作为药物发现的靶标的耳蝶呤质子通道
阅读说明：本技术 作为药物发现的靶标的耳蝶呤质子通道 (Otopterin proton channels as targets for drug discovery ) 是由 埃米莉·利曼 涂郁翔 于 2018-07-27 设计创作，主要内容包括：本文提出了包含耳蝶呤多肽的组合物和装置,及其用于鉴定通过耳蝶呤多肽或其功能部分的质子转位活性的调节剂的用途。(Presented herein are compositions and devices comprising an otopterin polypeptide, and uses thereof for identifying modulators of proton translocation activity by the otopterin polypeptide or functional portions thereof.)
相关专利申请
本专利申请要求于2017年7月27日提交的、将Emily Liman命名为发明人的、律师档案号No.043871-0452046指定的、名称为“OTOPETRIN PROTON CHANNELS AS TARGETS FORPHARMACEUTICAL DISCOVERY”的临时专利申请No.62/537,900的权益。前述专利申请的包括所有文本、表格和附图在内的全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本发明部分地是利用美国国立卫生研究院资助R01DC013741和R21DC012747下的政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
本发明的实施方案涉及用于鉴定耳蝶呤介导的(otopetrin-mediated)质子转位的调节剂的组合物和方法。
介绍
脂质双层是质子不可渗透的，质子进入和离开细胞的运动受到膜蛋白(包括离子通道)的严格控制。如本文所述，跨膜蛋白耳蝶呤1(Otop1)和某些相关的跨膜蛋白被鉴定为质子选择性离子通道。
附图说明
附图示出了本技术的实施方案，并且不是限制性的。为了清楚和易于图示，未按比例绘制附图，并且在某些情况下，可能以夸大或放大的方式示出了不同方面，以便于理解特定的实施方案。
图1-Otop1在爪蟾卵母细胞和HEK-293细胞中产生酸诱导的电流。图1a显示了响应于无Na+的细胞外溶液的pH值降低(Vm＝-80mV)通过TEVC在表达Otop1的爪蟾卵母细胞中测得的电流。图1b示出了图1a中电流的I-V关系。电压以1V/s的速度从-80mV上升到80mV。图1c显示了注射Otop1 mRNA(n＝4)并且未注射卵母细胞(灰色圆圈；n＝4)的爪蟾卵母细胞中的诱发电流(ΔI)的平均幅值(平均值±SEM)与pH的函数关系。图1d显示了在无Na+的溶液(Vm＝-80mV)中用Otop1转染的HEK-293细胞中通过全细胞膜片钳记录所测得的电流。图1e显示了在带有pHo的Otop1转染的HEK-293细胞中诱发的电流的I-V关系，如由电压升高(1V/s)的实验所示。图1f显示了在用Otop1(正方形；n＝5)转染的HEK-293细胞和未转染的细胞(灰色正方形；n＝3)中，诱发的电流的平均幅值(平均值±SEM)与pH的函数关系。图1g显示了用细胞质蛋白标签-RFP共转染的并且用共聚焦显微镜成像的Otop1和YFP的融合蛋白(YFP-Otop1)。线扫描(图1g，底部插图)显示YFP-Otop1在细胞表面富集。图1h显示了用pHrodo红(平均值±SEM，n＝9-11)测得的Otop1转染的细胞但不是假转染的细胞(sham-transfectedcells)，其对细胞外pH的变化和细胞内pH的大变化响应。3次重复获得相似的结果。通过2-尾t检验分析平均数据(平均值±SEM；n＝28-29个细胞)。****：p＜0.0001。HOAc作为阳性对照。
图2-Otop1的离子选择性和生物物理特性。图2a显示，在指示的时间，响应于用Na+、Li+或Cs+(各为160mM)或Ca2+(40mM)代替细胞外溶液中的NMDG+的低pH溶液所诱发的Otop1电流(Vm＝-80mV)。指示电流的平均百分比变化。图2b显示了在变化的细胞外pH值下，在最小化离子积累并允许分离Otop1电流的条件下(pHi＝6.0；显示了Zn2+敏感成分)，响应于电压斜坡(1V/s)而引起的Otop1电流。图2c显示了来自如图2b中的实验的Erev与ΔpH(pHi-pHo)的函数。红线表示对纯的H+选择性电导率的预测。通过线性回归对数据进行拟合，其中斜率为53mV/ΔpH并且Y截距为3.6mV(R2＝0.99)。图2d和图2e显示了在140mM NMDG+,4mM Cl-(Erev＝34.4±1.0,n＝5)；140mM Na+,4mM Cl-(Erev＝34.4±1.0,n＝5)；140mM Na+,20mMCl-(Erev＝33.8±1.0,n＝5)；或(d)140mM NMDG+,4mM Cl-(35.2±1.2,n＝5)；NMDG+,20mMCl-(35.5±0.5,n＝4)的存在下测得的Otop1电流(Zn2+敏感组分)。在任何条件之间，均无显著差异，通过ANOVA，p>0.05。图2f显示HEK-293细胞中的Otop1电流被Zn2+以剂量依赖性方式阻断(粉红色条，指示的浓度以mM为单位)。图2g显示的平均数据(平均值±SEM；n＝6-14)用希尔方程拟合，IC50为0.19mM，希尔系数为0.89。
图3-耳蝶呤编码各种物质中的质子通道。图3a显示了由13种耳蝶呤家族蛋白的多序列比对产生的最大似然系统树。比例尺为0.1个取代/位点。图3b显示了3个小鼠同源物(Otop1、Otop2和Otop3；左)之间以及在mOtop1和dmOTOPLc(右)之间的跨膜、胞质和细胞外域中的序列同一性。在哺乳动物蛋白中，TM结构域11是高度保守的，而在脊椎动物和无脊椎动物蛋白之间，TM结构域5是最高度保守的。在所有域中，TM域12是高度保守的。图3c和图3e示出了响应于不同的pHo在表达Otop2、Otop3(c)或dmOTOPLc(e)的爪蟾卵母细胞中诱发的电流。显示了代表性迹线(Vm＝-80mV)和I-V关系(来自1V/s的电压斜坡)。正如质子选择性离子通道所预期的那样，随着Otop3和dmOTOPLc的pHo降低，Erev向右移动。Otop2显示异常行为。图3d和图3f显示了每个通道的平均感应电流(ΔI)与pH的函数关系(黑圈；平均值±SEM，n＝3-7)。灰色三角形显示未注射的卵母细胞的反应(n＝3，平均值±SEM)。注意，ΔI和pH之间的关系在通道之间变化，其中mOtop3显示最陡的关系。
图4-在稳定Otop1电流的条件下测量Erev。图4a显示了电压和溶液交换协议，其被设计用于稳定Otop1电流并减少[H+]i的变化。将细胞内溶液调节至pHi＝6.0，并将Vm保持接近EH(pHo＝7.0时为-60mV，pHo＝5.5时为+30mV)，电压从-80mV升至+80mV，升幅为1V/s。显示了用Otop1转染的HEK-293细胞和未转染的细胞对pH5.5溶液(基于NMDG)的响应(去除了电容伪像)。请注意，在整个记录过程中，表达Otop1的细胞中响应pH5.5诱发的电流保持稳定。图4b示出了从如a中的实验获得的IV曲线。从Zn2+暴露之前的电流中减去响应于暴露于Zn2+之后的pH5.5引起的电流，从而得出纯的Otop1依赖性电流(3-4)，从中测量Erev。
图5-Otop1电流仅显示轻微的电压依赖性。图5显示了在暴露于pH5.5溶液之前和期间，爪蟾卵母细胞中响应于一系列电压阶跃(如图所示)的Otop1电流。右，在所示时间测得的平均数据(n＝4)。仅在达到-80mV的最大超极化电压阶跃时，电流幅值才会随时间变化。
图6-Otop2和Otop3形成向内传导质子通道。图6a和图6b示出了爪蟾卵母细胞中表达的Otop1和Otop2的Erev与pH的函数关系。红线显示Otop2和Otop3的数据在pH值5和6之间的线性拟合，其中斜率分别为20.7和46.3mV/log[H+]。虚线表示EH，假设pHi为7.2。图6b显示了爪蟾卵母细胞中在中性和酸性pH下Otop2和Otop3对超极化电压阶跃的响应，显示出最小至温和的电压依赖性门控。数据代表n>3个实验。请注意，我们始终观察到在pH7.4溶液中，表达Otop2的卵母细胞在0mV时有向外电流。这可能是由于质子通过通道向外移动所致。图6c显示了用pH指示剂pHrodo红监测到的，响应于具有或不具有乙酸的pH5溶液，用Otop2或Otop3转染或假转染的HEK-293细胞的细胞内pH的变化(平均值±SEM)。图6d显示了在响应的峰值处测得的来自如在c中的实验的平均数据(平均值±SEM)。通过2尾t检验确定显著性。***：P＜0.001。在3个重复实验中获得了相似的结果。
图7-HEK-293细胞中Otop2的生物物理特性。图7a显示了用全细胞膜片钳记录测得的转染的HEK-293细胞的Otop2电流。交换溶液，并如所示将膜电压从-80mV升至+160mV(1V/s)。图7b示出了来自(a)中所示的实验的IV关系。图7c示出了来自图7a和7b中的实验的Erev的平均值(平均值±SEM)。显示了数据在pH5和pH6之间的线性拟合，其斜率为25.3mV/log[H+]。还显示了爪蟾卵母细胞中Otop2的对应关系。
图8–人Otop1形成质子通道。图8进一步显示了Otop1形成质子通道的证据。图8a显示了响应于变化的外部pH在hOtop1转染的HEK293细胞中引发的电流。图8b示出了在pH为5.0时在转染和未转染的细胞中来自图8a中的实验的电流的平均幅值。图8c和图8d示出了用pH指示剂pHrodo红(平均值+/-SEM)测得的，响应于具有和不具有乙酸的pH5溶液，用hOtop2转染的或假转染的HEK293细胞的细胞内pH的变化。误差棒代表SEM。显著性由ANOVA计算。****：P<0.0001；在至少3个重复实验中获得了相似的结果。
图9–响应细胞外pH值变化，Otop1转染的HEK-293细胞中细胞内钙的升高。图9显示了用mOtop1转染的或假转染的HEK-293细胞的细胞内钙变化。转染的细胞加载有钙指示剂Fura2 AM，并暴露于细胞外pH从7.4到5.0的变化。图9(左图)显示只有Otop1转染的细胞有反应(n＝8个细胞)。两种细胞类型都对pH5的HOAc产生反应，其穿透细胞膜并引起细胞内酸化，从而通过从细胞内缓冲液中释放钙来提高细胞内钙。响应的峰值示于右图中。Otop1转染的细胞与假转染的细胞之间的差异是显著的(学生的t检验。***p<0.001)。
图10-响应不同的pH值的不同耳蝶呤的pHluorin成像。将HEK-293细胞用pHluorin和所示的耳蝶呤多肽或对照中的一者共转染(图10D，仅由pHluorin转染)。图10显示用Otop1(图10A)、Otop2(图10B)和Otop3(图10C)转染的HEK-293细胞展示出响应于将酸性pH溶液施加到细胞上(通过HCl调节)，细胞内pHluorin荧光的减少(这表明细胞内pH降低)。在仅用pHluorin转染的对照中，未观察到细胞内pH的降低(图10D)。但是，当施用碱性溶液(pH8.5)时，仅具有Otop1和Otop2的细胞显示pHluorin荧光的增加(细胞内碱化)，而Otop3不显示。施加pH5.0的乙酸溶液(弱酸)可诱导细胞内酸化，这可用作对照，以示出随着细胞内pH降低，pHluorin荧光在所有细胞中均下降。黑线：平均pHluorin荧光强度。浅灰色线：pHluorin荧光强度的s.e.m.。深灰色条：施用了不同的pH溶液(空白：pH7.4)。HOAc：乙酸。
发明内容
在一些方面，本文提出了一种鉴定耳蝶呤介导的质子转位活性的调节剂的方法，其包括：(a)使耳蝶呤多肽或其功能部分与测试化合物接触；以及(b)确定由所述耳蝶呤多肽或其功能部分介导的质子转位活性；其中与在不存在所述测试化合物的情况下确定的质子转位活性相比，所述质子转位活性的至少1％的增加或降低将所述测试化合物鉴定为由所述耳蝶呤多肽或其功能部分介导的质子转位活性的调节剂。在一些实施方案中，响应于pH值的变化，确定由耳蝶呤多肽介导的质子转位活性。pH的变化可以是pH的升高或降低。在一些实施方案中，pH的变化是至少0.1pH单位的变化。在一些实施方案中，响应于细胞外pH的变化来确定由耳蝶呤多肽介导的质子转位活性。在一些实施方案中，该方法包括诱导pH(例如，细胞外pH)的变化。在一些实施方案中，将耳蝶呤多肽整合到脂质双层中，并且该方法包括在(a)之前或(b)之前，通过向耳蝶呤多肽的一侧(例如，细胞外侧)添加酸或碱来诱导pH的变化。
在一些方面，本文提出了一种鉴定耳蝶呤介导的质子转位活性的调节剂的方法，其包括：(a)(i)在存在测试化合物的情况下和(ii)在不存在所述测试化合物的情况下测量由耳蝶呤多肽或其功能部分介导的质子转位活性；以及(b)确定在(a)(i)中测量的质子转位活性相比于在(a)(ii)中测量的质子转位活性之间的差异，从而所述测试化合物被鉴定为由所述耳蝶呤多肽或其功能部分介导的所述质子转位活性的调节剂。
在一些方面，本文提供了一种细胞，其包含细胞外膜和整合在该细胞的该细胞外膜中的耳蝶呤多肽(例如，异源的耳蝶呤多肽)。在一些实施方案中，细胞是爪蟾卵母细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是味觉受体细胞。在某些实施方案中，该耳蝶呤多肽是异源的耳蝶呤多肽(例如，与包含该耳蝶呤多肽的细胞异源)。例如，在一些实施方案中，耳蝶呤多肽是在异源昆虫、爬行动物或非人哺乳动物细胞中表达的人耳蝶呤多肽。在一些实施方案中，耳蝶呤多肽是在永生化的细胞或天然不表达耳蝶呤多肽的细胞类型中表达的人耳蝶呤多肽。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括将核酸引入哺乳动物细胞或卵母细胞中，其中所述核酸指导耳蝶呤多肽的表达。在一些实施方案中，指导耳蝶呤多肽表达的核酸是编码耳蝶呤多肽的cDNA。例如，在某些实施方案中，哺乳动物细胞或卵母细胞用编码耳蝶呤多肽的cDNA转染。编码耳蝶呤多肽或其功能部分的任何合适的核酸或cDNA可以用于本文所述的方法。
在一些实施方案中，通过包括在非洲爪蟾卵母细胞上的两电极电压钳制、膜片钳转染的HEK-293细胞或细胞内pH指示剂成像的方法来确定、测量、检测或测定质子转位活性。例如，在某些实施方案中，将编码耳蝶呤多肽蛋白、其功能部分或其同源物的核酸注射入爪蟾卵母细胞中，从而介导耳蝶呤多肽在卵母细胞膜中的表达和将其整合到卵母细胞膜中。然后可以通过测量膜极化的变化(例如，膜电位的变化)来评估质子转位活性。在某些实施方案中，通过用合适的pH敏感指示剂测量pH和/或pH的变化(例如细胞内pH的变化)来确定质子转位活性。pH敏感指示剂可以是pH敏感染料(例如pHrodo红)或pH敏感蛋白(例如pH敏感绿色荧光蛋白(GFP)或pHluorin)。在一些实施方案中，pH和/或pH的变化可以用pHrodo红测量。在某些实施方案中，通过测量细胞内Ca2+或锌水平的变化来确定质子转位活性。例如，可以通过使用荧光钙指示剂染料(例如Fura-2)来测量钙水平。在典型的微荧光测定法中，将在结合单个Ca2+离子后会发生荧光变化的染料(例如Fura-2)加载到表达Otop的细胞的胞质溶胶中。暴露于测试化合物后，胞质钙的增加通过在结合钙时发生的Fura-2的荧光变化反映。
在一些实施方案中，使用多种体外和体内测定法间接评估耳蝶呤多肽的质子转位活性，以确定功能、化学和物理作用，所述测定法例如，测量耳蝶呤与其他分子(例如，肽，信号分子，包括肽，有机小分子和脂质)的结合；和/或测量响应于由依赖于耳蝶呤的质子转位导致的细胞内pH变化而引起的蛋白表达(例如转录、蛋白水平等)的增加或减少。在一些实施方案中，质子转位活性通过评估细胞生长或生存力的变化来确定，其中此类事件由依赖于耳蝶呤的质子转位介导。在某些实施方案中，通过检测细胞内第二信使(例如IP3、cGMP或cAMP)的量的变化或检测该信使的修饰(例如，磷酸化)来间接地确定或测量质子转位活性，其中这些量或修饰通过耳蝶呤依赖的质子转位来调节或诱导。
在某些实施方案中，在包含膜整合的耳蝶呤多肽或其功能部分的细胞或卵母细胞上使用膜片钳技术确定质子转位活性。在一些实施方案中，依赖于耳蝶呤的质子转位活性的存在被确定为响应于至少0.1pH单位的pH变化，至少0.1pA、至少1pA、至少5pA、至少10pA、至少50pA、至少100pA、至少500pA、至少1000pA、至少50nA、至少100nA、至少500nA、至少0.1μA、至少0.2μA、至少0.5μA、至少1.0μA、或至少2μA的电流的净变化。在一些实施方案中，通过测量或检测电阻或电压电位的相应变化来确定、测量或检测电流的变化，这些参数可以使用合适的数学算法容易地转换。在一些实施方案中，依赖于耳蝶呤的质子转位活性的调节是依赖于耳蝶呤的质子转位活性的至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的净变化(例如，质子转位活性的增加或降低)。净变化可以通过比较在不存在测试化合物的情况下确定的由耳蝶呤介导的质子转位活性与在存在测试化合物的情况下确定的由耳蝶呤介导的质子转位活性来确定。在一些实施方案中，在不存在测试化合物的情况下确定的由耳蝶呤介导的质子转位活性的量称为参考水平或对照。例如，在一些实施方案中，通过比较在存在测试化合物的情况下耳蝶呤多肽的质子转位活性的量与在不存在测试化合物的情况下确定的耳蝶呤多肽的质子转位活性的量(例如参考水平)来确定质子转位活性的降低。在某些实施方案中，通过比较在存在测试化合物的情况下耳蝶呤多肽的质子转位活性的量与在不存在测试化合物的情况下确定的耳蝶呤多肽的质子转位活性的量(例如参考水平)来确定质子转位活性的增加。
具体实施方式
可以将质子转移到真核细胞的质子通道尚未被分子鉴定。基于味觉细胞的转录组分析的无偏筛用于鉴定跨膜蛋白耳蝶呤1(Otop1)为编码具有新的生物物理特性的质子选择性离子通道。相关的鼠类基因Otop2和Otop3以及果蝇基因dmOTOPLc也编码质子通道。本文还确定了Zn2+敏感的质子电导需要Otop1。
在一些实施方案中，本文提出了鉴定耳蝶呤介导的质子转位活性的调节剂的方法。在一些实施方案中，该方法包括使测试化合物与耳蝶呤多肽或其功能部分接触，并确定由耳蝶呤多肽或其功能部分介导的质子转位活性。如本文在“确定质子转位活性”的背景中使用的术语“确定”是指并且包括但不限于“测量”、“检测”和/或“获得”。
耳蝶呤多肽
耳蝶呤多肽或其功能部分是在脂质双层中形成通道的多程整合膜蛋白。因此，本文所指的耳蝶呤多肽或其功能变体是整合到脂质双层(例如细胞膜或合成脂质双层)中的耳蝶呤多肽。当整合到细胞膜中时，耳蝶呤多肽包括第一侧(例如，细胞外侧)和第二侧(例如，细胞内侧)。如本文所示，常常响应于膜一侧的pH变化(例如质子的增加或减少)，耳蝶呤多肽提供质子从耳蝶呤多肽的一侧(例如，膜的一侧)到耳蝶呤多肽的另一侧(例如，膜的另一侧)的转位。在一些实施方案中，在耳蝶呤多肽的一侧上诱导pH变化(例如，通过添加碱或酸)，然后检测通过耳蝶呤多肽的质子移位。
在一些实施方案中，耳蝶呤多肽包括从任何合适的生物体获得、表达或衍生的耳蝶呤多肽或由其组成，所述生物体的非限制性实例包括动物、植物、原生生物、刺胞(水生淡水或海洋生物动物)、节肢动物、真菌、细菌、肢体动物、棘皮动物、脊索动物和软体动物等。耳蝶呤多肽可以从任何合适的物种获得、表达或衍生。在一些实施方案中，耳蝶呤多肽包括昆虫来源的耳蝶呤多肽(例如，源自果蝇的耳蝶呤多肽或其功能部分)或由其组成。在某些实施方案中，一种耳蝶呤多肽包括从合适的哺乳动物获得、表达或衍生的耳蝶呤多肽或由其组成。在一些实施方案中，耳蝶呤多肽包括哺乳动物的耳蝶呤多肽，其非限制性实例包括耳蝶呤-1(Otop1)、耳蝶呤-2(Otop2)和耳蝶呤-3(Otop3)。在一些实施方案中，一种耳蝶呤多肽包括从啮齿动物获得、表达或衍生的耳蝶呤多肽或由其组成，所述啮齿动物的非限制性实例包括小鼠和大鼠。在某些实施方案中，一种耳蝶呤多肽包括从合适的灵长类动物获得、表达或衍生的耳蝶呤多肽或由其组成。灵长类动物可以是非人的灵长类动物，或者可以包括人。在某些实施方案中，耳蝶呤多肽包括人耳蝶呤多肽，由其组成，从其获得或从其衍生，其非限制性实例包括耳蝶呤-1(Otop1；UniProtKB-Q7RTM1；SEQ ID NO:1)、耳蝶呤-2(Otop2；UniProtKB-Q7RTS6；SEQ ID NO:2)和耳蝶呤-3(Otop3；UniProtKB-Q7RTS5；SEQ IDNO:3)。在某些实施方案中，耳蝶呤多肽包含小鼠耳蝶呤多肽，其非限制性实例包括耳蝶呤-1(Otop1；UniProtKB-Q80VM9；SEQ ID NO:4)、耳蝶呤-2(Otop2；UniProtKB-Q80SX5；SEQ IDNO:5)，耳蝶呤-3(Otop3；UniProtKB–Q80UF9；SEQ ID NO:6)或其功能部分。在某些实施方案中，耳蝶呤多肽包含包含果蝇Otop多肽由其组成的耳蝶呤多肽，或由包含果蝇Otop多肽由其组成的耳蝶呤多肽组成，果蝇Otop多肽的非限制性实例包括果蝇OTOP变体D(NM_001272325.1(CG42492))(SEQ ID NO:7)、果蝇OTOP变体A(NM_134914.3(CG332))(SEQ IDNO:8)和果蝇OTOP变体D(NM_001144688.3(CG42265))(SEQ ID NO:9)。耳蝶呤多肽可使用编码耳蝶呤多肽的合适核酸(例如cDNA)在细胞的细胞膜中表达。在一些实施方案中，合适的细胞用编码耳蝶呤多肽的cDNA转染。编码果蝇耳蝶呤多肽的cDNA的非限制性示例以NCBI参考编号NM_001272325.1(CG42492),NM_134914.3(CG332)和NM_001144688.3(CG42265)提供。
在某些实施方案中，耳蝶呤多肽包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代。耳蝶呤多肽可以与本文描述的耳蝶呤多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。在某些实施方案中，耳蝶呤多肽包含与SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5或SEQ ID No：6中任一个的耳蝶呤多肽序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的耳蝶呤多肽或由其组成。在一些实施方案中，耳蝶呤多肽包含一种或多种氨基酸类似物或一种或多种修饰的氨基酸。可以通过用于改变肽序列的合适方法来制备包含氨基酸取代、氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸类似物的经修饰的耳蝶呤多肽，其非限制性实例描述于Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Second Edition,Cold Spring Harbor,或Current Protocolsin Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.New York。耳蝶呤多肽也可以使用合适的重组核酸技术进行修饰和制备。
术语“百分比同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间的序列同一性。可以通过比较每个序列中可以用于比较的目的进行比对的位置来确定同一性。当比较序列中的等效位置被相同氨基酸占据时，则分子在该位置相同。当等效位置被相同或相似(例如，在空间和/或电子性质上相似)的氨基酸残基占据时，则所述分子可被称为在该位置处同源(相似)。表达为同源性、相似性或同一性的百分比是指被比较序列共有的位置上相同或相似氨基酸的数目的函数。表达为同源性、相似性或同一性的百分比是指被比较序列共有的位置上相同或相似氨基酸的数目的函数。可以使用各种比对算法和/或程序，其包括FASTA、BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST可作为GCG序列分析软件包的一部分(University ofWisconsin,Madison,WI)使用，并且可以与例如默认设置一起使用。ENTREZ可通过theNational Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine,National Institutes of Health,Bethesda,MD获得。在一个实施方案中，两个序列的同一性百分比可以通过GCG程序来确定，其中缺口权重为1，例如，对每个氨基酸缺口进行加权，就好像它是两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配一样。
在某些实施方案中，本文所述的耳蝶呤多肽提供任何量的可检测的质子转位活性。在某些实施方案中，用于本文描述的方法的耳蝶呤多肽是天然存在的、截短的、突变的或遗传改变的，同时保留任何量的可检测的质子转位活性。在一些实施方案中，本文所述的耳蝶呤多肽保留野生型耳蝶呤多肽肽序列的质子转位活性的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更高。在一些实施方案中，本文所述的耳蝶呤多肽保留SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3、SEQ IDNo：4、SEQ ID No：5、SEQ ID No：6、SEQ ID No：7、SEQ ID No：8或SEQ ID No：9中任一个的耳蝶呤多肽的质子转位活性的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更高。
在某些实施方案中，耳蝶呤多肽包含本文所述的耳蝶呤多肽的功能部分。耳蝶呤多肽的功能部分是耳蝶呤多肽的当被整合到膜中时显示如通过本文所述的方法所测量的质子转位活性的任何部分。可以使用本技术领域已知的合适的重组方法来制备和/或表达耳蝶呤多肽的功能部分，并可以通过本文所述的方法测试其质子转位活性。因此，本领域技术人员可以使用本文所述的方法容易地鉴定耳蝶呤多肽的功能部分。在某些实施方案中，耳蝶呤多肽的功能部分保留野生型耳蝶呤多肽(例如，SEQ ID No：1至SEQ ID No：9中任一个的耳蝶呤多肽)的质子转位活性的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在一些实施方案中，耳蝶呤多肽或其功能部分与另一种多肽、核酸、碳水化合物、脂肪酸或可检测试剂共价连接或以其他方式连接。在某些实施方案中，耳蝶呤多肽或其功能部分包含另一种多肽。在某些实施方案中，在保持质子转位活性的同时，耳蝶呤多肽或其功能部分可以与另一多肽或其部分共价连接。在一些实施方案中，耳蝶呤多肽与另一跨膜蛋白或其部分连接。
在一些实施方案中，耳蝶呤多肽(共价或非共价地)连接至可区分的标识符。在一些实施方案中，耳蝶呤多肽包含一个或多个可区分的标识符。可以将任何合适的可区分的标识符连接至耳蝶呤多肽或与耳蝶呤多肽缔合。在一些实施方案中，可区分的标识符是可检测的标记。可区分的标识符的非限制性示例包括金属标记、荧光标记、荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP))、pH敏感蛋白或pH敏感GFP(例如pHluorin等)、任何合适的荧光团(例如mCherry)、发色团、化学发光标记、电化学发光标记(例如OrigenTM)、磷光标记、淬灭剂(例如荧光团淬灭剂)、荧光共振能量转移(FRET)对(例如供体和受体)、蛋白(例如酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶等))、抗原或其一部分、接头、结合对成员(a member of a binding pair))、酶底物、小分子(例如生物素、抗生物素蛋白)、质量标签、量子点、纳米颗粒等或其组合。任何合适的荧光团或发光材料都可以用作可区分的标识符。可以通过各种合适的技术来检测和/或定量发光可区分的标识符，这些技术例如流式细胞术、凝胶电泳、蛋白芯片分析(例如，任何芯片方法)、微阵列、质谱、细胞荧光分析、荧光显微技术、共聚焦激光扫描显微镜、激光扫描细胞术等及其组合。在一些实施方案中，将耳蝶呤多肽融合至GFP。在一些实施方案中，将耳蝶呤多肽与pHluorin融合。
在某些实施方案中，可区分的标识符与耳蝶呤多肽间接缔合(例如结合)。在一些实施方案中，可区分的标识符与耳蝶呤多肽可逆地缔合。在某些实施方案中，可以使用合适的方法(例如，通过增加盐浓度、变性、洗涤、添加合适的溶剂和/或盐、添加合适的竞争剂和/或加热)从耳蝶呤多肽中去除与耳蝶呤多肽可逆缔合的可区分的标识符。
质子转位活性
如本文所述(例如，参见实施例)，耳蝶呤多肽是多程跨膜蛋白，该多程跨膜蛋白在整合到脂质双分子层中时形成离子通道或孔，其选择性地允许质子从脂质双层的一侧转位至另一侧。因此，短语“质子转位活性”是指质子穿过由耳蝶呤多肽或其功能部分形成的离子通道或孔从脂质双层的一侧到脂质双层的另一侧的转位。质子转位活性可以是主动或被动过程。在一些实施方案中，通过耳蝶呤多肽进行的质子转位活性是被动过程。膜整合的耳蝶呤多肽的质子转位活性可以使用合适的体外或体内方法来测定或测量。质子跨越或穿过由耳蝶呤多肽形成的通道或孔的转位可以通过检测耳蝶呤介导的细胞信号传导或其他耳蝶呤-介导的事件，或通过测量或检测(例如，通过成像)pH敏感指示剂发出的光，直接(例如，通过直接测量或检测细胞内pH、电流、电阻或电压电位)或间接(例如，通过(例如，通过成像，例如钙成像)测量或检测细胞内钙或锌的变化(例如，增加或减少))来确定、测量、检测或测定。pH敏感指示剂的非限制性实例包括pH敏感荧光团、pH敏感染料、pH敏感蛋白等以及其组合。在一些实施方案中，pH敏感指示剂包含pHluorin。在一些实施方案中，pH敏感指示剂包括pHrodo红。pH敏感指示剂pHrodo红在中性pH下是弱荧光，但随着pH降低，荧光强度逐渐增加。该试剂可用于定量细胞质的pH。任何合适的pH指示剂均可用于本文所述的检测pH变化的方法(细胞内或细胞外)，其非限制性实例列于Invitrogen’s Molecular ProbesHandbook,A Guide to fluorescent probes and labeling technologies,(2010)，第11版，第20章。
在一些实施方案中，通过包括电压钳制(例如，非洲爪蟾卵母细胞或膜片钳转染的HEK-293细胞上的两电极电压钳制)或对细胞内pH指示剂成像的方法来确定、测量、检测或测定质子转位活性。例如，在某些实施方案中，将编码耳蝶呤多肽蛋白、其功能部分或其同源物的核酸注射入爪蟾卵母细胞中，从而介导耳蝶呤多肽在卵母细胞膜中的表达和将介导耳蝶呤多肽整合到卵母细胞膜中。然后可以通过测量电流或通过测量膜极化的变化(例如，膜电位的变化)来评估质子转位活性。在某些实施方案中，质子转位活性通过使用pH指示剂(例如pHluorin)测量细胞内pH的变化来确定。在某些实施方案中，质子转位活性通过测量细胞内Ca2+水平的变化来确定。例如，可以通过评估Ca2+的吸收或使用荧光染料(例如Fura-2)来测量钙通量。在典型的微荧光测定法中，将在结合单个Ca2+离子后发生荧光变化的染料(例如Fura-2)加载到表达Otop的细胞的胞质溶胶中。在暴露于测试化合物后，胞质钙的增加通过结合钙时Fura-2的荧光变化来反映。其他合适的荧光钙指示剂也可用于本文公开的方法。
在一些实施方案中，使用多种体外和体内测定法间接评估耳蝶呤多肽的质子转位活性，以确定功能、化学和物理作用，所述测定法例如，测量耳蝶呤与其他分子(例如，肽，信号分子，包括肽，有机小分子和脂质)的结合；和/或测量响应于由依赖于耳蝶呤的质子转位导致的细胞内pH变化而引起的蛋白表达(例如转录、蛋白水平等)的增加或减少。在一些实施方案中，质子转位活性通过评估细胞生长或生存力的变化来确定，其中此类事件由依赖于耳蝶呤的质子转位介导。在某些实施方案中，通过检测细胞内第二信使(例如IP3、cGMP或cAMP)的量的变化或检测该信使的修饰(例如，磷酸化)来间接地确定或测量质子转位活性，其中这些量或修饰通过耳蝶呤依赖的质子转位来调节或诱导。
在一些实施方案中，通过测量或检测跨越脂质双层的电流、电阻或电压电位的变化，确定耳蝶呤多肽或其功能部分的质子转位活性。脂质双层可以是细胞的脂质双层或可以是合成的。在一些实施方案中，响应于脂质双层的一侧上的pH(即质子浓度)的变化来确定质子转位活性。在一些实施方案中，质子转位活性通过脂质双层的一侧上的pH(即质子浓度)的变化来诱导。通过向膜的一侧上的流体中添加质子(例如酸)可以提供pH的变化。pH的变化可以是pH的升高或降低。在一些实施方案中，pH的变化是至少0.01、至少0.05、至少0.1、至少0.5或至少1.0pH单位的变化。在一些实施方案中，pH的变化是至少0.5pH单位的变化。可以在膜的任一侧提供pH值的变化。在某些实施方案中，将质子添加到膜的细胞外侧，从而提供pH的细胞外变化。可用于确定、测定或测量质子转位活性的方法的非限制性示例包括任何合适版本的膜片钳技术(例如，细胞附着膜片、内向外膜片、全细胞记录、外向外膜片、穿孔贴片、松散贴片、两电极电压钳(claim)和哺乳动物细胞膜片钳(例如，使用转染的HEK-293细胞)，用染料(例如DFFDA BCECF，pHrodo红或Fura2-AM(Sigma Aldrich,CAno.108964-32-5))或例如通过与pHluorin共转染并成像(例如钙成像)进行哺乳动物细胞-pH成像，等等及其组合。可用于确定、测定或测量质子转位活性的方法的其他非限制性实例可见于以下文献：Tsien RY,Biochemistry(1980)19(11):2396-404；Rink TJ,Tsien RY,Pozzan T.,(1982)J.Cell Biol.95(1):189-96；Grynkiewicz G,Poenie M,Tsien RY.(1985)J Biol Chem.260(6):3440-5；Tsien RY,(1989)Methods Cell Biol.30:127-56；Cohen-Armon M,Sokolovsky M,Dascal N.,(1989)Brain Res.496(1-2):197-203；LimanER,Tytgat J,Hess P.,(1992)Neuron.9(5):861-71；Shimbo K,Brassard DL,Lamb RA,Pinto LH.,(1996)Biophys J.70(3):1335-46；和Chang RB,Waters H,Liman ER.,(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)107(51):22320-5。前述参考文献的全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，在包含膜整合的耳蝶呤多肽或其功能部分的细胞或卵母细胞上使用电压钳技术确定质子转位活性。在一些实施方案中，将依赖于耳蝶呤的质子转位活性的存在确定为响应于至少1pH单位的pH变化，至少50pA、至少100pA、至少500pA、至少1000pA、至少50nA、至少100nA、至少500nA、至少0.1μA、至少0.2μA、至少0.5μA、至少1.0μA或者至少2μA的电流的净变化。
在一些实施方案中，使用荧光成像板读取器(FLIPR)确定质子转位活性。FLIPR是一流的仪器，其利用整个板的电荷耦合器件成像来捕获荧光读数(Schroeder and Neagle(1996)J.Biomol.Screen.1:pp.75-80；另请参见Chemistry&Biology(2014)21(9):1162-1170)。在某些实施方案中，系统包括FLIPR。在一些实施方案中，系统是包括FLIPR的高吞吐量系统。
在一些实施方案中，直接确定、测量或检测电流变化。在一些实施方案中，通过测量或检测电阻或电压电位的相应变化来确定、测量或检测电流的变化，这些参数可以使用合适的数学算法容易地转换。在一些实施方案中，依赖于耳蝶呤的质子转位活性的调节是依赖于耳蝶呤的质子转位活性的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的净变化(例如，质子转位活性的增加或降低)。净变化可以通过比较在不存在测试化合物的情况下确定的由耳蝶呤介导的质子转位活性与在存在测试化合物的情况下确定的由耳蝶呤介导的质子转位活性来确定。在一些实施方案中，在不存在测试化合物的情况下确定的由耳蝶呤介导的质子转位活性的量称为参考水平或对照。例如，在一些实施方案中，通过比较在存在测试化合物的情况下耳蝶呤多肽的质子转位活性的量与在不存在测试化合物的情况下确定的耳蝶呤多肽的质子转位活性的量(例如参考水平)来确定质子转位活性的降低。在某些实施方案中，通过比较在存在测试化合物的情况下耳蝶呤多肽的质子转位活性的量与在不存在测试化合物的情况下确定的耳蝶呤多肽的质子转位活性的量(例如参考水平)来确定质子转位活性的增加。
如本文所用，术语“减少”或“降低”及其语法变化是指与参考水平或对照相比，减少至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍或至少10倍。在某些实施方案中，通过本文所述的方法将诱导耳蝶呤多肽的质子转位活性降低的测试化合物鉴定为耳蝶呤介导的质子转位活性的调节剂。降低或减少耳蝶呤多肽的耳蝶呤介导的质子转位活性的测试化合物或调节剂在本文中称为拮抗剂(例如，耳蝶呤多肽的拮抗剂、耳蝶呤介导的质子转位活性的拮抗剂)。
如本文所用，术语“增加”或“提高”及其语法变化是指与参考水平或对照相比，增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少2倍、至少5倍或至少10倍。在某些实施方案中，通过本文所述的方法将诱导耳蝶呤多肽的质子转位活性增加的测试化合物鉴定为耳蝶呤介导的质子转位活性的调节剂。增加或提高耳蝶呤多肽的耳蝶呤介导的质子转位活性的测试化合物或调节剂在本文中称为激动剂(例如，耳蝶呤多肽的激动剂、耳蝶呤介导的质子转位活性的激动剂)。
在一些实施方案中，在监测与耳蝶呤功能相关的生物学活性的功能测定中，针对激动作用或拮抗剂作用筛选与耳蝶呤结合的化合物，所述耳蝶呤功能例如对表达耳蝶呤的宿主细胞中的质子(例如质子、钙、锌)的细胞内水平、pH激活的电导、细胞死亡(即受体介导的细胞死亡，其可以使用例如形态学测定法、化学测定法或免疫学测定法进行监测)、表达耳蝶呤的细胞(例如，使用荧光电压敏感染料)的去极化，可通过放射免疫分析或ELISA检测的第二信使产生、钙诱导的报告基因表达或与耳蝶呤活性或耳蝶呤活性抑制相关的其他易于测定的生物学活性的影响。在某些实施方案中，功能测定法是基于对耳蝶呤的生物学活性的检测，其可以同时使用多个样品的高通量筛选来测定，例如，基于检测到荧光变化的功能测定法，所述荧光变化又与耳蝶呤活性的变化相关。此类功能性测定法可用于针对作为耳蝶呤激动剂或拮抗剂的活性来筛选候选药物。
在一些实施方案中，表达耳蝶呤的细胞(例如，重组表达耳蝶呤的细胞)预加载有荧光标记的pH指示剂(例如，pHrod红)。然后将表达耳蝶呤的细胞暴露于候选的与耳蝶呤结合的化合物，并监测暴露于该化合物的影响。具有耳蝶呤激动剂活性的候选化合物通常是与表达耳蝶呤的细胞接触时，相对于对照细胞(例如，在不存在候选物的情况下表达耳蝶呤的细胞，未添加编码耳蝶呤的核酸的宿主细胞)引起耳蝶呤介导的细胞内pH或细胞内钙变化的那些化合物。类似地，功能性耳蝶呤测定法可用于鉴定阻断耳蝶呤活性的候选化合物(例如，阻断由细胞外pH的变化诱导的细胞内pH的变化)。
在一些实施方案中，鉴定耳蝶呤介导的质子转位活性的调节剂的方法包括高通量筛选方法。高通量筛选(HTS)是一种科学发现的方法，其使用机器人技术、数据处理和控制软件、液体处理设备以及灵敏的检测器以在相对较短的时间内筛选数千至数百万种测试化合物。任何合适的高通量筛选方法都可以用于本文所述的方法，其非限制性实例描述于美国专利No.5,976,813；No.6,472,144；No.6,692,856；No.6,824,982；和No.7,091,048，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，确定质子转位活性的差异。质子转位活性的差异可以通过比较在不存在测试化合物的情况下确定的第一质子转位活性和在存在测试化合物的情况下确定的第二质子转位活性来确定。在某些实施方案中，将测试化合物鉴定为耳蝶呤质子转位活性的调节剂包括确定至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的质子转位活性的差异。
测试化合物
可以通过本文所述的方法来测试任何合适的测试化合物。在一些实施方案中，测试化合物在测试的浓度下可溶于水性介质(例如细胞培养基)。在一些实施方案中，测试化合物在测试的浓度下完全可溶于水性介质。在一些实施方案中，测试化合物在测试的浓度下部分溶于水性介质。在一些实施方案中，测试化合物在测试的浓度下对哺乳动物细胞无毒。例如，在某些实施方案中，测试化合物在测试的浓度下(i)不抑制生长，(ii)不降低生存力，(iii)不诱导坏死或凋亡，(iv)不诱导DNA或RNA损伤，(v)不损伤细胞膜，或(vi)不诱导细胞蛋白的蛋白水解裂解。在一些实施方案中，测试化合物不是致癌物，也不是共致癌物。在一些实施方案中，测试化合物不是致畸剂。
如本文所用的，短语“测试化合物”是指可以针对特异性调节耳蝶呤多肽的质子转位活性的能力进行筛选的任何合适的化合物。测试化合物的非限制性实例包括小化合物(例如，有机小分子或无机小分子)、大化合物(例如，大于5000Da)、多糖、碳水化合物、糖、脂肪酸、脂质、生物大分子(例如、肽、多肽、蛋白、肽类似物和衍生物、拟肽、核酸、核苷酸、核苷酸类似物)、天然或合成的化合物、结合剂(例如抗体或其结合片段，包括非天然存在和合成的结合剂(例如，TandAb、纳米抗体、适体、BiTE、SMIP、DARPins、DNL、亲和体(affibodies)、Duocalins、adnectins、fynomers、Kunitz Domains Albu-dabs、DARTs、DVD-IG、Covx-bodies、肽体(peptibodies)、scFv-Igs、SVD-Igs、dAb-Igs、Knob-in-Holes、triomAbs等)、其衍生物、其聚合物、其盐、其异构体、其多晶型物及其组合。在一些实施方案中，测试化合物包含在由生物材料制备的提取物内，例如在细菌、植物、真菌、动物细胞或动物组织的提取物内。在一些实施方案中，测试化合物包含在生物流体内。因此，在一些实施方案中，测试化合物包含提取物或生物流体。因此，在一些实施方案中，测试化合物包含提取物或生物流体。小化合物可包括分子量大于约40道尔顿(Da)但小于5000Da、小于3000Da或小于1000Da的分子。小化合物可包含任何合适的化学部分或基团，其非限制性实例包括烷烃、烯烃、炔烃、醇、卤素、酮、醛、羧酸、醚、酯、胺、酰胺、饱和的、部分饱和的或不饱和环结构、核苷酸、核苷、多原子非金属(例如，P、S、Se)、过渡金属、过渡后金属、准金属等、其盐及其组合。
在某些实施方案中，测试化合物包括合适文库的合成或天然存在的化合物。多种小分子文库是本技术领域已知的，其中一些可商购获得。可商购获得的化合物库可获自，例如，ArQule、Pharmacopia、graffinity、Panvera、Vitas-M Lab、Biomol International和Oxford。用于开发基于小分子、聚合和基因组的文库的方法描述于例如Ding等人，JAm.Chem.Soc.124:1594-1596(2002)和Lynn等人，J.Am.Chem.Soc.123:8155-8156(2001)中。也可以使用来自例如NIH Roadmap,Molecular Libraries Screening CentersNetwork(MLSCN)的化合物库。可以使用任何合适的方法来制作小的化合物库。可以使用合适的HTS筛选方法和/或本文所述的方法筛选化合物文库，以鉴定文库内调节耳蝶呤介导的质子转位活性的测试化合物。
在某些实施方案中，测试化合物的分子量为40至500,000Da、40至200,000Da、40至100,000Da、40至50,000Da、40至25,000Da、40至10,000Da、40至5000Da或40至1000Da。在某些实施方案中，测试化合物的分子量为5000至500,000Da、10,000至500,000Da、25,000至500,000Da或5000至100,000Da。
测试化合物可以任何合适的浓度进行测试。在一些实施方案中，测试化合物以以下浓度进行测试：至少1pM、至少10pM、至少100pM、至少1nM、至少10nM、至少100nM、至少1μM、至少10μM、至少100μM或至少1mM。在一些实施方案中，测试化合物以以下范围的浓度进行测试：1pM至100mM、1pM至10mM、1pM至1mM、10pM至100mM、10pM至10mM、10pM至1mM、100pM至100mM、100pM至10mM、or 100pM至1mM。在一些实施方案中，测试化合物以以下浓度进行测试：小于100mM、小于10mM、小于1mM或小于100nM。在一些实施方案中，以一种或多种不同浓度测试或测定测试化合物。
在某些实施方案中，测试化合物包含亲电试剂或由亲电试剂组成。亲电子试剂是能够与耳蝶呤多肽形成共价键的化合物。在某些实施方案中，测试化合物包含酶(例如蛋白酶)。
细胞和膜
在某些实施方案中，耳蝶呤多肽或其功能部分与细胞膜或合成膜缔合。短语“与细胞膜或合成膜缔合”是指将耳蝶呤多肽或其功能部分整合到膜中，从而形成包含质子转位活性的功能性质子通道。
可以使用合适的方法将耳蝶呤多肽整合到脂质双层中。耳蝶呤多肽可以整合到合适细胞的脂质双层中，其非限制性实例包括动物细胞、植物细胞、原生生物细胞、水生淡水或海洋动物细胞、节肢动物细胞、真菌细胞、细菌细胞、无节肢动物细胞、棘皮动物细胞、脊索动物细胞、软体动物细胞等。在某些实施方案中，耳蝶呤多肽被整合到哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、非人灵长类动物细胞或人细胞的脂质双层中。在某些实施方案中，细胞是原代细胞或永生细胞(例如组织培养细胞系)，其非限制性实例包括HeLa、HEK293、DU145、H295R、HT29、KBM-7、MCF-7、MDA-MB-468、PC3、THP-1、PC12、A549、CHO、COS、Caco-2、EL4、HEPG2、HL-60等及其衍生物。在一些实施方案中，细胞是味觉受体细胞(例如，酸味细胞)。在某些实施方案中，细胞是卵细胞(例如卵母细胞，例如爪蟾卵母细胞)。在某些实施方案中，细胞是红细胞或其衍生物。在某些实施方案中，细胞是重影细胞或无核细胞。可以使用任何合适的方法将耳蝶呤多肽整合到细胞的脂质双层中。在某些实施方案中，通过将核酸引入到指导耳蝶呤多肽的表达的细胞中，将耳蝶呤多肽整合到细胞的脂质双层中。因此，在一些实施方案中，本文描述的方法包括在细胞中表达耳蝶呤多肽或其功能部分。因此，在一些实施方案中，细胞是转染的细胞，例如用指导耳蝶呤多肽或其功能部分的表达的核酸转染的细胞。在一些实施方案中，细胞是被转导的细胞，例如用重组病毒转导的细胞，所述重组病毒包含指导耳蝶呤多肽或其功能部分在该被转导的细胞内的表达的核酸。在某些实施方案中，细胞包含整合到细胞的细胞膜中的耳蝶呤多肽或其功能部分。在某些实施方案中，细胞包含异源的耳蝶呤多肽或其功能部分。短语“异源的耳蝶呤多肽”表示该耳蝶呤多肽来源于与对其进行表达的细胞不同的物种。在某些实施方案中，细胞是包含异源的耳蝶呤多肽的爪蟾卵母细胞。在某些实施方案中，细胞是包含异源的耳蝶呤多肽的味觉受体细胞。
在某些实施方案中，将耳蝶呤多肽整合到合适的脂质体、胶束、纳米盘、双层片或比塞勒(bicelle)中，以用于本文所述的方法。在某些实施方案中，将耳蝶呤多肽整合到合适的合成膜中，以用于本文所述的方法。在一些实施方案中，将耳蝶呤整合到在合适的纳米孔设备的孔中形成的合适的合成膜中，以用于本文所述的方法。
在某些实施方案中，纳米孔设备包括第一流体填充室和第二流体填充室，该第一流体填充室和第二流体填充室被包含合成膜的孔隔开，其中该膜包含一种或多种耳蝶呤多肽。在某些实施方案中，第一流体填充室包括第一电极，第二流体填充室包括第二电极，其中第一电极和第二电极可操作地连接至用于至少测量或检测电压电位，电流和/或电阻的装置。在某些实施方案中，用于测量或检测电压电位、电流和/或电阻的装置是包括电流表、电压表、欧姆表、示波器等或其组合的装置。在某些实施方案中，第一和/或第二室包括一个或多个用于检测发光分子探针的光电管。
在某些实施方案中，本文提供了用于确定耳蝶呤多肽的质子转位活性的系统。在某些实施方案中，本文提供了一种用于鉴定耳蝶呤多肽的质子转位活性的调节剂(即，耳蝶呤介导的质子转位活性的调节剂)的系统。在某些实施方案中，系统包含整合到膜中的一个或多个耳蝶呤多肽、第一流体填充室和第二流体填充室，其中第一流体填充室和第二流体填充室位于膜的相对侧。在某些实施方案中，孔包括膜。例如，在一些实施方案中，系统包括孔，并且膜容纳在孔内。在一些实施方案中，膜是合成膜。在一些实施方案中，该系统包括纳米孔设备。
实施例
实施例1–Otop1形成具有独特生物物理特性的质子选择离子通道
为了表征Otop1的功能特性，我们改变pHo并且测量表达Otop1的爪蟾卵母细胞中的诱发电流。除非另有说明，否则这些实验以及所有其他实验都是使用大阳离子NMDG+取代细胞外溶液中的Na+进行，该大阳离子NMDG+通常不可透过离子通道。随着pHo在pH6-4范围内降低(图1a-c)，并且电流的反向电位(Erev)移向更大的正电压，爪蟾卵母细胞中的Otop1电流强度单调增加。请注意，因为在这些实验中未减去内源性电流和泄漏电流，所以Otop1电流偏离了Nernstian行为3,5。
为了确定otop1是否可以产生离子通道的成孔亚单元，而与细胞环境无关，我们使其在HEK-293细胞中表达(图1d-f)。N端YFP标记的通道证实了在细胞表面的表达(图1g)。响应于Otop1转染细胞的pHo降低，引起大的内向电流(pHo＝5.0时，I＝1,130±192pA，相比而言，未转染细胞为14±4pA)，电流强度随pHo单调增加(图1f)，就像在卵母细胞中一样。HEK-293细胞中的Otop1电流在几秒钟内衰减，响应于较多的酸性刺激，观察到了较快的动力学特性(图1c)。电流的衰减可能是由于通道附近质子的积累(或耗尽)所致，这可能影响质子运动或通道门控的驱动力3,5。例如，可以计算在10μm直径(524fL体积)的细胞中流动持续1秒的1000pA的H+电流(诸如我们观察到的)，将H+的总(结合+游离)细胞内浓度增加至20mM3。此外，由于与大量pH缓冲液结合的H+的缓慢开始，去除过量的H+可能需要60-90秒。确实，当我们使用膜渗透染料pHrodo红使细胞内pH成像时，我们观察到在Otop1转染的细胞中pHo从7.4降低到5.0时pHi发生了很大变化，在模拟转染的(mock-transfected)细胞中未观察到这种反应(图1h)。
我们对Otop1进行了详细的生物物理表征，以确定其是否具有质子选择性。首先，我们通过测量在改变离子条件时对降低的pH的响应来确定Otop1对其他阳离子是否可渗透。用Na+代替细胞外溶液中的NMDG+(图2a)不会改变响应于pH 5.5引起的电流的幅值(通过配对t检验，p>0.05)，这表明该通道对于Na+是不可测量地渗透的。同样，用Cs+、Li+或Ca2+替代NMDG+导致电流强度增加小于3％，这表明Otop1对这些一价和二价阳离子也没有明显的渗透性(图2a)。
为了确定H+对Na+和Cl-的相对渗透性，我们在其中140Na+代替140NMDG和其中在存在或不存在Na+时[Cl-]增加的条件下测量Erev。在任何情况下，我们都没有观察到Erev的任何变化(图2d，e)。使用Goldman-Hodgkin-Katz(GHK)公式30，我们计算出很容易检测到的5mV的变化转化为：相对于Na+，H+的选择性>2×105倍，并且相对于Cl-，H+的选择性>1×105；由于我们没有观察到Erev的变化，因此该通道可能对H+的选择性优于对Cl-和Na+的选择性，例如Hv13。
过渡金属Zn2+是一种有效的Hv1抑制剂，其与两个调节门控的外部组氨酸残基结合7,31,32。它还抑制质子运输中涉及的其他分子3，其包括味觉细胞中的质子通道20。为了深入了解Otop1参与离子渗透的结构元素，我们测量了其对Zn2+抑制的敏感性。Zn2+以剂量依赖性方式抑制HEK-293细胞中响应pH5.5诱发Otop1电流，IC50为0.19mM±0.01(图2f，g)。接近1的Hill系数(0.89±0.06)表示单个Zn2+离子结合以抑制通道。
测试了Otop1以确定其是否可能是电压依赖性的。测量了pH5.5溶液诱发的Otop1电流对-80至+40mV(从0mV的保持电位开始)的电压阶跃的响应。电流几乎没有显示出幅值随时间变化的证据，这表明在一定的生理相关电压范围内，Otop1的门控与电压的关系不明显(图5)。
这些数据共同证明Otop1编码具有独特结构和生物物理特性的质子选择性离子通道。
实施例2-耳蝶呤构成质子通道的进化保守家族
耳蝶呤从线虫到人在进化上是保守的28,33(图3a)。为了确定该家族是否一般起质子通道的作用，我们研究了一些关系最密切的成员。
Otop1具有两个鼠同源物-mOtop2和mOtop328(图3a)，它们与Otop1共享30％-34％的氨基酸同一性(图3b)。当在爪蟾卵母细胞中表达时，在基于NMDG的溶液中降低pHo时，Otop2和Otop3产生大电流(图3c)。Otop3显示出对H+的高选择性的证据；在测试的整个pH范围内(pH4-6；图3c,d)，Otop3电流强度随pHo呈线性增加，而Erev偏移46.3mV/log[H+](图6a)。相反，Otop2电流表现异常；它们在约pH5时达到饱和(图3c，d)，而Erev在pH4-6的范围内几乎没有变化(图6a)。Otop2的这些意外特征是通道蛋白固有的，因为在HEK-293细胞中测得的Otop2电流显示出非常相似的特性(图7)。Otop2和Otop3电流都几乎没有显示出电压依赖性的证据，就像Otop1一样(图6b)。当在HEK-293细胞中表达并用微荧光法测量时，Otop2和Otop3均响应pHo降低将质子传导到细胞质中(图6c，d)。有趣的是，Otop3转染的细胞中的pHi在返回到中性pHo后未能恢复，而Otop2与Otop1相比显示出更快的恢复，表明通道的H+传导性不同。因此，尽管Otop2和Otop3具有不同的特性，但它们都渗透了质子。
果蝇基因组中有与mOtop1相关的三个基因；它们编码预测的蛋白dmOTOPLa、dmOTOPLb和dmOTOPLc(图3a)，这些以前均未被表征。dmOtopLc是一种具有1576个氨基酸的蛋白，示出在同源区域中与Otop1的14.1％的氨基酸同一性，以及在其多个跨膜结构域中的>30％氨基酸同一性(图3b)。当在爪蟾卵母细胞中表达时，dmOTOPLc响应于降低细胞外pH而产生大电流(图3e)。像Otop1和Otop3一样，dmOTOPLc电流随着pHo的降低和Erev转移到更大的正电压而增加，这表明了质子选择性(图3e，f)。有趣的是，dmOTOPLc在pH6时比Otop1或Otop3传导相对较多的电流，并且电流幅值与pH之间的关系更浅(图3f)；这可以使通道具有更宽的动态范围。
这些数据一起表明，耳蝶呤家族的高度趋异和进化距离遥远的成员形成具有不同功能特性但具有渗透质子的共同能力的通道。
实施例3–通过耳蝶呤通道的电流引起可用微荧光法测量的细胞内pH和钙的变化。
为了确定通过耳蝶呤通道、mOtop1、mOtop2、mOtop3和hOtop1进入的质子是否可以导致可用细胞内pH敏感指示剂检测到的细胞内pH变化，我们在HEK-293中瞬时表达了每个通道细胞。确实，当我们使用膜渗透性pH敏感染料pHrodo红对mOtop1转染的细胞的细胞内pH成像并将细胞外pH从7.4降低至5.0时，我们观察到荧光变化很大，这表明细胞内pH的大变化(图1h)。当响应pH5溶液，使用pH指示剂pHrodo红(平均值+/-SEM)监测用hOtop1转染的HEK293细胞的细胞内pH变化时，观察到相似的结果(图8c和图8d)。在两种情况下，在模拟转染的细胞中均未观察到类似的反应(图1h)，这表明细胞内pH的变化是质子通过Otop1通道进入的结果。图7显示，用Otop2或Otop3转染并加载有pHrodo红的HEK293细胞在降低细胞外pH值后荧光变化很大，这表明这两个通道均响应pH降低而将质子传导到细胞质中(图6c，d)。有趣的是，返回到中性pHo后，Otop3转染的细胞的细胞内pH无法恢复，而与Otop1相比，Otop2显示出更快的恢复，这表明通道的H+传导性不同。
我们还测试了通过Otop1(图10A)、Otop2(图10B)和Otop3(图10C)的质子转运是否可以通过遗传编码的pH指示剂监测。为此，我们使用pHluorin，将其与每个通道共转染，或单独转染(作为对照)。在用Otop通道转染的HEK293细胞中，当外部pH降低(Otop1、Otop2和Otop3)或外部pH升高(Otop1和Otop2)时，从pHluorin检测到荧光发射的大变化。这些响应仅在用三个Otops之一转染的细胞中观察到，而在未转染的细胞中未观察到。
实施例4.响应于细胞外pH的变化，Otop1转染的HEK-293细胞中细胞内钙的升高。
我们还测试了质子通过Otop通道的进入是否会引起可通过荧光超滤法检测到的细胞内钙的变化。转染的细胞上加载有钙指示剂Fura2 AM，并暴露于细胞外pH从7.4到5.0的变化中。图9(左图)显示仅Otop1转染的细胞对细胞内钙的升高有反应(n＝8细胞)。Otop1转染的细胞与假转染的细胞之间存在显著差异(学生的t检验。***p<0.001)。作为对照，显示转染的细胞和未转染的细胞均对pH5的HOAc产生响应，pH5的HOAc穿透细胞膜并引起细胞内酸化，从而通过从细胞内缓冲液中释放钙来提高细胞内钙。
实施例5–材料和方法
动物
所有实验程序均经南加州大学IACUC批准。繁殖eGFP表达受TRPM5启动子22,23驱动并且YFP受Pkd2l1启动子(Pkd2l1-YFP)20驱动的小鼠，以产生对GFP和YFP均为阳性的小鼠(Trpm5-GFP/Pkd2l1-YFP)。
为了在HEK-293细胞中表达，使用In-HD克隆试剂盒(Clontech)将cDNA克隆到pcDNA3载体中。通过消除起始密码子并将框内Otop1亚克隆到pcDNA3中的5'YFP中，生成了N末端的NFP标记的mOtop1。通过Sanger测序(Genewiz)验证所有序列。使用T7mMESSAGE mMACHINE试剂盒(Thermo Fisher Scientific)试剂盒进行体外转录。用TURBODNase处理mRNA(37℃进行15分钟)，用RNA Clean&Concentrator试剂盒(Zymo)纯化，并通过凝胶电泳和Nanodrop(Thermo Scientific)检查完整性和浓度。
爪蟾卵母细胞电生理学
非洲爪蟾卵母细胞由Ecocyte Bioscience提供。将mRNA(0.2-20ng，50nL)用Nanoject II自动纳升注射器(Drummond)注入卵母细胞，并在18℃的Standard Barth溶液(SBS，Ecocyte Bioscience)中孵育1-3天，然后进行记录。
如先前所述进行双电极电压钳(TEVC)42。用P-97Flaming/Brown型微量移液器将硼硅酸盐玻璃移液器移出，并且其电阻在0.5-5MΩ的范围内。用GeneClamp500放大器(Axon)测量电流。通过重力驱动的灌注进行溶液交换。对于大多数实验，膜电位保持在-80mV，并且以每秒从-80mV到+80mV(1V/s)施加电压斜坡。将卵母细胞用100μM DIDS在无Na+的细胞外溶液中孵育2-3分钟，以抑制Ca2+激活的Cl-通道43,44，然后施加酸。
由ANOVA确定显著性。
卵母细胞电生理学溶液
爪蟾卵母细胞在ND96溶液中孵育，该溶液包含(以mM计)：100NaCl、2KCl、1.8CaCl2、2MgCl2、10HEPES，pH用HCl调节至7.4。为了测量响应于pH0值变化的电流变化，使用无钠溶液，其包含100N-甲基-D-葡糖胺(NMDG)、2KCl、1.8CaCl2、2MgCl2，并用10mM HEPESpH6.5-7.4或用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，10mM)pH 4-6缓冲。用HCl调节pH。如图所示，将以下化学药品添加到无钠溶液中：100μM 4,4'-二异硫氰基-2,2'-芪二磺酸(4,4'-Diisothiocyano-2,2'-stilbenedisulfonic acid：DIDS)，0.03-10ZnCl2、100μM金刚烷胺。
HEK-293细胞的转染
使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus Bio Corporation，Madison，WI)将Otop和GFP(5：1)共转染到HEK-293细胞(CRL-1573，ATCC)中。转染后于室温进行GFP阳性细胞的膜片钳记录和成像实验约24-48h。
膜片钳电生理
如先前所述进行全细胞膜片钳记录49。简而言之，用Axopatch200A或Axopatch200B放大器进行记录，用Digidata 1322a 16位数据采集系统数字化，用pClamp 8.2采集，并且用Clampfit 8.2(Molecular Devices，Palo Alto，CA)进行分析。记录以5kHz采样并以1kHz过滤。用硼硅酸盐玻璃制成电阻为2-4MΩ的移液管，在分析中仅使用达到千兆欧密封的记录。对于大多数实验，在实现整个电池配置后，膜电位保持在-80mV，或每秒从-80mV上升至+80mV(1V/s)一次。对于确定Otop1的质子选择性的实验，将膜电位保持在EH，以使细胞外溶液浸泡细胞，并且膜电位每秒从-80mV上升至+80mV(1V/s)。使用线性灌注管阵列(Warner Instruments，Hamden，CT)改变溶液。
膜片钳电生理溶液
泰罗德氏(Tyrode)溶液包含145mM NaCl、5mM KCl，1mM MgCl2、2mM CaCl2、20mM葡萄糖、10mM HEPES(pH 7.4，含NaOH)。移液器溶液包含120mM Cs-天冬氨酸、15mM CsCl、2mMMg-ATP、5mM EGTA、2.4mM CaCl2(100nM游离Ca2+)和10mM HEPES(pH 7.3，含CsOH)。对于其中pHo发生变化的实验(图1d-f)，细胞外溶液含有160mM NMDG、2mM CaCl2和10mM HEPES(pH7.4)、10mM MES(pH 6-5.5)或10mM HomoPIPES(pH 5-4)，用HCl调节pH。对于离子取代实验(图2a)，用等摩尔浓度的NaCl、LiCl或CsCl代替含160mM NMDG-Cl的溶液，并添加200μM阿米洛利(amiloride)以阻断内源性ENaC通道。对于高钙溶液，用40mM CaCl2代替60mM NMDG，以保持一致的克分子渗透压重量浓度。在图1d-f、3f-g和图7所示的实验中，添加100μMDIDS来阻断内源性Cl-电流45。在所有其他实验中都省略了DIDS。
为了测量质子选择性(图2b-e)，移液器溶液包含：130mM TMA-甲烷磺酸盐、5mMTEA-Cl、2mM MgATP、5mM EGTA、2.4mM CaCl2和80mM MES，其用约15mMTMA-OH滴定至(6.0)，并且用dH2O调节至305mOsm。基于NMDG(不含钠)的外部溶液包含：130mM NMDG-甲烷磺酸盐、2mM CaCl2、100mM HEPES(pH7.0–7.4)或100mM MES(pH5.5–6.5)或100mM HomoPIPES(pH4.5–5.25)，用约10–15mM NMDG-OH调节pH，用dH2O调节至305mOsm。含钠溶液包含：130mM甲磺酸钠，2mM CaCl2、100mM HEPES(pH7.0)或100mM MES(pH5.5)，pH用NaOH调节。在指出的地方，将ZnCl2(10mM，终浓度)、NMDG-Cl(20mM)、NaCl(20mM)或MgCl2(10mM)添加到无Na或含Na的溶液中，并用dH2O调节渗透压。在使用前测量每种溶液的pH，必要时进行调节。注意，由于pH值的微小变化(在pH5.5时[H+]的变化为约+/-0.01pH单位或约+/-3％)，测量的准确性受到了限制；在存在不同离子(例如图2a中所示)的情况下测量响应时，这可能会导致电流强度的微小变化。在移液器溶液和浴溶液(Tyrode's)之间测得的液体结电位为5mV，事后校正。为了使下水道输送的溶液和浴液之间的结电位最小化，使用1M KCl琼脂桥，并且调整浴液以包含与使用中的下水道类似的离子组成46。未校正<2mV的结电位。
pH成像
将用Otop和GFP共转染的HEK-293细胞与用CFP转染的HEK-293细胞混合，并在37℃下铺板于鱼精蛋白包被的盖玻片上。至少一小时后，按照制造商的说明使用PowerLoad浓缩液为细胞加载细胞内pH指示剂pHrodo红AM(分子探针)。使用U-MNIBA2 GFP过滤器立方体(Olympus)鉴定用Otop和GFP共转染的细胞，而使用U-N31044v2 CFP过滤器立方体(Olympus)或通过不存在荧光鉴定表达CFP的“假”转染细胞。pH成像光学元件和图像采集与先前描述的相同23,21。每个细胞的pHrodo红荧光强度响应于用MES(150mM NaCl，10mM MES，2mM CaCl2)或乙酸(150mM NaCl，10mM乙酸，2mM CaCl2)缓冲的pH5.0溶液来测量。荧光团被560nm的光激发，并使用U-N31004 Texas Red/Cy3.5过滤器立方体(ChromaTechnologies)，通过连接到Olympus IX71显微镜的Hamamatsu数字CCD相机检测在630nm下的发射。在首次施加酸之前，将每个细胞的pHrodo红荧光强度归一化为其在pH7.4溶液(150mM NaCl，10mM HEPES，2mM CaCl2)中的基线荧光。
数据分析与统计
所有数据均以平均值±SEM表示。除非另有说明。使用Graphpad Prism(GraphpadSoftware Inc)进行统计分析(ANOVA或学生t检验)。本研究中的样本量与文献中类似研究的样本量相似。在某些情况下，附图中所示的代表性数据缩小10倍，然后再输出到图形程序Origin(Microcal)和Coreldraw(Corel)。
对于图3，使用Align-X(Invitrogen)和NJplot由13种耳蝶呤家族蛋白的多序列比对创建了最大似然系统树48。登记号如下：人,NP_819056；牛,NP_001193713；小鼠,NP_766297；狗,XP_545943；小鸡,XP_015141351；青蛙,XP_012811170；斑纹鱼,NP_942098；m_OTOP2,NP_766389；m_OTOP3,NP_081408；dm_OTOPLa,AAF46050；dm_OTOPLb,AAN10385；dm_OTOPLc,ACL82893；ce_OTOPL1,CCD61337。参见Hughes等人28。使用TMHMM服务器2.0预测跨膜拓扑结构(在英特网上URL:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/，于2017年4月24日访问)。
实施例6-响应于细胞外pH的变化，Otop1转染的HEK-293细胞中细胞内钙的升高。
钙成像用于测定用Otop和GFP共转染的HEK-293细胞以及用CFP转染的HEK-293细胞的细胞内钙变化，所述细胞在37℃下用鱼精蛋白包被的盖玻片培养(图9)。至少一小时后，根据制造商的说明使用PowerLoad浓缩物为细胞加载细胞内钙指示剂fura-2AM(分子探针)。使用U-MNIBA2 GFP过滤器立方体(Olympus)鉴定用Otop和GFP共转染的细胞，而“假”转染的细胞则表达CFP(使用U-N31044v2 CFP过滤器立方体(Olympus)鉴定)或无荧光。钙成像光学系统和图像采集与所描述的相同(Chang等人,2010)。响应于用MES(150mM NaCl，10mMMES，2mM CaCl2)或乙酸(150mM NaCl，10mM乙酸，2mM CaCl2)缓冲的pH5.0溶液，测量每个细胞的Fura-2激发比率。
实施例7-参考文献
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实施例8–耳蝶呤序列
人-OTOP1(SEQ ID NO:1):
MLEGLGSPASPRAAASASVAGSSGPAACSPPSSSAPRSPESPAPRRGGVRASVPQKLAEMLSSQYGLIVFVAGLLLLLAWAVHAAGVSKSDLLCFLTALMLLQLLWMLWYVGRSSAHRRLFRLKDTHAGAGWLRGSITLFAVITVILGCLKIGYFIGFSECLSATEGVFPVTHSVHTLLQVYFLWGHAKDIIQSFKTLERFGVIHSVFTNLLLWANGVLNESKHQLNEHKERLITLGFGNITTVLDDHTPQCNCTPPTLCTAISHGIYYLYPFNIEYQILASTMLYVLWKNIGRKVDSHQHQKMQFKSDGVMVGAVLGLTVLAATIAVVVVYLIHIGRSKTKSESALIMFYLYAITLLMLMGAAGLAGIRIYRIDEKSLDESKNPARKLDSDLLVGTASGSWLISWGSILAILCAEGHPRYTWYNLPYSILAIVEKYIQNLFIFESIHREPEKLSEDIQTLRVVTVCNGNTMPLASSCPKSGGVARDVAPQGKDMPPAANGNVCMRESHDKEEEKQEESSWGGSPSPVRLPRFLQGNAKRKVLRNIAAFLFLCNISLWIPPAFGCRPEYDNGLEEIVFGFEPWIIVVNLAMPFSIFYRMHAAASLFEVYCKI
人-OTOP2(SEQ ID NO:2):
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果蝇–OTOP变体A(SEQ ID NO:8):
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果蝇–OTOP变体D(CG42265)(SEQ ID NO:9):
MDSSPDLSLKLRRGSSDSRDNFYMDFAQGIDSDIEEVDNTANNQEAGEVPPPPLPTVSLAEEVLLLVAPPPPPPSLLGQPLPTLTETDDIPPTPTPPPQQKDDEGDDEDEREEPVPEQDQGAPAAPSPPGSPINSVLELELIPPPPLSPMDDAGLRTDDDGEGEETDDAEEVAAIPPPHEMLDIESNPDEEEEEEEQEQASQEDTPKEEDEEEDDDKSTPPPPLPPLPSNFSYVQGHNLGQVTPPLTKSPSNSPSPPVTPPPCPELNISRMVSPPAQHISQIPPLTPSDESEGEAESQPNSPPLRLDAEQPPPDMDQPEPEDQPPEPENEPEPEPEPEPEPEPVSGAREDYSRSLDNEDESTTITTPPSNGYSASSIIAPPPEHFAELDEDRGFIPPPPLEQEPEEEVEEEEEEEEEELTKETDEISVDRESLQDQGGDSISSPRPASILTGSISTSVGGGAGGSPKPESRGPSRSGSQRSQLRSGSQQGSIAESRGGSRIGSRTGSVASAQAAGVLSPQASLKSQTSIRSQGQAGVRSPAGSIKSGSQRMQSPQAGEGAPAMPSPPLMRSPPPELARQMHSPPRITTPPRVCSPPLVSSPPKLAESAAAAVGVAATVKEQIGSSSSTAEPLEPSKPEPLKPPIATVSYQDEQKPSPPPTAAAAPAVTTTAATTAVTSQPRSHFTSSHHHYHLPHQFQHPHHQNHHTHSVRVPTPTVPSSYAPPPPPDSGSSSSPVDRRRLFMAGVAPPIAAGAGSLMAMPAEPAVAISPGRVSARSGSQHHVTIDESSLPSHKGNIQETPGPSGLIIGGGDGDGDRDIGGGGGPDSSDPPSSPGGSSSQPALSGSQADGQLALMYHSHQLTNYPVLPAIKRTHRPSFVYPPMPRVKAGDALATLFSALYGKLLVVMGIAFPMAEVISTYIPPSFYEVYYLYLYIGSMIFLLFMYATLIWGRPKLPVPIASPSKSATKASGTDSMDESDTDSNSVHHRLPPPIPVRRPSLLSPLGRRDAHYGSFYLRMGAVAFGIGSMIYSGLEFGQYFELNPDTKCHNVLLALTPATRMAFIFIQMYFIFLNNEQIKVYRYKIIARFGLMHMIGTNLAVWLNVLIQETKHEILTFYNPENRTLRISHRIPGHSRGHAIIQHDPTAHLRVPRGLKGPYQIFECRRTNIIGTLVQDASPFLFPCTIEYSLICAAILYVMWRSISRPQTPTPQRPDMISSPMKRSPHHYSVDCARAHKGLFVGILILVLTIISLIIFFVLISRPEFVAMAVTEVTICELLIYGTATIATLVGMIQIRHLQYDAYRSFSLDDILLVGAQTGSFLYNIFTVIAGHFTLRSDDMLVPINALASIVQTACQTMFILDASRRQAVSPEHLRKKPGREIVTFMLVVNLAMWAISTLEKSRAESHPIQLNFYGLWAWTIITHVSMPLAIFYRFHSTVCLCEIWKRAYKLKPTYMXEFARSRIQSIAQQQQFCEDLKTNLSYCYCSTTLAGGELETVEEVDSGESNSAEDAGAGAGSGGSRGSGGGAGAAEAGEAGEEGQQGGDSSCGLKAPIRALSPQSLNTEKAFCPVYVINGE
* * *
在具体实施方式、附图以及权利要求中所描述的说明性实施方案没有意图进行限制。在不背离本文所阐述的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，也可以做出其他变化。容易理解的是，可以以各种不同的配置来布置、替换、组合和设计如本文一般地描述的以及在附图中示出的本公开的各方面，所有这些都被明确地构想并且形成本公开的一部分。
对于本文的基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可根据上下文和/或应用将复数转换为单数和/或将单数转换为复数。为清楚起见，各种单数/复数置换在本文中可能明确阐述。
本领域技术人员会理解，一般而言，本文尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中所使用的术语通常意在作为“开放式”术语(例如，术语“包含”应当被解释为“包含但不限于”，术语“具有”应当被解释为“具有至少”，术语“包括”应当被解释为“包括但不限于”，等等)。本领域技术人员会进一步理解，如果意在所引介权利要求表述对象的具体数量，则这种意图会被明确记载在该权利要求中，而如果不存在这样的记载，便不存在这样的意图。例如，作为对理解的辅助，下面所附的权利要求可包含引介短语“至少一个”和“一或多个”的使用以引介权利要求表述对象。但是，这类短语的使用不应当被解释为暗示通过不定冠词“一”或“一个”对权利要求表述对象的引介将含有这种所引介权利要求表述对象的任何特定权利要求限制为只包含一个这种表述对象的发明，即使在同一权利要求包括引介短语“一个或多个”或“至少一个”以及诸如“一(a)”或“一个(an)”等不定冠词时亦如此(例如，“一”和/或“一个”通常应当被解释为是指“至少一个”或“一个或多个”)；对于用于引介权利要求表述对象的定冠词的使用而言亦同样如此。此外，即使明确记载了所引介权利要求表述对象的具体数量，本领域技术人员也会认识到，这种记载通常也应当被解释为是指至少是所记载的数量(例如，单单记载“两个表述对象”而没有其他修饰语，通常是指至少两个表述对象或者两或更多个表述对象)。此外，在使用与“A、B和C等中的至少一个”类似的惯用语的那些情况下，一般而言，这种结构意指本领域技术人员会理解的惯用意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”会包括但不限于只有A的系统、只有B的系统、只有C的系统、同时具有A和B的系统、同时具有A和C的系统、同时具有B和C的系统、和/或同时具有A、B和C的系统，等等)。在使用与“A、B或C等中的至少一个”类似的惯用语的那些情况下，一般而言，这种结构意指本领域技术人员会理解的惯用意义(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”会包括但不限于只有A的系统、只有B的系统、只有C的系统、同时具有A和B的系统、同时具有A和C的系统、同时具有B和C的系统、和/或同时具有A、B和C的系统，等等)。本领域技术人员还会理解，提出两或更多可选择项的几乎任何选言词和/或短语，无论是在说明书、权利要求书、还是在附图中，都应当被理解为预计包括其中一项、任一项、或两项的可能性。例如，短语“A或B”会被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
本领域技术人员应理解，在不脱离本技术的精神的情况下，可以进行多种和不同的修改。因此，应该清楚地理解，该技术的形式仅是示例性的，并且不意在限制该技术的范围。
本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文。
序列表
<110> 南加利福尼亚州大学
埃米莉·利曼
涂郁翔
<120> 作为药物发现的靶标的耳蝶呤质子通道
<130> 043871-0459804
<140> 待分配(To Be Assigned)
<141> 2018-07-27
<150> 62/537,900
<151> 2017-07-27
<160> 9
<170> PatentIn版3.5(PatentIn version 3.5)
<210> 1
<211> 612
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Leu Glu Gly Leu Gly Ser Pro Ala Ser Pro Arg Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ser Val Ala Gly Ser Ser Gly Pro Ala Ala Cys Ser Pro Pro Ser
20 25 30
Ser Ser Ala Pro Arg Ser Pro Glu Ser Pro Ala Pro Arg Arg Gly Gly
35 40 45
Val Arg Ala Ser Val Pro Gln Lys Leu Ala Glu Met Leu Ser Ser Gln
50 55 60
Tyr Gly Leu Ile Val Phe Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Ala Trp
65 70 75 80
Ala Val His Ala Ala Gly Val Ser Lys Ser Asp Leu Leu Cys Phe Leu
85 90 95
Thr Ala Leu Met Leu Leu Gln Leu Leu Trp Met Leu Trp Tyr Val Gly
100 105 110
Arg Ser Ser Ala His Arg Arg Leu Phe Arg Leu Lys Asp Thr His Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Trp Leu Arg Gly Ser Ile Thr Leu Phe Ala Val Ile Thr
130 135 140
Val Ile Leu Gly Cys Leu Lys Ile Gly Tyr Phe Ile Gly Phe Ser Glu
145 150 155 160
Cys Leu Ser Ala Thr Glu Gly Val Phe Pro Val Thr His Ser Val His
165 170 175
Thr Leu Leu Gln Val Tyr Phe Leu Trp Gly His Ala Lys Asp Ile Ile
180 185 190
Gln Ser Phe Lys Thr Leu Glu Arg Phe Gly Val Ile His Ser Val Phe
195 200 205
Thr Asn Leu Leu Leu Trp Ala Asn Gly Val Leu Asn Glu Ser Lys His
210 215 220
Gln Leu Asn Glu His Lys Glu Arg Leu Ile Thr Leu Gly Phe Gly Asn
225 230 235 240
Ile Thr Thr Val Leu Asp Asp His Thr Pro Gln Cys Asn Cys Thr Pro
245 250 255
Pro Thr Leu Cys Thr Ala Ile Ser His Gly Ile Tyr Tyr Leu Tyr Pro
260 265 270
Phe Asn Ile Glu Tyr Gln Ile Leu Ala Ser Thr Met Leu Tyr Val Leu
275 280 285
Trp Lys Asn Ile Gly Arg Lys Val Asp Ser His Gln His Gln Lys Met
290 295 300
Gln Phe Lys Ser Asp Gly Val Met Val Gly Ala Val Leu Gly Leu Thr
305 310 315 320
Val Leu Ala Ala Thr Ile Ala Val Val Val Val Tyr Leu Ile His Ile
325 330 335
Gly Arg Ser Lys Thr Lys Ser Glu Ser Ala Leu Ile Met Phe Tyr Leu
340 345 350
Tyr Ala Ile Thr Leu Leu Met Leu Met Gly Ala Ala Gly Leu Ala Gly
355 360 365
Ile Arg Ile Tyr Arg Ile Asp Glu Lys Ser Leu Asp Glu Ser Lys Asn
370 375 380
Pro Ala Arg Lys Leu Asp Ser Asp Leu Leu Val Gly Thr Ala Ser Gly
385 390 395 400
Ser Trp Leu Ile Ser Trp Gly Ser Ile Leu Ala Ile Leu Cys Ala Glu
405 410 415
Gly His Pro Arg Tyr Thr Trp Tyr Asn Leu Pro Tyr Ser Ile Leu Ala
420 425 430
Ile Val Glu Lys Tyr Ile Gln Asn Leu Phe Ile Phe Glu Ser Ile His
435 440 445
Arg Glu Pro Glu Lys Leu Ser Glu Asp Ile Gln Thr Leu Arg Val Val
450 455 460
Thr Val Cys Asn Gly Asn Thr Met Pro Leu Ala Ser Ser Cys Pro Lys
465 470 475 480
Ser Gly Gly Val Ala Arg Asp Val Ala Pro Gln Gly Lys Asp Met Pro
485 490 495
Pro Ala Ala Asn Gly Asn Val Cys Met Arg Glu Ser His Asp Lys Glu
500 505 510
Glu Glu Lys Gln Glu Glu Ser Ser Trp Gly Gly Ser Pro Ser Pro Val
515 520 525
Arg Leu Pro Arg Phe Leu Gln Gly Asn Ala Lys Arg Lys Val Leu Arg
530 535 540
Asn Ile Ala Ala Phe Leu Phe Leu Cys Asn Ile Ser Leu Trp Ile Pro
545 550 555 560
Pro Ala Phe Gly Cys Arg Pro Glu Tyr Asp Asn Gly Leu Glu Glu Ile
565 570 575
Val Phe Gly Phe Glu Pro Trp Ile Ile Val Val Asn Leu Ala Met Pro
580 585 590
Phe Ser Ile Phe Tyr Arg Met His Ala Ala Ala Ser Leu Phe Glu Val
595 600 605
Tyr Cys Lys Ile
610
<210> 2
<211> 562
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Ser Glu Glu Leu Ala Gln Gly Pro Lys Glu Ser Pro Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Ala Gly Pro Arg Glu Val Trp Lys Lys Gly Gly Arg Leu Leu Ser
20 25 30
Val Leu Leu Ala Val Asn Val Leu Leu Leu Ala Cys Thr Leu Ile Ser
35 40 45
Gly Gly Ala Phe Asn Lys Val Ala Val Tyr Asp Thr Asp Val Phe Ala
50 55 60
Leu Leu Thr Ala Met Met Leu Leu Ala Thr Leu Trp Ile Leu Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Arg Thr Val Arg Cys Pro Cys Ala Val Pro Tyr Arg Asp Ala
85 90 95
His Ala Gly Pro Ile Trp Leu Arg Gly Gly Leu Val Leu Phe Gly Ile
100 105 110
Cys Thr Leu Ile Met Asp Val Phe Lys Thr Gly Tyr Tyr Ser Ser Phe
115 120 125
Phe Glu Cys Gln Ser Ala Ile Lys Ile Leu His Pro Leu Ile Gln Ala
130 135 140
Val Phe Val Ile Ile Gln Thr Tyr Phe Leu Trp Val Ser Ala Lys Asp
145 150 155 160
Cys Val His Val His Leu Asp Leu Thr Trp Cys Gly Leu Met Phe Thr
165 170 175
Leu Thr Thr Asn Leu Ala Ile Trp Met Ala Ala Val Val Asp Glu Ser
180 185 190
Val His Gln Ser His Ser Tyr Ser Ser Ser His Ser Asn Ala Ser His
195 200 205
Ala Arg Leu Ile Ser Asp Gln His Ala Asp Asn Pro Val Gly Gly Asp
210 215 220
Ser Cys Leu Cys Ser Thr Ala Val Cys Gln Ile Phe Gln Gln Gly Tyr
225 230 235 240
Phe Tyr Leu Tyr Pro Phe Asn Ile Glu Tyr Ser Leu Phe Ala Ser Thr
245 250 255
Met Leu Tyr Val Met Trp Lys Asn Val Gly Arg Phe Leu Ala Ser Thr
260 265 270
Pro Gly His Ser His Thr Pro Thr Pro Val Ser Leu Phe Arg Glu Thr
275 280 285
Phe Phe Ala Gly Pro Val Leu Gly Leu Leu Leu Phe Val Val Gly Leu
290 295 300
Ala Val Phe Ile Ile Tyr Glu Val Gln Val Ser Gly Asp Gly Ser Arg
305 310 315 320
Thr Arg Gln Ala Leu Val Ile Tyr Tyr Ser Phe Asn Ile Val Cys Leu
325 330 335
Gly Leu Thr Thr Leu Val Ser Leu Ser Gly Ser Ile Ile Tyr Arg Phe
340 345 350
Asp Arg Arg Ala Met Asp His His Lys Asn Pro Thr Arg Thr Leu Asp
355 360 365
Val Ala Leu Leu Met Gly Ala Ala Leu Gly Gln Tyr Ala Ile Ser Tyr
370 375 380
Tyr Ser Ile Val Ala Val Val Ala Gly Thr Pro Gln Asp Leu Leu Ala
385 390 395 400
Gly Leu Asn Leu Thr His Ala Leu Leu Met Ile Ala Gln His Thr Phe
405 410 415
Gln Asn Met Phe Ile Ile Glu Ser Leu His Arg Gly Pro Pro Gly Ala
420 425 430
Glu Pro His Ser Thr His Pro Lys Glu Pro Cys Gln Asp Leu Thr Phe
435 440 445
Thr Asn Leu Asp Ala Leu His Thr Leu Ser Ala Cys Pro Pro Asn Pro
450 455 460
Gly Leu Val Ser Pro Ser Pro Ser Asp Gln Arg Glu Ala Val Ala Ile
465 470 475 480
Val Ser Thr Pro Arg Ser Gln Trp Arg Arg Gln Cys Leu Lys Asp Ile
485 490 495
Ser Leu Phe Leu Leu Leu Cys Asn Val Ile Leu Trp Ile Met Pro Ala
500 505 510
Phe Gly Ala Arg Pro His Phe Ser Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Tyr
515 520 525
Gly Tyr Ser Leu Trp Ala Val Ile Val Asn Ile Cys Leu Pro Phe Gly
530 535 540
Ile Phe Tyr Arg Met His Ala Val Ser Ser Leu Leu Glu Val Tyr Val
545 550 555 560
Leu Ser
<210> 3
<211> 596
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Met Gly Arg Gly Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ser Arg Trp Gly Arg
1 5 10 15
Ala Ser Arg Ala Ser Val Ser Pro Gly Arg Thr Ile Arg Ser Ala Pro
20 25 30
Ala Val Gly Glu Ala Gln Glu Thr Glu Ala Ala Pro Glu Lys Glu Asn
35 40 45
Arg Val Asp Val Gly Ala Glu Glu Arg Ala Ala Ala Thr Arg Pro Arg
50 55 60
Gln Lys Ser Trp Leu Val Arg His Phe Ser Leu Leu Leu Arg Arg Asp
65 70 75 80
Arg Gln Ala Gln Lys Ala Gly Gln Leu Phe Ser Gly Leu Leu Ala Leu
85 90 95
Asn Val Val Phe Leu Gly Gly Ala Phe Ile Cys Ser Met Ile Phe Asn
100 105 110
Lys Val Ala Val Thr Leu Gly Asp Val Trp Ile Leu Leu Ala Thr Leu
115 120 125
Lys Val Leu Ser Leu Leu Trp Leu Leu Tyr Tyr Val Ala Ser Thr Thr
130 135 140
Arg Arg Pro His Ala Val Leu Tyr Gln Asp Pro His Ala Gly Pro Leu
145 150 155 160
Trp Val Arg Gly Ser Leu Val Leu Phe Gly Ser Cys Thr Phe Cys Leu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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Thr Asn Phe Thr Arg Cys Gly Leu Met Leu Thr Leu Ala Thr Asn Leu
225 230 235 240
Leu Leu Trp Val Leu Ala Val Thr Asn Asp Ser Met His Arg Glu Ile
245 250 255
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435 440 445
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450 455 460
Asn Leu Phe Ile Ile Glu Gly Leu His Arg Arg Pro Leu Trp Glu Thr
465 470 475 480
Val Pro Glu Gly Leu Ala Gly Lys Gln Glu Ala Glu Pro Pro Arg Arg
485 490 495
Gly Ser Leu Leu Glu Leu Gly Gln Gly Leu Gln Arg Ala Ser Leu Ala
500 505 510
Tyr Ile His Ser Tyr Ser His Leu Asn Trp Lys Arg Arg Ala Leu Lys
515 520 525
Glu Ile Ser Leu Phe Leu Ile Leu Cys Asn Ile Thr Leu Trp Met Met
530 535 540
Pro Ala Phe Gly Ile His Pro Glu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Lys Asp
545 550 555 560
Phe Tyr Gly Tyr Gln Ile Trp Phe Ala Ile Val Asn Phe Gly Leu Pro
565 570 575
Leu Gly Val Phe Tyr Arg Met His Ser Val Gly Gly Leu Val Glu Val
580 585 590
Tyr Leu Gly Ala
595
<210> 4
<211> 600
<212> PRT
<213> 小白鼠(Mus.musculus)
<400> 4
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1 5 10 15
Ser Ser Arg Ala Ala Pro Ser Gly Ile Ala Ala Cys Pro Leu Ser Pro
20 25 30
Pro Pro Leu Ala Arg Gly Ser Pro Gln Ala Ser Gly Pro Arg Arg Gly
35 40 45
Ala Ser Val Pro Gln Lys Leu Ala Glu Thr Leu Ser Ser Gln Tyr Gly
50 55 60
Leu Asn Val Phe Val Ala Gly Leu Leu Phe Leu Leu Ala Trp Ala Val
65 70 75 80
His Ala Thr Gly Val Gly Lys Ser Asp Leu Leu Cys Val Leu Thr Ala
85 90 95
Leu Met Leu Leu Gln Leu Leu Trp Met Leu Trp Tyr Val Gly Arg Ser
100 105 110
Tyr Met Gln Arg Arg Leu Ile Arg Pro Lys Asp Thr His Ala Gly Ala
115 120 125
Arg Trp Leu Arg Gly Ser Ile Thr Leu Phe Ala Phe Ile Thr Val Val
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Lys Val Ala Tyr Phe Ile Gly Phe Ser Glu Cys Leu
145 150 155 160
Ser Ala Thr Glu Gly Val Phe Pro Val Thr His Ala Val His Thr Leu
165 170 175
Leu Gln Val Tyr Phe Leu Trp Gly His Ala Lys Asp Ile Ile Met Ser
180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Val Leu Asp Asp His Thr Pro Gln Cys Asn Cys Thr Pro Pro Ala
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Leu Cys Ser Ala Leu Ser His Gly Ile Tyr Tyr Leu Tyr Pro Phe Asn
260 265 270
Ile Glu Tyr Gln Ile Leu Ala Ser Thr Met Leu Tyr Val Leu Trp Lys
275 280 285
Asn Ile Gly Arg Arg Val Asp Ser Ser Gln His Gln Lys Met Gln Cys
290 295 300
Arg Phe Asp Gly Val Leu Val Gly Ser Val Leu Gly Leu Thr Val Leu
305 310 315 320
Ala Ala Thr Ile Ala Val Val Val Val Tyr Met Ile His Ile Gly Arg
325 330 335
Ser Lys Ser Lys Ser Glu Ser Ala Leu Ile Met Phe Tyr Leu Tyr Ala
340 345 350
Ile Thr Val Leu Leu Leu Met Gly Ala Ala Gly Leu Val Gly Ser Trp
355 360 365
Ile Tyr Arg Val Asp Glu Lys Ser Leu Asp Glu Ser Lys Asn Pro Ala
370 375 380
Arg Lys Leu Asp Val Asp Leu Leu Val Ala Thr Ala Ser Gly Ser Trp
385 390 395 400
Leu Leu Ser Trp Gly Ser Ile Leu Ala Ile Ala Cys Ala Glu Thr Arg
405 410 415
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420 425 430
Glu Lys Tyr Val Gln Asn Ile Phe Ile Ile Glu Ser Val His Leu Glu
435 440 445
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450 455 460
Cys Ser Ser Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ser Thr Leu Gly Ser Gln
465 470 475 480
Gly Met Ala Gln Asp Gly Ser Pro Ala Val Asn Gly Asn Leu Cys Leu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Arg Leu Leu Arg Asn Ile Thr Ala Phe Leu Phe Leu Cys Asn Ile Ser
530 535 540
Leu Trp Ile Pro Pro Ala Phe Gly Cys Arg Pro Glu Tyr Asp Asn Gly
545 550 555 560
Leu Glu Glu Ile Val Phe Gly Phe Glu Pro Trp Ile Ile Val Val Asn
565 570 575
Leu Ala Met Pro Phe Ser Ile Phe Tyr Arg Met His Ala Ala Ala Ala
580 585 590
Leu Phe Glu Val Tyr Cys Lys Ile
595 600
<210> 5
<211> 563
<212> PRT
<213> 小白鼠(Mus.musculus)
<400> 5
Met Ser Glu Glu Leu Val Pro His Pro Asn Glu Ser Leu Pro Gly Pro
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Arg Glu Val Trp Lys Lys Gly Gly Arg Leu Leu Ser
20 25 30
Val Leu Leu Ala Val Asn Val Leu Leu Leu Ala Cys Thr Leu Ile Ser
35 40 45
Gly Gly Ala Phe Asn Lys Val Ala Val Tyr Asp Thr Asp Val Phe Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Leu Arg Thr Ala Arg Cys Pro Asp Ala Val Pro Tyr Arg Asp Ala
85 90 95
His Ala Gly Pro Ile Trp Leu Arg Gly Gly Leu Val Leu Phe Gly Ile
100 105 110
Cys Thr Leu Val Met Asp Val Phe Lys Thr Gly Tyr Tyr Ser Ser Phe
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Cys Ile His Thr His Leu Asp Leu Thr Arg Cys Gly Leu Met Phe Thr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
Thr Met Leu Tyr Val Met Trp Lys Asn Val Gly Arg Leu Leu Ala Ser
260 265 270
Thr His Gly His Gly His Thr Pro Ser Arg Val Ser Leu Phe Arg Glu
275 280 285
Thr Phe Phe Ala Gly Pro Val Leu Gly Leu Leu Leu Phe Val Val Gly
290 295 300
Leu Ala Val Phe Ile Leu Tyr Glu Val Gln Val Ser Gly Glu Arg Gly
305 310 315 320
His Thr Arg Gln Ala Leu Val Ile Tyr Tyr Ser Phe Asn Ile Val Cys
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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Ile Ile Ser Ala Pro Arg Cys His Trp Arg Arg Arg Cys Leu Lys Asp
485 490 495
Ile Ser Leu Phe Leu Leu Leu Cys Asn Val Ile Leu Trp Ile Met Pro
500 505 510
Ala Phe Gly Ala Arg Pro His Phe Ser Asn Thr Val Glu Val Asp Phe
515 520 525
Tyr Gly Tyr Ser Leu Trp Ala Ala Ile Val Asn Ile Cys Leu Pro Phe
530 535 540
Gly Ile Phe Tyr Arg Met His Ala Val Ser Ser Leu Leu Glu Val Tyr
545 550 555 560
Val Leu Ser
<210> 6
<211> 577
<212> PRT
<213> 小白鼠(Mus.musculus)
<400> 6
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
Gly Ala His Pro Asn Arg Ser Pro Phe Arg Leu His Gly Thr Ile Phe
305 310 315 320
Gly Pro Leu Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Ala Gly Val Cys Val Phe
325 330 335
Val Leu Phe Gln Ile Glu Ala Ser Gly Pro Asp Ile Ala Arg Gln Tyr
340 345 350
Phe Thr Leu Tyr Tyr Ala Phe Tyr Val Ala Val Leu Pro Thr Met Ser
355 360 365
Leu Ala Cys Leu Ala Gly Thr Ala Ile His Gly Leu Glu Glu Arg Glu
370 375 380
Leu Asp Thr Leu Lys Asn Pro Thr Arg Ser Leu Asp Val Val Leu Leu
385 390 395 400
Met Gly Ala Ala Leu Gly Gln Met Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Ile Val
405 410 415
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420 425 430
Ala Tyr Ser Leu Leu Leu Ile Leu Gln His Ile Thr Gln Asn Leu Phe
435 440 445
Ile Ile Glu Gly Leu His Arg Arg Pro Leu Trp Glu Pro Ala Val Ser
450 455 460
Gly Val Met Glu Lys Gln Asp Val Glu Leu Pro Arg Arg Gly Ser Leu
465 470 475 480
Arg Glu Leu Gly Gln Asp Leu Arg Arg Ala Ser Arg Ala Tyr Ile His
485 490 495
Ser Phe Ser His Leu Asn Trp Lys Arg Arg Met Leu Lys Glu Ile Ser
500 505 510
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515 520 525
Gly Ile His Pro Glu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Lys Asp Phe Tyr Gly
530 535 540
Tyr Arg Thr Trp Phe Thr Ile Val Asn Phe Gly Leu Pro Leu Gly Val
545 550 555 560
Phe Tyr Arg Met His Ser Val Gly Gly Leu Val Glu Val Tyr Leu Gly
565 570 575
Ala
<210> 7
<211> 977
<212> PRT
<213> 果蝇(Drosophila)
<400> 7
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1 5 10 15
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Leu Asp Asn Arg Gln Ser Ala Ser Glu Ser Asn Gln Leu Gln Gly Asp
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100 105 110
Tyr Ala Ile Leu Leu Ile Val Val Cys Ile Ala Tyr Val Ile Ser Asp
115 120 125
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130 135 140
Tyr Leu Tyr Gly Val Ser Ile Leu Phe Leu Leu Tyr Val Phe Cys Phe
145 150 155 160
Leu Leu Gln Glu Ser Ser Cys Cys Asn Gly Gly Asn Gly Gly Ser Lys
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ala Ala Lys Gly Ala Ala Tyr Gln His Thr Leu Ala Lys Phe Leu Glu
210 215 220
Ala Pro Val Asp Ala Glu Val Ala Val Thr Pro Lys Asn Val Arg Lys
225 230 235 240
Arg Lys Thr Thr His Ser Asp Leu Thr His Gly Ser Phe Phe Leu Arg
245 250 255
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260 265 270
Glu Phe Gly Ser Phe Phe Glu Ile Pro Phe Asp Ser Pro Cys His His
275 280 285
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290 295 300
Gln Met Tyr Phe Ile Phe Met Asn Ala Arg Thr Arg Pro Pro Phe Gln
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Leu Asn Ile His Arg Phe Lys Val Ile Ala Arg Phe Gly Leu Met His
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Ser Leu Gly Met Gly Gly Asp Gln Ala Leu Asp Ser Ser Thr Thr Ser
435 440 445
Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Arg Ala Pro Phe Thr Thr Pro Asn Tyr
450 455 460
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465 470 475 480
Ser Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Gly Ser Ser Ser Thr Ala
485 490 495
Ser Ser Thr Thr Thr Ile Ser Pro Thr Ile Ser Ser Thr Thr Ile Pro
500 505 510
Ser Thr Thr Ile Ser Ser Thr Thr Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser
515 520 525
Pro Phe Ser Pro Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala
530 535 540
Leu Asn Leu Glu Thr Ser Gly Ser Glu Ser Pro Phe Gly Gly Leu Gln
545 550 555 560
Arg Ile Leu Ser Ser Ala Ala Pro Pro Ser Leu Ala Pro Val Asp Gly
565 570 575
Phe Gly Ser Ala Ser Ala Ala Thr Pro Thr Ser Gly Ser Gly Ala Gly
580 585 590
Ser Phe Val Asp Ser Phe Leu Ala Ser Thr Leu Ser Pro Ala Ser Ser
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Thr Gly Leu Val Ser Phe Glu Asn Leu Glu Ser Leu Asp Asn Ile Tyr
645 650 655
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660 665 670
Gly Arg Ile Asp Ile Met Gly Thr Ile Val Tyr Asp Ser Ala Pro Tyr
675 680 685
Leu Tyr Pro Phe Ile Ile Glu Tyr Ser Leu Ile Gly Ala Val Val Leu
690 695 700
Tyr Val Met Trp Lys His Ile Gly Arg Tyr Pro Gly Arg Met Asn Asp
705 710 715 720
Glu Asp Leu Glu His Arg Leu Glu Val Met Leu Ser Arg Arg Ala Val
725 730 735
Ala Met Ala Gln Gln Ala Arg Ser Gly Arg Val Asp Cys Val Gly Ser
740 745 750
Ser Lys Gly Leu Phe Phe Gly Leu Leu Leu Leu Val Gly Ala Leu Ile
755 760 765
Cys Leu Ile Leu Phe Phe Val Leu Val Arg His Gln Gln Phe Ser Leu
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Leu Ala Ile Tyr Leu Ala Asp Ala Ser His Cys Ile Leu Met Ala Phe
785 790 795 800
Ala Ile Leu Ala Ile Ile Val Gly Phe Ile Arg Val Lys Asn Leu Lys
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Phe Arg Cys Glu Glu Gln Ser Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu Arg Ile
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Ser Ala Phe Gly Leu Phe Thr Tyr Ser Val Phe Ser Ile Ile Ala Gly
835 840 845
Ser Leu Lys Val Leu Glu Ser Glu Pro Ser Leu Leu Val Thr Thr Thr
850 855 860
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885 890 895
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Ile Gln Arg Ile Thr Leu Pro Leu Cys Ile Phe His Arg Phe His Ser
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Ala Val Thr Leu Ala Glu Ile Trp Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Arg Leu
965 970 975
Glu
<210> 8
<211> 797
<212> PRT
<213> 果蝇(Drosophila)
<400> 8
Met Ser Leu Ile Asn Leu Lys Ser Lys Asp Met Tyr Asp Glu Pro Ile
1 5 10 15
Asn Leu Trp Arg Thr Lys Gln Arg Val His Tyr His His Asp Val Ile
20 25 30
Ser Lys Gly Asn Asp Ser His Arg Ser Ser Asp Ala Cys Glu Tyr Ile
35 40 45
Thr Ile Ser Ala Pro Lys Lys Ser Gly Ser Phe Ser Arg Ser Pro Pro
50 55 60
Ser Ser Leu Pro Thr Ser Val Pro Gly Thr Pro Arg His Ser Val Ala
65 70 75 80
Ala Thr Ser Asn Gln Val Ile Arg Tyr Ala Arg Thr Ser Cys Asp His
85 90 95
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100 105 110
Leu Ala Lys Ser Gln Thr Asn Leu Asp Leu Val Glu His Gly Ser Gln
115 120 125
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130 135 140
Ser Ala Cys Thr Leu Gln Val Ser Arg Arg Pro Ser Leu Leu Leu Gln
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Glu Ile Leu Thr Gln Arg Pro Pro Leu Phe Gly Arg Arg Asp Gly Asn
165 170 175
Gly Phe Leu Ser Pro Arg Thr Ala Lys Asn Gly Asn Leu Gln Gly Thr
180 185 190
Ala Ser Gly Ser Thr Ala Thr Ile Asn Phe Gln Ser Gly Ala Thr Ser
195 200 205
Ala Arg Asn Gly Ser Thr Ala Phe Phe Asp Asn Gly Ala Lys Ser Phe
210 215 220
Gln Ala Lys Gln Gln Lys Asp Lys Asn Arg Arg Thr Gly Asn Asp Ala
225 230 235 240
Ile Ser Ser Ala Leu Ser Ala Thr Tyr Cys Lys Leu Leu Val Leu Leu
245 250 255
Gly Val Cys Leu Pro Ile Thr Glu Val Ile Ser Asp Gln Ile Pro Thr
260 265 270
Tyr Val Tyr Gln Gly Phe Tyr Val Tyr Leu Tyr Val Gly Ser Ile Leu
275 280 285
Phe Val Ile Phe Leu Tyr Ile Ser Ala Phe Arg Asn Arg Ser Leu Phe
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Asn Ala Leu Lys Asp Tyr His Glu Lys Asn Ser Asn Val His Leu Lys
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His Lys Val Thr His Phe Gly Ser Phe Tyr Leu Arg Val Gly Ala Ile
325 330 335
Ala Phe Ala Ile Gly Thr Met Val Tyr Ser Gly Leu Glu Phe Gly Gln
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435 440 445
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465 470 475 480
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485 490 495
Ser Gly Cys Ser Arg Thr Thr Ile Met Gly Ala Leu Val Gln Gln Leu
500 505 510
Ser Pro Phe Leu Phe Pro Cys Thr Ile Glu Tyr Ser Leu Ile Cys Ala
515 520 525
Val Ile Leu Phe Glu Met Trp Lys Thr Val Lys Ser Ile Pro Asp Ile
530 535 540
Asp Lys Thr Arg Lys Asn Ser Val Lys Pro Ala Ala Ala Lys Pro Ala
545 550 555 560
His His Phe Ser Val Asp Cys Ser Gln Ser His Lys Gly Leu Phe Phe
565 570 575
Gly Ile Leu Ile Ile Val Met Thr Ile Ile Ser Met Ile Met Tyr Phe
580 585 590
Val Leu Tyr Thr Gln Pro Gly Tyr Glu Leu Val Ala Thr Gln Glu Val
595 600 605
Thr Leu Trp Glu Thr Phe Met Tyr Phe Met Cys Ala Ala Ala Val Ile
610 615 620
Thr Gly Met Ile Leu Met Arg Asp Leu Arg Tyr Ile Lys Asn Thr Ser
625 630 635 640
Asp Glu His His Ser Met Asp Leu Asp Asn Leu Leu Leu Ile Val Ala
645 650 655
Gln Thr Gly Val Tyr Leu Tyr Gly Met Phe Ser Ile Leu Gly Ser Tyr
660 665 670
Phe Ala Lys Trp Asp Thr Val Pro Asp Arg Val Glu Gly Ile Ile Ala
675 680 685
Glu Val Phe Gly Val Val Gln Thr Ser Leu Gln Thr Met Phe Ile Leu
690 695 700
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705 710 715 720
Pro Gly Arg Glu Ile Ile Thr Phe Leu Leu Val Ala Asn Ile Ala Ile
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Trp Phe Val Asn Thr Leu Ile Lys Gly Arg Ala Val Phe Arg Glu Ser
740 745 750
His Leu Glu Phe Phe Gly Val Trp Gly Trp Thr Ile Ile Thr His Ile
755 760 765
Ser Met Pro Leu Ala Ile Phe Tyr Arg Phe His Ser Thr Ile Cys Leu
770 775 780
Phe Glu Val Trp Lys Ile Thr Tyr Lys Ala Lys Ala His
785 790 795
<210> 9
<211> 1576
<212> PRT
<213> 果蝇(Drosophila)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1456)..(1456)
<223> Xaa可以是任何天然氨基酸(Xaa can be any naturally occurring aminoacid)
<400> 9
Met Asp Ser Ser Pro Asp Leu Ser Leu Lys Leu Arg Arg Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asp Ser Arg Asp Asn Phe Tyr Met Asp Phe Ala Gln Gly Ile Asp Ser
20 25 30
Asp Ile Glu Glu Val Asp Asn Thr Ala Asn Asn Gln Glu Ala Gly Glu
35 40 45
Val Pro Pro Pro Pro Leu Pro Thr Val Ser Leu Ala Glu Glu Val Leu
50 55 60
Leu Leu Val Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Gly Gln Pro
65 70 75 80
Leu Pro Thr Leu Thr Glu Thr Asp Asp Ile Pro Pro Thr Pro Thr Pro
85 90 95
Pro Pro Gln Gln Lys Asp Asp Glu Gly Asp Asp Glu Asp Glu Arg Glu
100 105 110
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115 120 125
Pro Gly Ser Pro Ile Asn Ser Val Leu Glu Leu Glu Leu Ile Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Leu Ser Pro Met Asp Asp Ala Gly Leu Arg Thr Asp Asp Asp
145 150 155 160
Gly Glu Gly Glu Glu Thr Asp Asp Ala Glu Glu Val Ala Ala Ile Pro
165 170 175
Pro Pro His Glu Met Leu Asp Ile Glu Ser Asn Pro Asp Glu Glu Glu
180 185 190
Glu Glu Glu Glu Gln Glu Gln Ala Ser Gln Glu Asp Thr Pro Lys Glu
195 200 205
Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Lys Ser Thr Pro Pro Pro Pro Leu
210 215 220
Pro Pro Leu Pro Ser Asn Phe Ser Tyr Val Gln Gly His Asn Leu Gly
225 230 235 240
Gln Val Thr Pro Pro Leu Thr Lys Ser Pro Ser Asn Ser Pro Ser Pro
245 250 255
Pro Val Thr Pro Pro Pro Cys Pro Glu Leu Asn Ile Ser Arg Met Val
260 265 270
Ser Pro Pro Ala Gln His Ile Ser Gln Ile Pro Pro Leu Thr Pro Ser
275 280 285
Asp Glu Ser Glu Gly Glu Ala Glu Ser Gln Pro Asn Ser Pro Pro Leu
290 295 300
Arg Leu Asp Ala Glu Gln Pro Pro Pro Asp Met Asp Gln Pro Glu Pro
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Glu Asp Gln Pro Pro Glu Pro Glu Asn Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu
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Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Val Ser Gly Ala Arg Glu Asp Tyr Ser
340 345 350
Arg Ser Leu Asp Asn Glu Asp Glu Ser Thr Thr Ile Thr Thr Pro Pro
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Ser Asn Gly Tyr Ser Ala Ser Ser Ile Ile Ala Pro Pro Pro Glu His
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Phe Ala Glu Leu Asp Glu Asp Arg Gly Phe Ile Pro Pro Pro Pro Leu
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Ser Pro Lys Pro Glu Ser Arg Gly Pro Ser Arg Ser Gly Ser Gln Arg
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Ser Gln Leu Arg Ser Gly Ser Gln Gln Gly Ser Ile Ala Glu Ser Arg
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Gly Ala Gly Ser Leu Met Ala Met Pro Ala Glu Pro Ala Val Ala Ile
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Ser Pro Gly Arg Val Ser Ala Arg Ser Gly Ser Gln His His Val Thr
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Pro Gly Pro Ser Gly Leu Ile Ile Gly Gly Gly Asp Gly Asp Gly Asp
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Pro Met Lys Arg Ser Pro His His Tyr Ser Val Asp Cys Ala Arg
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Ile Ile Ser Leu Ile Ile Phe Phe Val Leu Ile Ser Arg Pro Glu
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1565 1570 1575
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