阅读说明：本技术 一种利用金针菇发酵产物合成纳米银的方法 (Method for synthesizing nano-silver by utilizing needle mushroom fermentation product ) 是由 陈磊 朱雨婕 代安然 杨崇婧 吴凡 李佳铭 于 2019-10-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用金针菇发酵产物合成纳米银的方法,属于生物纳米技术领域。本发明是将金针菇菌丝体进行液态发酵,发酵到一定阶段后,换为无营养成分发酵液,继续发酵,利用所得发酵产物,在一定温度条件下还原AgNO<Sub>3</Sub>生成稳定的纳米银溶液。本发明的方法工艺简单,易于操作,环境友好,具有潜在的工业化应用前景。(The invention discloses a method for synthesizing nano-silver by utilizing a needle mushroom fermentation product, belonging to the technical field of biological nano-technology. The invention carries out liquid fermentation on the flammulina velutipes mycelium, the flammulina velutipes mycelium is changed into nutrient-free fermentation liquor after being fermented for a certain period, the fermentation is continued, and AgNO is reduced by utilizing the obtained fermentation product under the condition of a certain temperature 3 And generating stable nano silver solution. The method has the advantages of simple process, easy operation, environmental protection and potential industrial application prospect.)

一种利用金针菇发酵产物合成纳米银的方法

技术领域

本发明涉及一种利用金针菇发酵产物合成纳米银的方法，属于生物纳米技术领域。

背景技术

纳米银是指粒径为1～100nm的金属银单质，具有独特的热、光、电和催化等性质，还具有普通的单质颗粒、无机颗粒、有机颗粒等没有的低毒性和高活性等特点，在发挥其生理功能的同时，对人体的危害性大大减少，从而避免了因摄入过多给人体带来的副作用。此外，纳米颗粒在抗细菌与真菌感染方面具有显著优势：1)银纳米颗粒以较小的浓度(3-7μg/mL)就可以起到抑菌效果；2)银纳米颗粒对于细菌与真菌具有广谱抗菌作用，其作用无显著差异(P>0.05)；3)与庆大霉素和新霉素两种常见抗生素相比，银纳米颗粒在抑制细菌和真菌方面具有明显的优势。

目前纳米材料的合成方式主要是化学法和物理法，这两种方法均存在一些缺点：物理法对仪器设备要求高，费用昂贵且耗能高；化学法则需要较多的还原剂，而这些还原剂价格昂贵，毒性强且污染严重。这一现状严重制约了纳米材料在生命及健康领域的推广和应用。纳米材料的生物合成近年来日益受到关注，如利用植物浸提液或植物提取剂等合成金或银的纳米颗粒，具有独特的生物活性，例如增强细胞活性，较强的抑菌能力等。而食用菌因具有独特的生物富集作用，也被视作重要的生物转化对象用于纳米材料的生物合成研究。金针菇作为一种常规栽培和日常食用真菌，用于合成纳米银的优势在于，材料来源广泛、价格低廉、反应条件温和可控，是一种清洁、无毒、环境友好、可持续发展的合成方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种合成纳米银的方法，利用金针菇(Flammulinavelutipes)液态发酵，将银离子转化为纳米银。

在一种实施方式中，所述方法利用金针菇菌丝体进行两阶段发酵，第一阶段在发酵培养基中进行液态发酵，第二阶段将液态发酵获得的菌丝体转移至无营养体系中继续发酵一定时间，将发酵产物置于含银离子的环境中合成纳米银。

在一种实施方式中，所述无营养体系含有无菌去离子水、PBS缓冲液、甲萘醌溶液、邻苯二甲酸二乙酯溶液或双氧水溶液。

在一种实施方式中，所述无营养体系含有无菌去离子水、pH 6.0～10.0的PBS缓冲液(0.1-1M)以及1-15μM甲萘醌溶液、0.1-10mM邻苯二甲酸二乙酯溶液或5-40mM、双氧水溶液中的任一种。

在一种实施方式中，所述发酵培养基含有：葡萄糖15～25g/L，酵母8～25g/L，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.5～1.5g/L，七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2～0.8g/L，VB₁ 0.1～1.0g/L。

在一种实施方式中，所述方法将所述金针菇接种至发酵培养基中，于22～28℃、130～180rpm发酵5～8d；再将菌丝经无菌水洗涤后转移至无营养发酵体系中，继续于22～28℃、130～180rpm培养2～5d。

在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)种子液的制备：将金针菇菌丝接种至种子培养基中，所述种子培养基含有：葡萄糖20g/L，酵母20g/L，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g/L，七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，VB₁0.5g/L；所述接种是将长满金针菇菌丝的PDA平板切成1×1cm²，每瓶接入5～10片，于25℃，160rpm摇床中培养7d；

(2)摇瓶发酵：将步骤(1)培养的种子液按照体积计接种2.5～5％至发酵培养基中，于25℃，摇床转速160rpm条件下发酵5～8d；

(3)后发酵：无菌过滤生长5～8d的金针菇发酵液，收集菌丝体，用无菌水洗涤菌丝3～5次，转移到无营养培养液中继续培养2～5d；

(4)合成纳米银：将步骤(3)的培养液抽滤，去除菌丝体并收集步骤(3)的发酵液，按体积比1:3～10:3添加至浓度为6mM的AgNO₃溶液中，分别在50～100℃温度范围内反应0～60min，合成纳米银。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所用于合成纳米银的无菌去离子水发酵液，使用前用醋酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH为6.0～14.0。

本发明还要求保护所述方法在制备含纳米银的产品方面的应用。

有益效果：本发明利用金针菇(F.velutipes)液态发酵产物高效合成稳定的纳米银溶液，纳米银产率可达到0.2～0.5mM(不同溶液体系有所差异)，该方法采用食用菌发酵工艺结合加热反应，反应条件温和、能耗低、无污染、操作简便，所制备纳米银溶液在催化剂材料、防静电材料、低温超导材料、电子浆料和生物传感器材料、生物医学等领域均具有潜在的工业化应用前景。

附图说明

图1为无菌水发酵液浓度对AgNPs合成效果的影响。

图2为反应生成产纳米银溶液的吸收波长。

图3为不同浓度发酵液在100℃产纳米银的能力。

具体实施方式

实施例1

(1)制备金针菇种子液，培养基为：葡萄糖20g/L，酵母20g/L，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1g/L，七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，VB₁ 0.5g/L。每个500mL摇瓶加培养基200mL，121℃高压灭菌20min后，将长满金针菇菌丝的PDA平板切成1×1cm²，每瓶接入5片，于25℃，160rpm摇床中培养7d。

(2)配制金针菇发酵培养基(配方与种子液一致)，500mL摇瓶中含190mL金针菇发酵液，灭菌冷却后，每瓶接入10mL种子液，于25℃，摇床转速160rpm条件下发酵7d后，将发酵液无菌过滤。用无菌水洗涤菌丝3次，转移到含200mL无菌去离子水的摇瓶(容量500mL)中继续培养3d。

(3)收集步骤(2)继续培养3d后的发酵液，抽滤，收集滤液，按表1所示比例加入发酵液及0.6mL浓度为6mM的AgNO₃溶液，并用去离子水补至总体积4mL(使反应体系中AgNO₃浓度为0.9mM)。样品加好后，于100℃沸水浴反应30min(图1)，扫描最大吸收波长为430nm(图2)，采用张家港耐尔纳米科技有限公司提供的纳米银标准品在相同条件下测定最大吸收波长，并绘制标准曲线，由比色法测定纳米银(AgNPs)含量。结果如表1所示，在滤液与AgNO₃溶液体积比1:3～10:3(即发酵液添加量为0.2～2.0mL)范围内，纳米银产量与发酵液添加比例成线性增加的关系(图3)。

表1无菌水发酵液还原硝酸银的添加量

实施例2

在实施例1的基础上，所用于合成纳米银的无菌去离子水发酵液，使用前用醋酸或氢氧化钠调节pH分别为6，7，9，11，采用2.0mL发酵液加0.6mL浓度为6mM硝酸银，补水至4mL，在100℃沸水浴中反应30min，合成纳米银。在pH 6～11的范围内，纳米银的产量为0.183～0.500mM，pH 6～7范围内纳米银产量显著提高(0.183～0.340mM)，pH 7～9范围内纳米银产量基本维持稳定(0.340～0.375mM)，pH 11时纳米银产量进一步提高至0.500mM。

实施例3

在实施例1的基础上，采用PBS缓冲液(1M，pH 7.4)代替无菌去离子水进行后发酵，以及纳米银合成。结果显示，在发酵液：6mM AgNO₃溶液＝1:3～10:3(体积比)范围内，纳米银产量随发酵液比例的增加呈线性升高的关系，其产量为0.017～0.456mM。继续增加PBS发酵液的比例，纳米银产量提高不显著。

实施例4

在实施例1的基础上，采用甲萘醌溶液(1～15μM)代替无菌去离子水进行后发酵，以及纳米银合成。结果显示，在5μM甲萘醌溶液体系下的纳米银产量可达0.242±0.011mM。

实施例5

在实施例1的基础上，采用邻苯二甲酸二乙酯溶液(0.1～10mM)代替无菌去离子水进行后发酵，以及纳米银合成。结果显示，在3mM邻苯二甲酸二乙酯溶液体系下的纳米银产量可达0.277±0.015mM。

实施例6

在实施例1的基础上，采用双氧水溶液(5～40mM)代替无菌水进行后发酵，以及纳米银合成。结果显示，在30mM双氧水溶液体系下的纳米银产量最高为0.358±0.026mM。

在实施例4～6的基础上，发明人还尝试过采用其它浓度的甲萘醌、邻苯二甲酸二乙酯、双氧水代替无菌水，由于这三种物质对菌体生长具有一定的毒害作用，在实施例4～6所列举的浓度范围之外的低浓度或更高的浓度，均会导致纳米银产率降低。

对比例

为了更好验证本发明中所采用的合成方法对纳米银产量的影响，我们进行了如下的对比试验。

对比例1：无菌去离子水发酵液：6mM AgNO₃溶液＝4:1(体积比)，其余条件均同本发明实施例1，纳米银产率为229.4±3.6mM，与实施例1相比没有显著增加；

对比例2：所用于合成纳米银的无菌去离子水发酵液，使用前用醋酸调节pH为1～5，其余条件均同本发明实施例2，纳米银产量低于0.050mM，极低的pH对纳米银生成起到了显著的抑制作用；

对比例3：采用PBS缓冲液(1M，pH 5.0)代替无菌去离子水进行后发酵，其余条件均同本发明实施例1，纳米银产量为0.024±0.003mM；

对比例4：采用甲萘醌溶液(20μM)代替无菌去离子水进行后发酵，其余条件均同本发明实施例1，纳米银产量为0.017±0.005mM；

对比例5：采用邻苯二甲酸二乙酯溶液(12mM)代替无菌去离子水进行后发酵，其余条件均同本发明实施例1，纳米银产量为0.009±0.002mM；

对比例6：采用邻苯二甲酸二乙酯溶液(15mM)代替无菌去离子水进行后发酵，其余条件均同本发明实施例1，纳米银产量为0.029±0.008mM。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。