一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用

文档序号：1308581 发布日期：2020-08-11 浏览：3次 >En<

阅读说明：本技术 一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用 (Constitutive lactobacillus promoter, recombinant vector, recombinant bacterium and application thereof ) 是由金万洙于 2019-04-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用,属于基因工程领域。本发明提供的启动子PgapA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述启动子PgapA能够启动下游基因在乳酸菌中的高效表达,蛋白表达活性显著高于传统诱导型PNisinA的表达活性,是一种超高效启动子。本发明的启动子PgapA与目标基因其所组成的蛋白表达框,表达载体以及宿主菌可以用于肽类和蛋白类药物的口服药物递送,不仅在基因工程中具有良好的应用前景,还可以提高患者的服药依从性,有望产生可观的社会和经济效益。(The invention provides a constitutive lactobacillus promoter, a recombinant vector, recombinant bacteria and application thereof, and belongs to the field of genetic engineering. The promoter P provided by the invention gapA The nucleotide sequence of (A) is shown in SEQ ID No. 1. The promoter P gapA Can start the high-efficiency expression of downstream genes in lactic acid bacteria, and the protein expression activity is obviously higher than that of the traditional inducible P NisinA Is an ultra-efficient promoter. Promoters of the inventionThe protein expression frame, the expression vector and the host bacterium formed by PgapA and the target gene can be used for oral drug delivery of peptide and protein drugs, and the protein expression frame, the expression vector and the host bacterium have good application prospects in genetic engineering, can improve the drug administration compliance of patients, and are expected to generate considerable social and economic benefits.)

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用。

背景技术

随着生物技术的发展，很多活性多肽和蛋白质被开发成药物并应用于临床。用于治疗或诊断的多肽、蛋白质、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等药物不断出现，以红细胞生成素、干扰素和胰岛素为代表的近百种多肽和蛋白质药物已经在临床应用。与传统的化学合成药物相比，多肽和蛋白质药物具有作用靶点专一、体内作用明确、药效作用强、毒副作用少等优点，故在现代疾病的预防和治疗中的应用日益广泛。但针对免疫治疗的抗体等多肽和蛋白质由于分子量大、结构相对复杂和理化性质特殊，机体对其产生了多种屏障，如酸屏障、酶屏障和膜屏障，限制了这类药物的口服吸收。因此目前此类药物仍局限于静脉、皮下和肌肉注射等侵入式给药方式，导致生产、运输、储存成本高，并有传染疾病的风险，是其一大缺憾。

近年来，随着细菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富，以活体益生菌为递送载体的药物递送逐渐成为应用研究的一个热点。与传统抗体药物递送系统相比，益生菌口服药物递送系统具有以下优点：①益生菌在食品领域已被广泛应用，获取成本低，安全性高且无毒副作用；②重组益生菌制备而成的液态或固态菌剂可直接口服，无需注射，避免了注射部位的不良反应；③该口服递送系统不会产生耐药性，因此益生菌是一个十分良好的多肽和蛋白类药物的递送载体。然而目前现有技术存在蛋白表达效率低的问题，极大限制了该系统的应用。

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段关键DNA序列，对基因的表达具有重要的调控作用。研究表明，在控制基因表达的各种序列中，启动子所占的影响力超过45％，因此，筛选高活性的启动子对于提高基因的表达，实现以益生菌为载体的口服药物递送系统的临床应用至关重要。而目前，益生菌中启动子存在启动性能的问题，影响了益生菌递送载体治疗疾病的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明为了解决目前乳酸菌系统中蛋白表达量低的问题，提供一种超高效组成型乳酸菌启动子。同时基于所述组成型乳酸菌启动子，本发明还提供了包含所述启动子的重组载体及其重组菌和应用，重组载体或重组菌基于高效启动下游基因表达，可以用于蛋白类药物的口服药物递送，能够用于制备治疗多种疾病的药物。

本发明提供了一种组成型乳酸菌启动子，所述启动子的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示或为与序列表SEQ ID No.1所示的互补序列。

本发明提供了一种含有所述启动子的重组载体。

优选的，所述重组载体中基础载体为pNZ8149；

所述重组载体还包括目标基因；

所述目标基因为编码人源PD-1/PD-L1信号通路的抑制剂的序列和编码抑制PD-1/PD-L1信号通路和TGFβ/TGFβR2信号通路抑制剂的序列。

优选的，所述编码人源PD-1/PD-L1信号通路的抑制剂的序列包括人源PD-1胞外域结构蛋白的核苷酸序列或编码包含人源PD-1胞外域结构蛋白的融合蛋白的序列；

所述人源PD-1胞外域结构蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述编码包含人源PD-1胞外域结构蛋白的融合蛋白的序列为编码人源PD-1胞外域-人源TGFβR2胞外域融合蛋白的序列。

优选的，所述编码抑制PD-1/PD-L1信号通路和TGFβ/TGFβR2信号通路抑制剂的序列为编码人源PD-1胞外域-人源TGFβR2胞外域融合蛋白的序列。

优选的，所述编码人源PD-1胞外域-人源TGFβR2胞外域融合蛋白的序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明提供了一种含有优选的所述启动子或优选的所述重组载体的重组细胞。

优选的，所述重组细胞中基础细胞包括肠道正常菌；

所述肠道正常菌包括双歧杆菌属Bifidobacterium、乳杆菌属Lactobacillus或链球菌属Streptococcus。

本发明提供了所述启动子、所述重组载体或所述重组细胞在表达目标基因或合成代谢产物中的应用。

本发明提供了所述启动子、所述重组载体或所述重组细胞在制备蛋白质类或多肽类药物中的应用。

本发明提供了一种组成型乳酸菌启动子，首次发现并验证了该启动子的功能以及表达效率，实验表明所述启动子可以高效启动下游基因表达。与传统启动子P_NisinA相比，蛋白表达活性显著提高，是一种超高效启动子。本发明提供的启动子能够用于原核生物内源或外源蛋白的高效表达，在为以益生菌为递送系统的蛋白类药物口服药物的开发提供了有利工具。

附图说明

图1为采用不同种类启动子对人源PD-1胞外域蛋白进行表达的结果对比图，其中，图1-A为采用不同种类启动子表达人源PD-1胞外域蛋白编码基因的电泳图；图1-B为采用不同种类启动子表达人源PD-1胞外域蛋白编码基因表达量的柱形图；

图2为采用不同启动子对人源PD-1胞外域和人源TGFβR2胞外域融合蛋白表达的结果对比图；其中图2-A为采用不同启动子表达融合蛋白的电泳图，图2-B为采用不同启动子表达融合蛋白的表达量柱形图；

在上述附图中，*表示p<0.05。

具体实施方式

本发明提供了一种组成型乳酸菌启动子，所述启动子的核苷酸序列如序列表SEQID No.1所示或为与序列表SEQ ID No.1所示的互补序列。所述启动子的上述序列限定不应该理解为对所述启动子的限制，还包括与如SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列；所述启动子包括在如SEQ ID No.1所示序列的基础上经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列。本发明对所述启动子的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的启动子序列合成方法即可。在本发明实施例中，所述启动子委托上海生工生物工程有限公司合成。

本发明提供了一种含有所述启动子的重组载体。

在本发明中，所述重组载体中基础载体没有特殊限制，采用本领域所熟知的载体即可。为了保证后续应用的安全性，所述重组载体中基础载体优选为pNZ8149；所述pNZ8149为食品级质粒；所述重组载体中用上述启动子替换pNZ8149中原始启动子P_NisinA。

在本发明中，所述重组载体还包括目标基因。本发明所述包含所述启动子的重组载体可以用于表达任何目标基因。为了更好说明所述启动子能够高效表达基因，本发明用表达编码人源PD-1/PD-L1信号通路的抑制剂的序列和编码抑制PD-1/PD-L1信号通路和TGFβ/TGFβR2信号通路抑制剂的序列作为目标基因加以说明。

在本发明中，所述目标基因为编码人源PD-1/PD-L1信号通路的抑制剂的序列和编码抑制PD-1/PD-L1信号通路和TGFβ/TGFβR2信号通路抑制剂的序列。所述编码人源PD-1/PD-L1信号通路的抑制剂的序列优选包括人源PD-1胞外域结构蛋白的核苷酸序列或编码包含人源PD-1胞外域结构蛋白的融合蛋白的序列；所述人源PD-1胞外域结构蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述编码包含人源PD-1胞外域结构蛋白的融合蛋白的序列为编码人源PD-1胞外域-人源TGFβR2胞外域融合蛋白的序列；所述编码包含人源PD-1胞外域结构蛋白的融合蛋白的序列是抗体/抗体片段-因子融合蛋白的代表。所述PD-1胞外域结构蛋白还包括如SEQ ID No.2所示的类似物；所述类似物包括与如SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有至少70％同源性的核苷酸序列或在如SEQ ID No.1所示序列的基础上经修饰、取代、缺失或添加一个或几个核苷酸获得的核苷酸序列。所述编码抑制PD-1/PD-L1信号通路和TGFβ/TGFβR2信号通路抑制剂的序列优选为编码人源PD-1胞外域-人源TGFβR2胞外域融合蛋白的序列。所述编码人源PD-1胞外域-人源TGFβR2胞外域融合蛋白的序列优选如SEQ ID No.3所示。

在本发明中，所述重组载体的制备方法，优选为将启动子(P_gapA)核苷酸序列插入质粒的限制性酶切位点BstYI和NcoI处，形成重组载体pGapA；

当制备含有目标基因的重组载体时，优选在蛋白表达载体pNZ8149、pGapA限制性酶切位点SphI和XbaI限制性酶切位点之间插入了目标基因。

本发明提供了一种含有优选的所述启动子或优选的所述重组载体的重组细胞。

在本发明中，所述重组细胞中基础细胞优选包括肠道正常菌；所述肠道正常菌优选包括双歧杆菌属Bifidobacterium、乳杆菌属Lactobacillus或链球菌属Streptococcus。

在本发明中，所述双歧杆菌属Bifidobacterium包括青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。

所述乳杆菌属(Lactobacillus)包括的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentium)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)。

所述链球菌属(Streptococcus)包括嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)以及小牛葡萄球菌(Staphylococcus vitulinus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)。乳酸菌优选为L.1actisNZ3900。

在本发明中，所述重组细胞的制备方法包括将所述重组载体通过电转化的方法导入宿主细胞中，得到重组细胞。本发明对所述电转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的电转化方法即可。

本发明提供了所述启动子、所述重组载体或所述重组细胞在表达目标基因或合成代谢产物中的应用。

本发明对所述目标基因的种类和代谢产物的种类不做任何限制。

本发明提供了所述启动子、所述重组载体或所述重组细胞在制备蛋白质类或多肽类药物中的应用。

在本发明中，所述蛋白质类或多肽类药物的种类不做特殊限制。所述药物所治疗的疾病也没有任何限制，所述药物治疗的疾病种类包括代谢性疾病、癌症、感染性疾病、免疫类疾病、神经系统疾病所用的多肽和蛋白质药物；所述代谢性疾病优选选自糖尿病、肥胖、糖尿病肾损伤、糖尿病大血管病变、糖尿病微血管损伤、糖尿病性视网膜病变、胰高血糖素血症、坏死性游走性红斑、高血糖素瘤等代谢性疾病、冠心病、高血压性心脏病、瓣膜性心脏病、酒精性心肌病或糖尿病心血管并发症。所述癌症优选为肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，膀胱癌，结直肠癌，乳腺癌，黑色素瘤、神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌或头颈癌。所述感染性疾病优选为HIV病毒感染和病毒性肝炎病毒感染、狂犬性病毒感染或水痘。所述免疫类疾病优选为自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝纤维化、急性肺损伤、哮喘、炎症性肠病、牛皮癣、系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎。所述神经系统疾优选为癫痫、中风、亨廷顿舞蹈症、阿尔兹海默或帕金森疾病。

在本发明中，所述制备蛋白质类或多肽类药物是以益生菌为平台，利用携带有所述启动子的重组载体表达具有治疗效果的多肽或蛋白质，实现肽类或蛋白质类药物的口服药物递送。

所述药物递送系统的制备方法：包括以下步骤：

1)合成目标多肽或蛋白质的核苷酸序列；

2)将步骤1)合成的核苷酸序列插入所述含有启动子的载体中，构建重组表达载体；

3)将步骤2)的重组表达载体转化至肠道正常菌中；

4)将步骤3)得到的重组菌接种于培养基中培养表达。

或者，所述方法包括以下步骤：

1)合成启动子-目标多肽或蛋白质的核苷酸序列；

2)将步骤1)合成的核苷酸序列插入整合至肠道正常菌的染色体中；

3)将步骤2)得到的重组菌接种于培养基中培养表达。

在本发明中，所述药物组合物包含启动子-目标多肽或蛋白质的核苷酸序列表达框和宿主细胞。在本发明中，所述药物组合物优选为口服药物组合物；所述药物组合物优选包括药学上可用的载体和/或辅料。所述药物的剂型优选为胶囊或者其他可以接受的制剂。

下面结合实施例对本发明提供的一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

P_gapA启动子的克隆及含P_gapA启动子的载体pGapA的构建

以食用级别的蛋白表达载体pNZ8149(MoBiTec，Germany)为基础，改造构建得到食品级表达载体pGapA。食品级表达载体pNZ8149由于蛋白表达水平较低，一定程度上限制了其应用，为了解决该问题，将本实验室筛选到的强启动子P_gapA对pNZ8149上的诱导型启动子pNisin进行了替换，得到了具有较高表达水平的食品级蛋白表达载体，将其命名为pGapA。

首先，人工合成BstYI-P_gapA-NcoI的核苷酸序列(SEQ ID No.4：

ggatctaataaaaactccttaaacatttttagtaaaaaaaattgacactaaataaaaaaagtagtatcatttatattagagataagagatgtctccaataactataaattcattatttatattataccacagcagttgacctgaaacaatgtttcgtattacgaagagtgatatttgtagtagaaaaagagaaattctcatcatctaaataaaaaaacggaggactacatcccatgg，其中下划线处表示酶切位点)；其中，所述P_gapA为乳酸菌组成型启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(aataaaaactccttaaacatttttagtaaaaaaaattgacactaaataaaaaaagtagtatcatttatattagagataagagatgtctccaataactataaattcattatttatattataccacagcagttgacctgaaacaatgtttcgtattacgaagagtgatatttgtagtagaaaaagagaaattctcatcatctaaataaaaaaacggaggactacatc)；在蛋白表达载体pNZ8149限制性酶切位点BstYI和NcoI之间插入了P_gapA。SEQ ID No.1由金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例2

sPD-1蛋白表达载体pNZ8149-sPD-1、PgapA-sPD-1的设计与构建

以人PD-1胞外域(sPD-1)为例，将sPD-1作为报告基因用来测试本发明启动子的活性。

首先，人工合成SphI-SPusp45-DDDDK-sPD-1-XbaI的核苷酸序列(SEQ ID No.5：gcatgctcatgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacagtgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgctgatactaattctgatttggaaatatcgtcgacttgtgatgctgacgatgacgataagccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgtaatctaga)。

其中，所述sPD-1为PD-1的胞外域，其为天然的人源PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(ccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgtaa)。

在蛋白表达载体pNZ8149、pGapA限制性酶切位点SphI和XbaI限制性酶切位点之间插入了sPD-1(SEQ ID No.2)。上述DNA由上海生工生物工程有限公司合成。

为了验证载体构建是否成功，把上述合成好的基因连接产物用电穿孔法转化到L.lactis NZ3900菌株感受态细胞(购自MoBiTec，)并采用Elliker选择培养基筛选阳性转化菌，培养筛选出的转化菌，从菌体中提取质粒，进行SphI和XbaI双酶切、PCR扩增、扩增产物测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符的质粒即为所构建的NZ3900L.Iactis分泌表达PD-1相同的胞外域结构蛋白菌株，根据载体的不同对应将其命名为：NZ3900-8149-sPD-1，NZ3900-pGapA-sPD-1。

具体方法如下：

1)人工合成SphI-SPusp45-DDDDK-sPD-1-XbaI的核苷酸序列；获得pUC57-sPD-1重组质粒；

2)将步骤1)合成的核苷酸序列插入到pNZ8149、pGapA质粒中，构建pNZ8149-sPD-1、PgapA-sPD-1重组质粒，所述方法包括如下步骤

A.采用天根质粒小提试剂盒，提取pNZ8149、pGapA、pUC57-sPD-1质粒；

B.酶切；pNZ8149、pGapA、pUC57-sPD-1酶切体系如下表1所示；所述酶切体系的总体积为50μL，在37℃酶切3h；

表1酶切体系

C.回收；配制1％的琼脂糖凝胶电泳，120V电压下电泳30min；在609bp和2500bp处切胶回收；

D.连接；连接体系如下表2所示；所述酶连体系的总体积为20μl，插入片段：载体摩尔比＝7：1，16℃过夜；

表2连接体系

E.连接产物纯化回收

将制备好的连接产物中加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的2.5mol/L乙酸钠，混匀后于-20℃放置lh，12000r/min离心5min，弃上清；用1ml 75％乙醇沉淀一次，12000r/min离心5min，弃上清，室温干燥20min，用去离子水溶解沉淀。

3)将pNZ8149-sPD-1、pGapA-sPD-1电转化到乳酸乳球菌NZ3900中；

①乳酸乳球菌MG1363感受态制备

A.取-80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363(购自Mo Bi Tec)接种于5mL含有5％(g/100ml)葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；

B.将获得菌液按照1％体积比接种于含有2.5％(g/100ml)甘氨酸和5％(g/100ml)葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD₆₀₀值为0.3～0.4，收集备用；

C.将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；

D.将菌体用冰冷的10％(g/100ml)蔗糖和10％(体积比)甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集菌体；

E.最后菌体重悬于1/100体积的10％(g/100ml)蔗糖和10％(体积比甘油混合溶液中，冰浴10min后使用；

②乳酸乳球菌MG1363电转化

A.吸取40μL新鲜制备的感受态细菌悬液于冰冷的无菌EP管中，冰浴5min。

B.吸取1μl纯化后的表达载体加入感受态细菌，混匀后，置于冰上5min。

C.将细菌悬液和表达载体混合液加入冰冷的电转杯中，放入电击仪，设置条件为2500V，200Ω，25μF；

D.电击完毕后，迅速加入1ml冰冷的GM17-MC恢复培养基；混匀后转入EP管中冰浴5～10min；30℃培养2h。

E.取100μl恢复培养的菌液接种于Elliker选择培养基，30℃过夜培养，挑取黄色菌落进行鉴定。Elliker选择培养基的配制方法如下：称取胰蛋白胨2g(美国赛默飞)，酵母提取物0.5g(美国赛默飞)，氯化钠0.4g(北京化工)，无水醋酸钠0.15g(美国sigma)，抗坏血酸0.05g(美国sigma)，琼脂粉1.5g(北京奥博星)，定容至100ml。在121℃，灭菌20min后，待温度降至50～60℃，加入2.5ml20％乳糖(美国sigma)，1ml 0.4％溴甲酚紫(美国Sigma)配制得到。

③转化菌的验证

从培养的转化菌体中提取质粒，用SphI和XbaI双酶切，酶切产物用PCR扩增，所述PCR扩增引物为SEQ ID No.7(F:cttattgagaaagggaaacgacgg)和SEQ IDNo.8(R：tcaactgctgctttttggcta)；所述PCR扩增的反应程序：94℃，3min；{94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min 30s；}38个循环；72℃，5min。

将得到的扩增产物测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符的质粒即为所构建的NZ3900L.Iactis分泌表达PD-1相同的胞外域结构蛋白菌株，根据载体不同分别命名为：NZ3900-8149-sPD-1，NZ3900-pGapA-sPD-1。

实施例3：

PgapA-sPD-1蛋白表达载体的功能验证

为了验证pNZ8149-sPD-1、pGapA-sPD-1重组载体在乳酸菌中的表达能力，将实施例2中得到的重组菌株进行体外表达。

把NZ3900-8149-sPD-1，NZ3900-pGapA-sPD-1菌株在30度的M17肉汤培养基(称取21.125g M17肉汤培养基，溶于400ml蒸馏水中，用10mol/LNaOH调pH值至7.2，定容至500ml，高压灭菌，所用培养基购于北京奥博星生物技术有限责任公司)中培养过夜，之后收取菌液上清并沉淀，得到的上清蛋白用特异性PD-1抗体(ProSci，RF16002)进行Western Blot检测。具体方法如下：

Western Blot方法检测pNZ8149-sPD-1、pGapA-sPD-1重组载体在乳酸乳球菌中的分泌表达。

1、pNZ8149-sPD-1、pGapA-sPD-1在乳酸乳球菌中的诱导分泌表达

A.将菌株接入M17液体培养基中，30℃静置培养至OD600为0.4-0.6时，NZ3900-8149-sPD-1菌株加入25ng/ml的Nisin，NZ3900-pGapA-sPD-1菌株则继续培养。

B.培养5h后10000rpm离心20min，取上清，用0.22μm的过滤膜过滤上清，加入N-月桂酰肌氨酸钠至终浓度0.1％，室温15min；

C.加入三氯醋酸至终浓度7.5％，混匀，冰上2h；

D.10000rpm离心10min，弃上清，加入2ml四氢呋喃，10000rpm离心10min；

E.10000rpm离心10min，弃上清，加入2ml四氢呋喃，10000rpm离心10min；

F.弃上清，晾干，加入1ml 8molL尿素溶解。

2、电泳

A.配制12％SDS-PAGE凝胶

B.收集的蛋白样品中加入浓度5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃加热5～10min。

C.冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；80V电泳30min，120V电泳50min；

D.转膜，利用PVDF进行转印，电压100V，时间60min；

E.5％脱脂奶粉封闭1h；

F.PD-1抗体孵育过夜；

G.成像。

如图1-A所示，Nisin诱导后NZ3900-8149-sPD-1菌株中特异性表达PD-1胞外域蛋白，同时NZ3900-pGapA-sPD-1也特异性表达PD-1胞外域蛋白(泳道1是PNZ8149空载体重组菌株上清蛋白，泳道2是Nisin诱导后的PNZ8149空载体重组菌株上清蛋白，泳道3是pNZ8149-sPD-1重组菌株上清蛋白，泳道4是Nisin诱导后的pNZ8149-sPD-1重组菌株上清蛋白，泳道5是pGapA-sPD-1重组菌株上清蛋白)。此外，NZ3900-pGapA-sPD-1菌株表达量显著高于NZ3900-8149-sPD-1菌株，表达能力是NZ3900-8149-sPD-1菌株的2.22倍(如图1-B)。

实施例4

PgapA-sPD-TGFβR2蛋白表达载体的功能验证

为了进一步验证本发明提供的启动子是否具有普适性，以sPD-1-sTGFβR2融合蛋白为例再次进行了表达效率验证。

首先，人工合成SphI-SPusp45-DDDDK-sPD-1-sTGFβR2-XbaI的核苷酸序列(SEQ IDNo.6gcatgctcatgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacagtgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgctgatactaattctgatttggaaatatcgtcgacttgtgatgctgacgatgacgataagccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgggcggaggcggaagcggcggaggcggaagcggcggaggcggaagcacgatcccaccgcacgttcagaagtcggttaataacgacatgatagtcactgacaacaacggtgcagtcaagtttccacaactgtgtaaattttgtgatgtgagattttccacctgtgacaaccagaaatcctgcatgagcaactgcagcatcacctccatctgtgagaagccacaggaagtctgtgtggctgtatggagaaagaatgacgagaacataacactagagacagtttgccatgaccccaagctcccctaccatgactttattctggaagatgctgcttctccaaagtgcattatgaaggaaaaaaaaaagcctggtgagactttcttcatgtgttcctgtagctctgatgagtgcaatgacaacatcatcttctcagaagaatataacaccagcaatcctgacttgttgctagtcatatttcaataatctaga)。

其中，所述sPD-1为PD-1的胞外域，其为天然的人源PD-1/PD-L1信号通路抑制剂，所述sTGFβR2为人TGFβR2的胞外域部分序列，融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(atgaaaaaaaagattatctcagctattttaatgtctacagtgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgctgatactaattctgatttggaaatatcgtcgacttgtgatgctgacgatgacgataagccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctggtgggcggaggcggaagcggcggaggcggaagcggcggaggcggaagcacgatcccaccgcacgttcagaagtcggttaataacgacatgatagtcactgacaacaacggtgcagtcaagtttccacaactgtgtaaattttgtgatgtgagattttccacctgtgacaaccagaaatcctgcatgagcaactgcagcatcacctccatctgtgagaagccacaggaagtctgtgtggctgtatggagaaagaatgacgagaacataacactagagacagtttgccatgaccccaagctcccctaccatgactttattctggaagatgctgcttctccaaagtgcattatgaaggaaaaaaaaaagcctggtgagactttcttcatgtgttcctgtagctctgatgagtgcaatgacaacatcatcttctcagaagaatataacaccagcaatcctgacttgttgctagtcatatttcaataa)。

在蛋白表达载体pNZ8149、pGapA限制性酶切位点SphI和XbaI限制性酶切位点之间插入了sPD-1-sTGFβR2(SEQ ID No.3)。上述序列由金斯瑞生物科技有限公司合成。

如实施例2中的具体方法所示，通过电转化得到了NZ3900-8149-sPD-1-sTGFβR2，NZ3900-pGapA-sPD-1–sTGFβR2重组菌株，并通过实施例3中的方法对该菌株进行了蛋白诱导表达，之后进行WesternBlot实验，利用TGFβR2抗体(R&D，AF-241-NA)检测。

如图2-A所示，NZ3900-pGapA-sPD-1-sTGFβR2重组菌株可以特异性的表达该融合蛋白(泳道1是PNZ8149空载体重组菌株上清蛋白，泳道2是Nisin诱导后的PNZ8149空载体重组菌株上清蛋白，泳道3是pNZ8149--sPD-1-sTGFβR2重组菌株上清蛋白，泳道4是Nisin诱导后的pNZ8149--sPD-1-sTGFβR2重组菌株上清蛋白，泳道5是pGapA--sPD-1-sTGFβR2重组菌株上清蛋白)。与NZ3900-8149-sPD-1-sTGFβR2菌株相比，表达量提高了2.38倍(图2-B)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种组成型乳酸菌启动子、重组载体及其重组菌和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aataaaaact ccttaaacat ttttagtaaa aaaaattgac actaaataaa aaaagtagta 60

tcatttatat tagagataag agatgtctcc aataactata aattcattat ttatattata 120

ccacagcagt tgacctgaaa caatgtttcg tattacgaag agtgatattt gtagtagaaa 180

aagagaaatt ctcatcatct aaataaaaaa acggaggact acatc 225

<210> 2

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 60

ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 120

gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 180

gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240

cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300

tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360

gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420

aggccagccg gccagttcca aaccctggtg taa 453

<210> 3

<211> 1068

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60

ccgttgtcag gtgtttacgc tgatactaat tctgatttgg aaatatcgtc gacttgtgat 120

gctgacgatg acgataagcc aggatggttc ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc 180

cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg accgaagggg acaacgccac cttcacctgc 240

agcttctcca acacatcgga gagcttcgtg ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac 300

cagacggaca agctggccgc cttccccgag gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc 360

ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg 420

cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc 480

aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc 540

caccccagcc cctcacccag gccagccggc cagttccaaa ccctggtggg cggaggcgga 600

agcggcggag gcggaagcgg cggaggcgga agcacgatcc caccgcacgt tcagaagtcg 660

gttaataacg acatgatagt cactgacaac aacggtgcag tcaagtttcc acaactgtgt 720

aaattttgtg atgtgagatt ttccacctgt gacaaccaga aatcctgcat gagcaactgc 780

agcatcacct ccatctgtga gaagccacag gaagtctgtg tggctgtatg gagaaagaat 840

gacgagaaca taacactaga gacagtttgc catgacccca agctccccta ccatgacttt 900

attctggaag atgctgcttc tccaaagtgc attatgaagg aaaaaaaaaa gcctggtgag 960

actttcttca tgtgttcctg tagctctgat gagtgcaatg acaacatcat cttctcagaa 1020

gaatataaca ccagcaatcc tgacttgttg ctagtcatat ttcaataa 1068

<210> 4

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatctaata aaaactcctt aaacattttt agtaaaaaaa attgacacta aataaaaaaa 60

gtagtatcat ttatattaga gataagagat gtctccaata actataaatt cattatttat 120

attataccac agcagttgac ctgaaacaat gtttcgtatt acgaagagtg atatttgtag 180

tagaaaaaga gaaattctca tcatctaaat aaaaaaacgg aggactacat cccatgg 237

<210> 5

<211> 605

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcatgctcat gaaaaaaaag attatctcag ctattttaat gtctacagtg atactttctg 60

ctgcagcccc gttgtcaggt gtttacgctg atactaattc tgatttggaa atatcgtcga 120

cttgtgatgc tgacgatgac gataagccag gatggttctt agactcccca gacaggccct 180

ggaacccccc caccttctcc ccagccctgc tcgtggtgac cgaaggggac aacgccacct 240

tcacctgcag cttctccaac acatcggaga gcttcgtgct aaactggtac cgcatgagcc 300

ccagcaacca gacggacaag ctggccgcct tccccgagga ccgcagccag cccggccagg 360

actgccgctt ccgtgtcaca caactgccca acgggcgtga cttccacatg agcgtggtca 420

gggcccggcg caatgacagc ggcacctacc tctgtggggc catctccctg gcccccaagg 480

cgcagatcaa agagagcctg cgggcagagc tcagggtgac agagagaagg gcagaagtgc 540

ccacagccca ccccagcccc tcacccaggc cagccggcca gttccaaacc ctggtgtaat 600

ctaga 605

<210> 6

<211> 1082

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6