性。
其中，时间分辨荧光微球标记山羊抗牛IgG抗体过程为：
取100μL时间分辨荧光微球加入适量的EDC，放置于涡旋振荡仪振荡混匀后，室温孵育30min。所需用量的山羊抗牛IgG抗体，用0.01M磷酸盐缓冲液定容至500μL，混合均匀后加入处理好的时间分辨荧光微球中，立即振荡混混匀，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h。上述反应完成后，加入2％BSA，置于旋转混合仪，室温避光孵育1h。12000rpm离心20min。去除上清，得到的浓缩的山羊抗牛IgG抗体，加入适量的时间分辨荧光微球工作液，放入4℃密封避光保存。
二、确定牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条最佳检测反应条件：
1、优化时间分辨荧免疫层析试纸条的前提条件
本实施例的试纸条的反应条件为：阳性样本和阴性样本的加样量均为75μL，其中，血清与稀释液的比例为1:2，其反应时间均为15min。其包被参数为0.75μL/cm，喷洒在硝酸纤维膜上进行抗原或者抗体的包被，形成检测线T线和质控线C线。
Kazal-type serine protease inhibitor domain-containing protein重组抗原包被量的确定：用三维喷金划膜仪在检测线T线喷涂1mg/mL的Kazal-type serineprotease inhibitor domain-containing protein重组抗原，分别制备成两组，每组为三张层析试纸条，即阳性样本组。其检测线C线分别喷涂1mg/mL、2mg/mL和3mg/mL的兔抗山羊IgG二抗。以相同的包被参数在硝酸纤维膜上进行包被，形成检测线T线和质控线C线，放入温度45±1℃，湿度≤35％烘箱烘箱烘干16h。制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条。在荧光免疫分析仪上读取T线和C线的检测值，计算出T/C，以确定最佳的抗原抗体包被量。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
如表1所示，本发明的重组抗原包被量的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当兔抗山羊IgG浓度为2.0mg/mL时，是最适包被量。
表1
2、标记抗原浓度的确定
以相同标记方法，用处理好的时间分辨荧光微球分别标记不同量的山羊抗牛IgG，标记量分别为：25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL。以4倍的稀释浓度对其稀释，制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪上读取检测线T线和质控线C线的检测值，计算出T/C，以确定最佳的标记抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
如表2所示，标记重组抗原浓度的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当标记抗原山羊抗牛IgG浓度为50μg/mL时，是最适的结合垫标记浓度。
表2
3、荧光标记溶液稀释比例的确定
将标记好的荧光微球分别作2倍、4倍、8倍，3种稀释度稀释。制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪读取检测线T线和质控线C线的检测值，计算出T/C，以确定最佳的荧光标记溶液稀释比例。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
如表3所示，荧光标记溶液稀释比例的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现当荧光标记溶液稀释比例为4倍时，为最佳的荧光标记溶液最适稀释比例。
表3
4、荧光工作液的确定
按确定的荧光标记溶液稀释比例，选取合适的荧光微球悬浮液，其分为三组：第一组为：0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、0.05％BSA、0.05％Tween20，调至pH＝7.9；第二组为：0.01M磷酸盐缓冲液；第三组为：0.1MTris-HCl、0.1％BSA(5mL)、10％S9、10％Twen20、10％PEG12000、3g海藻糖。制备本发明的牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪读取T线和C线的检测值，计算出T/C，以确定最适的荧光工作液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
如表4所示，荧光工作液检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组荧光工作液时，为最佳的荧光工作液。
表4
5、样品垫处理液的确定
为了确保样品能更好的与结合垫中荧光微球标记的抗体结合，配制了三种样品垫处理液，分为三组。第一组为：1％BSA、0.1％Triton-100的、0.02mol/L的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液；第二组为：0.1M Na2B4O7·10H2O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN3，调至pH＝9.3；第三组为：0.5M硼酸缓冲液、1％TritonX-100、1％PVP、2％NaCl，调至pH＝9.0。制备牛细粒棘球蚴病时间分辨荧光免疫层析试纸条，在荧光免疫分析仪读取T线和C线的检测值，计算出T/C，以确定最适的样品垫处理液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
如表5所示，样品垫处理液检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组样品垫处理液时，为最佳的样品垫处理液。
表5
6、反应时间的确定
用移液器吸取75μL样本加入到150μL样本缓冲液内，充分混匀30s-60s，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待反应10min，15min，20min后分别进行读数。在荧光免疫分析仪读取T线和C线的检测值，计算出T/C，已确定最佳反应时间。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
如表6所示，反应时间的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现层析试纸条最佳反应时间为15min。
表6
7、样品缓冲液的确定
为了确保抗原抗体充分反应，摸索了三种样品稀释液，分成三组，分别为：第一组：pH＝7.8的0.02MTris-HCl、0.9％NaCl、0.1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN3；第二组：pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN3；第三组：pH＝7.8的PBS缓冲液。在荧光免疫分析仪读取T线和C线的检测值，计算出T/C，以确定最适的样品稀释液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。
如表7所示，样品缓冲液的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现第二组样品缓冲液为最佳的样品稀释液。
表7
8、样品稀释比例的确定
样本与样品缓冲液，分别按照下表8所示，样本与样品缓冲液稀释比例，进行混合，混合后的样本，滴加至检测卡加样孔中，在荧光免疫分析仪读取检测线T线和质控线C线的检测值，计算出T/C，以确定最适的样本稀释比例。
表8
如表9所示，样品稀释液的检测结果，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现最适的稀释比例为1:2(样品体积:样品缓冲液)
表9
试验实施例、本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条特异性、敏感性、准确性测定
1、本发明的时间分辨荧光微疫层析试纸条的特异性
对牛肝片吸虫病阳性血清、牛脑包虫病阳性血清样本进行检测，除牛细粒棘球蚴病的阳性血清外，在荧光免疫分析仪下，其他非牛细粒棘球蚴病原体的血清在T线均没有检测到信号，只有C线有出现一条带，即为阴性，结果如图5所示，其中，1-牛细粒棘球蚴病阳性血清，2-牛肝片吸虫病阳性血清，3-牛脑包虫病阳性血清。
2、本发明的时间分辨荧光层析试纸条的敏感性
将阳性血清行1:500、1:1000、1:2000、1:4000倍比稀释，分别将稀释好的样本滴加到样品垫中，15min后在荧光免疫层析下观测T线的荧光强度。结果显示当阳性血清稀释比例为1:2000时，可以清晰的看见T、C线，结果如图6，其中：1-4：血清依次按1:500、1:1000、1:2000、1:4000稀释；5为样品稀释液。
3、本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条的准确性
为了进一步验证时间分辨荧光免疫层析试纸条检测的有效性，用两种商品化ELISA试剂盒和该方法分别检测了50份牛细粒棘球蚴病的阳性血清和和50份健康牛血清，结果如表10，时间分辨荧光免疫层析试纸条与两种商业化ELISA试剂盒的比较结果，发现基于时间分辨荧光免疫层析试纸条的检出准确率更高。
表10
本发明的时间分辨荧光免疫层析试纸条特异性强、敏感性和准确性好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用
<130> GG20753254A
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Leu Ala Ala Lys Ser Met Val Gly Leu Phe Leu Leu Val Leu Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ser Ser Arg Glu Ser Asn Ala Glu Glu Ala Gly Glu Thr Pro
20 25 30
Leu Asp Val Cys Ala Ser Cys Asp Glu Ser Lys Cys Pro Pro Val Thr
35 40 45
Met Cys Pro Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Cys Gly Cys Cys Ser Val
50 55 60
Cys Gly Leu Glu Gln Gly His Arg Cys Asn Thr Arg Gln Glu Leu His
65 70 75 80
Asp Met Leu Ser Gly Arg Arg Arg His Gly Tyr Tyr Gly Ala Cys Gly
85 90 95
Lys Asn Leu Glu Cys Gln Pro Arg Thr Asp Val Asp Glu Gln Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Glu Asn Ile Cys Val Cys Thr Lys Pro Gly Arg Phe Cys Ala
115 120 125
Ser Asn Gly Glu Thr Tyr Ser Ala Cys Glu Leu Glu Ala Val Gln Ala
130 135 140
Lys Ser Phe Gly Glu Val Phe Leu Ile Ser Tyr Asp Asp Cys Lys Ser
145 150 155 160
Glu Pro Lys Ile Val Ala Ala Ser Glu Ser Gln Arg Val Pro Glu Gly
165 170 175
Asn Arg Thr Thr Phe Trp Cys Glu Ile Lys Gly Tyr Pro Leu Pro Thr
180 185 190
Val Thr Trp Tyr Tyr Phe Ala Pro Gly Gly Ser Tyr Glu Ala Ile Leu
195 200 205
Leu Pro Gly Asp Ser Asp Glu Met Ser Val Ser Leu Arg Gly Ala Pro
210 215 220
Pro Gly Arg Arg Ile Ile Ser His Leu Gln Ile Arg Arg Phe Asp Ile
225 230 235 240
Lys Tyr Glu Gly Ile Tyr Gln Cys Tyr Val Glu Asn Asp Leu Gly Ser
245 250 255
Asp Arg His Asn Ile Thr Ala Ile Tyr Ala Pro Pro Glu Pro Arg Pro
260 265 270
Arg Asp Leu
275
<210> 2
<211> 828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgctagccg ccaagtcgat ggttggcctc ttcctcctcg tcctcttcgc tctgagtagt 60
cgtgagtcta acgcagagga ggctggtgaa acaccgctgg atgtctgcgc gtcctgcgat 120
gagtcaaagt gtccccccgt gaccatgtgt cccgtgggag aggtaaaaga ctattgtggc 180
tgttgctcgg tctgcggctt agagcaggga catcgatgca atacgagaca ggaattacat 240
gacatgctct cgggcagacg acgtcacggc tactacggcg cctgcggcaa gaaccttgaa 300
tgtcagcctc gcactgacgt tgatgagcag tcactgggtg aggagaacat ttgcgtgtgc 360
accaagcccg gtcgtttctg cgccagcaac ggagaaacct actcggcttg tgagttggag 420
gccgtgcagg ccaagtcgtt tggtgaggta ttcctcatct cctatgacga ttgtaaatca 480
gagccgaaga ttgtagccgc atcggagtcg cagcgagttc ccgaaggaaa caggacaacc 540
ttctggtgcg aaatcaaggg ttatcccctt ccaacagtca cctggtatta ctttgctccc 600
ggtggatcat atgaggccat tctactcccg ggggactctg atgaaatgag tgtgagtctg 660
cgtggtgcgc caccgggacg tcgcataatc tcccacctgc agatccggag attcgacatc 720
aaatacgagg gcatctacca gtgctacgta gagaacgatc tcggaagtga ccgccacaat 780
atcaccgcca tctacgctcc accggagcct cggcctcgag atctctag 828