制剂
阅读说明：本技术 制剂 (Preparation ) 是由 K·M·伍德 N·P·加德纳 R·R·沙 S·S·斯库利 R·马伊祖布 于 2018-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供具有改善的递送生物活性剂的特性的基于脂质纳米粒子的组合物、工程化的细胞和递送所述剂的方法。(The present invention provides lipid nanoparticle-based compositions, engineered cells, and methods of delivering bioactive agents with improved properties for delivery of the agents.)
具体实施方式
本公开提供用于将RNA，包括CRISPR/Cas组分RNA(“货物”)递送至细胞的脂质纳米粒子(LNP)组合物以及所述组合物的使用方法的实施方案。LNP组合物可展现相比于先前递送技术改善的特性。LNP组合物可含有如本文所定义的RNA组分和脂质组分。在某些实施方案中，RNA组分包括Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶。在某些实施方案中，货物或RNA组分包括编码2类Cas核酸酶的mRNA和指导RNA或编码指导RNA的核酸。还提供基因编辑方法和制备工程化细胞的方法。
CRISPR/Cas货物
经由LNP制剂递送的CRISPR/Cas货物可包括编码目标蛋白质的mRNA分子。举例而言，包括用于表达诸如绿色荧光蛋白(GFP)的蛋白质的mRNA，和RNA指导的DNA结合剂，或Cas核酸酶。提供LNP组合物，所述LNP组合物包括Cas核酸酶mRNA，例如允许在细胞中表达Cas9蛋白质的2类Cas核酸酶mRNA。另外，货物可含有一种或多种指导RNA或编码指导RNA的核酸。例如用于修复或重组的模板核酸也可包括在所述组合物中或模板核酸可用于本文所描述的方法中。
“mRNA”是指包含可翻译成多肽(即，可充当通过核糖体和氨基酰化tRNA进行翻译的基质)的开放阅读框的多核苷酸。mRNA可包含包括核糖残基或其类似物，例如2’-甲氧基核糖残基的磷酸酯-糖主链。在一些实施方案中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2’-甲氧基核糖残基或它们的组合组成。一般来讲，mRNA不含大量胸苷残基(例如0个残基或少于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处含有修饰的尿苷。
CRISPR/Cas核酸酶系统
所公开的制剂的一种组分为编码RNA指导的DNA结合剂(诸如Cas核酸酶)的mRNA。
如本文所用，“RNA指导的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或这种复合物的DNA结合亚单位，其中DNA结合活性具有序列特异性并且取决于RNA的序列。示例性RNA指导的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶以及它们的未活化形式(“dCasDNA结合剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”涵盖Cas裂解酶、Cas切口酶和dCas DNA结合剂。Cas裂解酶/切口酶和dCasDNA结合剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚单位；I型CRISPR系统的级联复合物，其Cas3亚单位；以及2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”为具有RNA指导的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A变体)，所述2类Cas裂解酶/切口酶还具有RNA指导的DNA裂解酶或切口酶活性；和2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白质以及它们的修饰形式。Cpf1蛋白质(Zetsche等人,Cell,163:1-13(2015))与Cas9同源并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以引用方式整体并入。参见例如Zetsche，表S1和表S3。参见例如Makarova等人,Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60:385-397(2015)。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂为2类Cas核酸酶。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有裂解酶活性，所述裂解酶活性也可称作双链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶(其可为例如II型、V型或VI型Cas核酸酶)。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2和C2c3蛋白以及它们的修饰形式。Cas9核酸酶的实例包括酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌和其他原核生物(参见例如下一段落中的清单)的II型CRISPR系统的那些，以及它们的修饰(例如工程化或突变)型式。参见例如U.S.2016/0312198A1；U.S.2016/0312199A1。Cas切口酶的其他实例包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物，或其Cas10、Csm1或Cmr2亚单位；和I型CRISPR系统的级联复合物，或其Cas3亚单位。在一些实施方案中，Cas核酸酶可来自IIA型、IIB型或IIC型系统。关于各种CRISPR系统和Cas核酸酶的论述，参见例如Makarova等人,Nat.Rev.Microbiol.9:467-477(2011)；Makarova等人,Nat.Rev.Microbiol,13:722-36(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60:385-397(2015)。
可衍生Cas核酸酶的非限制性示例性物种包括酿脓链球菌(Strept ococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属种(Streptococcussp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella su ccinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、伽马变形菌(Ga mmaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocid a)、产琥珀酸纤维杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodos pirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、产绿色链霉菌(Streptomyc es viridochromogenes)、产绿色链霉菌、粉红链孢囊菌(Streptosporang ium roseum)、粉红链孢囊菌、嗜酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusaci docaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、砷还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lacto bacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏细菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌属种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Micro cystisaeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋杆菌(A cetohalobiumarabaticum)、根制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptorbecscii)、脱硫菌候选种(Candidatus Desulfor udis)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium diffi cile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaero bius thermophilus)、Pelotomaculum thermopropionicum、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoa lteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobiumevestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospiraplate nsis)、节旋藻属种(Arthrospira sp.)、林氏藻属种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotogamobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcuspasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacterlari)、食清洁剂细小棒菌(Parviba culum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属种(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006和海洋无核氯菌(Acaryochloris marina)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自新凶手弗朗西斯菌的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属种的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自毛螺科菌ND2006的Cpf1核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶为来自以下的Cpf1核酸酶：土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、毛螺科菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、异域菌门菌(Peregrinibacteria bacterium)、帕库氏菌(Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌(Smithella)、氨基酸球菌属、白蚁甲烷支原体菌候选种(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在某些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
野生型Cas9具有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域裂解非靶DNA链，并且HNH结构域裂解靶DNA链。在一些实施方案中，Cas9核酸酶包含超过一个RuvC结构域和/或超过一个HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9核酸酶为野生型Cas9。在一些实施方案中，Cas9能够诱导靶DNA中的双链断裂。在某些实施方案中，Cas核酸酶可裂解dsDNA，它可裂解dsDNA的一个链，或者它可不具有DNA裂解酶或切口酶活性。示例性Cas9氨基酸序列以SEQ ID NO:3形式提供。包括起始密码子和终止密码子的示例性Cas9 mRNA ORF序列以SEQ ID NO:4形式提供。适于包括在融合蛋白中的示例性Cas9 mRNA编码序列以SEQ ID NO:10形式提供。
在一些实施方案中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区被不同蛋白质的一部分置换。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可被来自诸如Fok1的不同核酸酶的结构域置换。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为修饰的核酸酶。
在其他实施方案中，Cas核酸酶可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为第I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为Cas3蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶可来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，即，可切割一个DNA链以产生单链断裂，也称为“切口”。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas切口酶。切口酶为在dsDNA中产生切口，即，切割一个链但不切割DNA双螺旋的另一链的酶。在一些实施方案中，Cas切口酶为其中例如通过催化结构域的一种或多种改变(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点未活化的Cas核酸酶的型式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。关于Cas切口酶和示例性催化结构域改变的论述，参见例如美国专利号8,889,356。在一些实施方案中，Cas切口酶，诸如Cas9切口酶具有未活化的RuvC或HNH结构域。示例性Cas9切口酶氨基酸序列以SEQ ID NO:6形式提供。包括起始密码子和终止密码子的示例性Cas9切口酶mRNA ORF序列以SEQ ID NO:7形式提供。适于包括在融合蛋白中的示例性Cas9切口酶mRNA编码序列以SEQ ID NO:11形式提供。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂经修饰而仅含有一个功能核酸酶结构域。举例而言，剂蛋白质可经修饰以使得核酸酶结构域中的一者经突变或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶。
在一些实施方案中，Cas蛋白质核酸酶结构域中的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如Zetsche等人(2015)Cell Oct 22:163(3):759-771。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如Zetsche等人(2015)。其他示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西斯菌U112 Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施方案中，将与分别与靶序列的有义链和反义链互补的一对指导RNA组合提供编码切口酶的mRNA。在此实施方案中，指导RNA将切口酶引导至靶序列并且通过在靶序列的相对链上产生切口而引入DSB(即，双重切口)。在一些实施方案中，使用双重切口可提高特异性并减少脱靶效应。在一些实施方案中，连同靶向DNA的相对链的两个独立指导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双重切口。在一些实施方案中，连同被选择以紧密靠近的两个独立指导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双重切口。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂缺乏裂解酶和切口酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些实施方案中，dCas多肽为dCas9多肽。在一些实施方案中，缺乏裂解酶和切口酶活性的RNA指导的DNA结合剂或dCas DNA结合多肽为其中例如通过催化结构域的一种或多种改变(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点未活化的Cas核酸酶的型式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。参见例如U.S.2014/0186958A1；U.S.2015/0166980A1。示例性dCas9氨基酸序列以SEQ ID NO:8形式提供。包括起始密码子和终止密码子的示例性Cas9 mRNA ORF序列以SEQ ID NO:9形式提供。适于包括在融合蛋白中的示例性Cas9mRNA编码序列以SEQ ID NO:12形式提供。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含一个或多个异源功能结构域(例如为或包含融合多肽)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可促进将RNA指导的DNA结合剂输送至细胞核中。举例而言，异源功能结构域可为核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1-10个N LS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1-5个N LS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与一个NL S融合。在使用一个NLS的情况下，NLS可连接在RNA指导的DNA结合剂序列的N端或C端处。NLS也可插入RNA指导的DNA结合剂序列内。在其他实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与超过一个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与2、3、4或5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合。在某些情况下，两个NLS可相同(例如两个SV40 NLS)或不同。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂与连接在羧基末端处的两个SV40 NLS序列融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合，一个NLS连接在N端处并且一个连接在C端处。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与3个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可不与NLS融合。在一些实施方案中，NLS可为单份序列，诸如像SV40 NLS、PKKKRKV或PKKKRRV。在一些实施方案中，NLS可为二分序列，诸如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK。在具体实施方案中，单一PKKKRKV NLS可连接在RNA指导的DNA结合剂的C端处。一个或多个接头任选地包括在融合位点处。
在一些实施方案中，异源功能结构域可能够修改RNA指导的DNA结合剂的细胞内半衰期。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂的半衰期可提高。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂的半衰期可降低。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够提高RNA指导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够降低RNA指导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施方案中，蛋白质降解可由蛋白水解酶，诸如像蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶蛋白酶介导。在一些实施方案中，异源功能结构域可包含PEST序列。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可通过添加泛素或多泛素链来修饰。在一些实施方案中，泛素可为类泛素蛋白(UBL)。类泛素蛋白的非限制性实例包括小类泛素修饰因子(SUMO)、泛素交叉反应蛋白(UCRP，也称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰因子-1(URM1)、神经元-前驱体-细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中也称作Rub1)、人类白细胞抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)和自噬-12(ATG12)、Fau类泛素蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰因子-1(UFM1)和类泛素蛋白-5(UBL5)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可为标记结构域。标记结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施方案中，标记结构域可为荧光蛋白。合适荧光蛋白的非限制实例包括绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、翡翠色(Emerald)、Azami绿(Azami Green)、单Azami绿(MonomericAzami Green)、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、蓝宝石色(Sapphire)、T-蓝宝石色(T-sapphire))、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi青色(Midoriishi-Cyan))、红色荧光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed单色、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed单色(DsRed-Monomer)、HcRed串色(HcRed-Tandem)、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira橙色(Kusabira-Orange)、单Kusabira橙色(Monomeric Kusabira-Orange)、mTangerine、tdTomato)或任何其他合适的荧光蛋白。在其他实施方案中，标记结构域可为纯化标签和/或表位标签。非限制性的示例性标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)、壳质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(tandemaffinity purification，TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag1、Softag 3、链霉素、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、聚His和钙调蛋白。非限制性的示例性报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、荧光素酶或荧光蛋白。
在其他实施方案中，异源功能结构域可将RNA指导的DNA结合剂靶向至特定细胞器、细胞型、组织或器官。在一些实施方案中，异源功能结构域可将RNA指导的DNA结合剂靶向至粒线体。
在其他实施方案中，异源功能结构域可为效应结构域。当RNA指导的DNA结合剂被引导至其靶序列时，例如当Cas核酸酶通过gRNA被引导至靶序列时，效应结构域可修饰或影响靶序列。在一些实施方案中，效应结构域可选自核酸结合结构域、核酸酶结构域(例如非Cas核酸酶结构域)、表观遗传修饰结构域、转录活化结构域或转录阻抑结构域。在一些实施方案中，异源功能结构域为核酸酶，诸如FokI核酸酶。参见例如美国专利号9,023,649。在一些实施方案中，异源功能结构域为转录活化因子或阻抑因子。参见例如Qi等人,“Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific controlof gene expression,”Cell 152:1173-83(2013)；Perez-Pinera等人,“RNA-guided geneactivation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,”Nat.Methods 10:973-6(2013)；Mali等人,“CAS9transcriptional activators for target specificityscreening and paired nickases for cooperative genome engineering,”Nat.Biotechnol.31:833-8(2013)；Gilbert等人,“CRISPR-mediated modular RNA-guidedregulation of transcription in eukaryotes,”Cell 154:442-51(2013)。因此，RNA指导的DNA结合剂基本上变成可使用指导RNA引导以结合所需靶序列的转录因子。在某些实施方案中，DNA修饰结构域为甲基化结构域，诸如脱甲基化或甲基转移酶结构域。在某些实施方案中，效应结构域为DNA修饰结构域，诸如碱基编辑结构域。在特定实施方案中，DNA修饰结构域为将特异性修饰引入DNA中的核酸编辑结构域，诸如脱氨酶结构域。参见例如WO 2015/089406；U.S.2016/0304846。WO 2015/089406和U.S.2016/0304846中所述的核酸编辑结构域、脱氨酶结构域和Cas9变体以引用方式并入本文。
核酸酶可包含至少一个与指导RNA(“gRNA”)相互作用的结构域。另外，核酸酶可通过gRNA被引导至靶序列。在2类Cas核酸酶系统中，gRNA与核酸酶以及靶序列相互作用，使其引导与靶序列的结合。在一些实施方案中，gRNA为靶向裂解提供特异性，并且核酸酶可以是通用的并且与不同gRNA配对以裂解不同靶序列。2类Cas核酸酶可与以上列出的类型、直系同源物和示例性物种的gRNA支架结构配对。
指导RNA(gRNA)
在本公开的一些实施方案中，LNP制剂的货物包括至少一个gRNA。gRNA可将Cas核酸酶或2类Cas核酸酶导引至靶核酸分子上的靶序列。在一些实施方案中，gRNA与2类Cas核酸酶结合并且通过2类Cas核酸酶提供裂解特异性。在一些实施方案中，gRNA和Cas核酸酶可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物，诸如CRISPR/Cas9复合物，所述复合物可通过LNP组合物递送。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为V型CRISPR/Cas复合物，诸如Cpf1/指导RNA复合物。Cas核酸酶和同源gRNA可配对。与各2类Cas核酸酶配对的gRNA支架结构随特定CRISPR/Cas系统变化。
“指导RNA”、“gRNA”和简称“指导物”在本文中互换使用来指代crRNA(也称为CRISPR RNA)，或crRNA与trRNA(也称为tracrRNA)的组合。crRNA和trRNA可以单一RNA分子(单指导RNA，sgRNA)或以两个独立RNA分子(双指导RNA，dgRNA)形式缔合。“指导RNA”或“gRNA”是指各类型。trRNA可为天然存在的序列或与天然存在的序列相比具有修饰或改变的trRNA序列。
如本文所用，“指导序列”是指指导RNA中与靶序列互补并且用以通过RNA指导的DNA结合剂将指导RNA引导至靶序列以供结合或修饰(例如裂解)的序列。“指导序列”也可称作“靶序列”或“间隔序列”。指导序列的长度可为20个碱基对，例如在酿脓链球菌(即，SpyCas9)和相关Cas9同源物/直系同源物的情况下。较短或较长序列也可用作指导物，例如长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列处于例如基因中或染色体上，并且与指导序列互补。在一些实施方案中，指导序列与其相应靶序列之间的互补性或同一性的程度可为约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导序列与标靶区可为100％互补或相同的。在其他实施方案中，指导序列和标靶区可含有至少一个错配。举例而言，指导序列和靶序列可含有1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施方案中，指导序列和标靶区可含有1-4个错配，其中指导序列包含至少17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列和靶区可含有1、2、3或4个错配，其中指导序列包含20个核苷酸。
针对Cas蛋白质的靶序列包括基因组DNA的正链和负链两者(即，给定序列和所述序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白质的核酸底物为双链核酸。因此，在讲述指导序列“与靶序列互补”的情况下，应理解，指导序列可引导指导RNA结合至靶序列的反向互补序列。因此，在一些实施方案中，在指导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，指导序列与靶序列(例如不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同，不同之处在于指导序列中U取代T。
靶向序列的长度可取决于所使用的CRISPR/Cas系统和组分。举例而言，来自不同细菌物种的不同2类Cas核酸酶具有改变的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或大于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列长度比天然存在的CRISPR/Cas系统的指导序列长或短0、1、2、3、4或5个核苷酸。在某些实施方案中，Cas核酸酶和gRNA支架将衍生自相同CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，靶向序列可包含或由18-24个核苷酸组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含或由19-21个核苷酸组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含或由20个核苷酸组成。
在一些实施方案中，sgRNA为能够通过Cas9蛋白质介导RNA指导的DNA裂解的“Cas9sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA为能够通过Cpf1蛋白质介导RNA指导的DNA裂解的“Cpf1sgRNA”。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cas9蛋白质形成活性复合物并且介导RNA指导的DNA裂解的crRNA和tracr RNA。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cpf1蛋白质形成活性复合物并且介导RNA指导的DNA裂解的crRNA。参见Zetsche 2015。
本发明的某些实施方案还提供编码本文所述的gRNA的核酸，例如表达盒。“指导RNA核酸”在本文中用于指代指导RNA(例如sgRNA或dgRNA)和指导RNA表达盒，所述指导RNA表达盒为编码一个或多个指导RNA的核酸。
在一些实施方案中，核酸可为DNA分子。在一些实施方案中，核酸可包含编码crRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸序列包含由来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分侧接的靶向序列。在一些实施方案中，核酸可包含编码tracr RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由两个独立核酸编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相对链编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相同链编码。在一些实施方案中，gRNA核酸编码sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cas9核酸酶sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cpf1核酸酶sgRNA。
编码指导RNA的核苷酸序列能够可操作地连接于至少一个转录或调控控制序列，诸如启动子、3'UTR或5'UTR。在一个实例中，启动子可为tRNA启动子，例如tRNALys3，或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人,RNA.2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic Acids Res.200735:2620–2628。在某些实施方案中，启动子可通过RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例还包括U6和H1启动子。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可与小鼠或人类U6启动子可操作地连接。在一些实施方案中，gRNA核酸为修饰的核酸。在某些实施方案中，gRNA核酸包括修饰的核苷或核苷酸。在一些实施方案中，gRNA核酸包括5'端修饰，例如修饰的核苷或核苷酸以稳定和阻止核酸整合。在一些实施方案中，gRNA核酸包含双链DNA，所述双链DNA在各链上具有5'端修饰。在某些实施方案中，gRNA核酸包括反向双脱氧-T或反向无碱基核苷或核苷酸作为5'端修饰。在一些实施方案中，gRNA核酸包括标记，诸如生物素、脱硫生物素-TEG(desthiobioten-TEG)、地高辛和荧光标记物，包括例如FAM、ROX、TAMRA和AlexaFluor。
在某些实施方案中，超过一个gRNA核酸，诸如gRNA可用于CRISPR/Cas核酸酶系统。各gRNA核酸可含有不同靶向序列，使得CRISPR/Cas系统裂解超过一个靶序列。在一些实施方案中，一个或多个gRNA可在CRISPR/Cas复合物内具有相同或不同特性，诸如活性或稳定性。在使用超过一个gRNA的情况下，各gRNA可编码于相同或不同gRNA核酸上。用于驱动超过一个gRNA的表达的启动子可相同或不同。
修饰的RNA
在某些实施方案中，LNP组合物包含修饰的RNA。
修饰的核苷或核苷酸可存在于RNA，例如gRNA或mRNA中。包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA或mRNA例如称作“修饰的”RNA，用于描述替代或外加典型A、G、C和U残基使用的一种或多种非天然和/或天然存在的组分或配置的存在。在一些实施方案中，修饰的RNA由非典型核苷或核苷酸合成，此处称作“修饰的”。
修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一者或多者：(i)磷酸二酯主链键联中的非键联磷酸氧中的一者或两者和/或键联磷酸氧中的一者或多者的改变，例如置换(示例性主链修饰)；(ii)核糖成分，例如核糖上的2'羟基的改变，例如置换(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头批量置换磷酸酯部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或置换，包括用非典型核碱基(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸酯主链的置换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)寡核苷酸的3'端或5’端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或者置换或部分、帽或接头的缀合(此类3'或5’帽修饰可包括糖和/或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或置换(示例性糖修饰)。某些实施方案包含mRNA、gRNA或核酸的5'端修饰。某些实施方案包含mRNA、gRNA或核酸的3'端修饰。修饰的RNA可含有5'端和3'端修饰。修饰的RNA可在非末端位置含有一个或多个修饰的残基。在某些实施方案中，gRNA包括至少一个修饰的残基。在某些实施方案中，mRNA包括至少一个修饰的残基。
如本文所用，如果第一序列与第二序列的比对显示全部第二序列的X％或更多的位置与第一序列相匹配，则第一序列视为“包含与第二序列具有至少X％同一性的序列”。举例而言，序列AAGA包含与序列AAG具有100％同一性的序列，因为由于对第二序列的全部三个位置均存在匹配，所以比对将产生100％同一性。RNA与DNA之间的差异(一般来讲，尿苷更换为胸苷或反之亦然)和核苷类似物，诸如修饰的尿苷的存在不会造成多核苷酸之间同一性或互补性的差异，只要相关核苷酸(诸如胸苷、尿苷或修饰的尿苷)具有相同互补序列(例如针对全部胸苷、尿苷或修饰的尿苷的腺苷；另一实例为胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者具有鸟苷或修饰的鸟苷作为互补序列)即可。因此，举例而言，序列5'-AXG(其中X为任何修饰的尿苷，诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)视为与AUG具有100％同一性，因为两者与同一序列(5'-CAU)完全互补。示例性比对算法为史密斯-沃特曼算法(Smith-Watermanalgorithm)和尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)，这些技术在本领域中是众所周知的。本领域的技术人员应理解何种算法选择和参数设置适合于待比对的给定序列对；对于具有一般类似长度和针对氨基酸的＞50％预期同一性或针对核苷酸的＞75％预期同一性的序列而言，由EBI于www.ebi.ac.uk网站服务器提供的尼德曼-翁施算法接口的具有默认设置的尼德曼-翁施算法通常为合适的。
mRNA
在一些实施方案中，本文所公开的组合物或制剂包含mRNA，所述mRNA包含编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶，或如本文所述的2类Cas核酸酶的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，提供、使用或施用mRNA，所述mRNA包含编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶或2类Cas核酸酶的ORF。在一些实施方案中，编码RNA指导的DNA结合剂的ORF为“修饰的RNA指导的DNA结合剂ORF”或简称为“修饰的ORF”，其作为简写使用以指示ORF以如下方式中的一者或多者来修饰：(1)修饰的ORF的尿苷含量在其最小尿苷含量至最小尿苷含量的150％范围内；(2)修饰的ORF的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的150％范围内；(3)修饰的ORF与SEQ ID NO:1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者至少90％同一性；(4)修饰的ORF由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为给定氨基酸的最小尿苷密码子，例如具有最少尿苷(除了苯丙氨酸的密码子(其中最小尿苷密码子具有2个尿苷)之外通常为0或1)的密码子；或(5)修饰的ORF包含至少一个修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的ORF以前述方式中的至少两者、三者或四者进行修饰。在一些实施方案中，修饰的ORF包含至少一个修饰的尿苷并且以上述(1)-(4)中的至少一者、两者、三者或全部进行修饰。
“修饰的尿苷”在本文中用于指代除胸苷外的与尿苷具有相同氢键受体并且与尿苷存在一种或多种结构差异的核苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为取代的尿苷，即，其中一个或多个非质子取代基(例如烷氧基，诸如甲氧基)替代质子的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为取代的假尿苷，即，其中一个或多个非质子取代基(例如烷基，诸如甲基)替代质子的假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为取代的尿苷、假尿苷或取代的假尿苷中的任一者。
如本文所用，“尿苷位置”是指多核苷酸中由尿苷或修饰的尿苷占据的位置。因此，举例而言，其中“100％的尿苷位置为修饰的尿苷”的多核苷酸在将为相同序列的常规RNA(其中所有碱基均为标准A、U、C或G碱基)中的尿苷的每个位置处均含有修饰的尿苷。除非另外指明，否则本公开中或附随本公开的序列表(sequence table/sequence listing)的多核苷酸序列中的U可为尿苷或修饰的尿苷。
表1.最小尿苷密码子
在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可由一组密码子组成，其中至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为最小尿苷密码子的表中所列的密码子。在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可包含与SEQ ID NO:1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。
在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可包含与SEQ ID NO:1、4、7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。
在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF的尿苷含量可在其最小尿苷含量至最小尿苷含量的150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％范围内。
在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF的尿苷二核苷酸含量可在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％范围内。
在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可至少在一个、多个或所有尿苷位置包含修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在5位处，例如用卤素、甲基或乙基修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在1位处，例如用卤素、甲基或乙基修饰的假尿苷。修饰的尿苷可为例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置为修饰的尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为修饰的尿苷，例如5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。
在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可包含降低的尿苷二核苷酸含量，诸如最低可能的尿苷二核苷酸(UU)含量，例如(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子(如上文所论述)和(b)编码与给定ORF相同的氨基酸序列的ORF。尿苷二核苷酸(UU)含量可以绝对术语表示为ORF中的UU二核苷酸的计数或基于比率，表示为尿苷二核苷酸的尿苷所占据的位置的百分比(例如，AUUAU的尿苷二核苷酸含量将为40％，因为尿苷二核苷酸的尿苷占据了5个位置中的2个)。出于评估最小尿苷二核苷酸含量的目的，修饰的尿苷残基视为等效于尿苷。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自表达的哺乳动物mRNA，诸如组成性表达的mRNA的UTR。如果mRNA在健康成年哺乳动物的至少一个组织中连续转录，则将其视为在哺乳动物中组成性表达。在一些实施方案中，mRNA包含来自表达的哺乳动物RNA，诸如组成性表达的哺乳动物mRNA的5'UTR、3'UTR或5'和3’UTR。肌动蛋白mRNA为组成性表达的mRNA的实例。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自羟基类固醇17-β脱氢酶4(HSD17B4或HSD)的UTR，例如来自HSD的5'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自球蛋白mRNA，例如人类α球蛋白(HBA)mRNA、人类β球蛋白(HBB)mRNA或非洲爪蟾(Xenopus laevis)β球蛋白(XBG)mRNA的UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自球蛋白mRNA，诸如HBA、HBB或XBG的5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的5'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的3'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、热休克蛋白90(Hsp90)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白、α-微管蛋白、肿瘤蛋白(p53)或表皮生长因子受体(EGFR)的5'和3’UTR。
在一些实施方案中，mRNA包含来自同一来源，例如组成性表达的mRNA，诸如肌动蛋白、白蛋白或球蛋白(诸如HBA、HBB或XBG)的5'和3'UTR。
在一些实施方案中，mRNA不包含5'UTR，例如在5'帽与起始密码子之间不存在额外核苷酸。在一些实施方案中，mRNA在5'帽与起始密码子之间包含Kozak序列(下文所述)，但不具有任何额外5'UTR。在一些实施方案中，mRNA不包含3'UTR，例如在终止密码子与聚腺苷酸(poly-A)尾之间不存在额外核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA包含Kozak序列。Kozak序列可影响翻译起始和由mRNA翻译的多肽的总产量。Kozak序列包括可充当起始密码子的甲硫氨酸密码子。最小Kozak序列为NNNRUGN，其中以下中的至少一者为成立的：第一个N为A或G并且第二个N为G。在核苷酸序列的情形下，R意指嘌呤(A或G)。在一些实施方案中，Kozak序列为RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGG或RNNAUGG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个或两个错配的rccRUGg。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个或两个错配的rccAUGg。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个或三个错配的gccRccAUGG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个、三个或四个错配的gccAccAUG。在一些实施方案中，Kozak序列为GCCACCAUG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个、三个或四个错配的gccgccRccAUGG。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:43具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:43的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:44具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:44的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:56具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:56的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:57具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:57的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:58的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:59具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:59的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:60具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:60的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:61具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:61的ORF(即，SEQ ID NO:4)被SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF取代。
在一些实施方案中，mRNA包含SEQ ID NO:7、9、10、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者的替代ORF。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO 43、44或56-61的任选地被取代的序列的同一性程度为95％。在一些实施方案中，与SEQ ID NO43、44或56-61的任选地被取代的序列的同一性程度为98％。在一些实施方案中，与SEQ ID NO 43、44或56-61的任选地被取代的序列的同一性程度为99％。在一些实施方案中，与SEQ ID NO 43、44或56-61的任选地被取代的序列的同一性程度为100％。
在一些实施方案中，本文所公开的mRNA包含5'帽，诸如Cap0、Cap1或Cap2。5'帽通常为通过5'-三磷酸连接至mRNA的5'至3'链的第一核苷酸，即，第一帽近端核苷酸的5’位的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可被进一步修饰，如下文例如关于ARCA所论述)。在Cap0中，mRNA的第一和第二帽近端核苷酸的核糖均包含2'-羟基。在Cap1中，mRNA的第一和第二转录核苷酸的核糖分别包含2'-甲氧基和2'-羟基。在Cap2中，mRNA的第一和第二帽近端核苷酸的核糖均包含2'-甲氧基。参见例如Katibah等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA111(33):12025-30；Abbas等人(2017)Proc Natl Acad Sci USA114(11):E2106-E2115。大多数内源性高等真核生物mRNA，包括哺乳动物mRNA(诸如人类mRNA)包含Cap1或Cap2。归因于通过先天免疫系统的组分，诸如IFIT-1和IFIT-5识别为“非自体(non-self)”，Cap0以及与Cap1和Cap2不同的其他帽结构在哺乳动物，诸如人类中可呈免疫原性，其可导致细胞因子，包括I型干扰素水平升高。先天免疫系统的组分，诸如IFIT-1和IFIT-5还可与eIF4E竞争结合具有除Cap1或Cap2外的帽的mRNA，从而潜在地抑制mRNA翻译。
帽可以共转录方式包括在内。举例而言，ARCA(抗反向帽类似物；Thermo FisherScientific目录号AM8045)为包含连接至鸟嘌呤核糖核苷酸的5'位的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸的帽类似物，其可在起始时体外并入转录物中。ARCA产生Cap0帽，其中第一帽近端核苷酸的2'位为羟基。参见例如Stepinski等人,(2001)“Synthesis andproperties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse’cap analogs7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG,”RNA 7:1486-1495。ARCA结构显示如下。
CleanCapTM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechn ologies目录号N-7113)或CleanCapTM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)p G；TriLink Biotechnologies目录号N-7133)可用于以共转录方式提供Cap1结构。CleanCapTM AG和CleanCapTM GG的3'-O-甲基化型式也可分别以目录号N-7413和N-7433购自TriLink Biotechnologies。Cl eanCapTM AG结构显示如下。
或者，可以转录后方式将帽添加至RNA。举例而言，牛痘加帽酶可商购获得(NewEngland Biolabs目录号M2080S)，并且具有由其D1亚单位提供的RNA三磷酸酶和鸟苷酰基转移酶活性，和由其D12亚单位提供的鸟嘌呤甲基转移酶。因此，在S-腺苷甲硫氨酸和GTP存在下，可将7-甲基鸟嘌呤添加至RNA，以产生Cap0。参见例如Guo,P.和Moss,B.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4023-4027；Mao,X.和Shuman,S.(1994)J.Biol.Chem.269,24472-24479。
在一些实施方案中，mRNA还包含聚腺苷酸化(poly-A)尾。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个腺嘌呤，任选地至多300个腺嘌呤。在一些实施方案中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100个腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，poly-A尾在poly-A尾中的一个或多个位置处被一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚”“中断”。poly-A尾可包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸，但也包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的poly-A尾可包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔中断腺嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA还包含聚腺苷酸化(poly-A)尾。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个腺嘌呤，任选地至多300个腺嘌呤。在一些实施方案中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100个腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，poly-A尾在poly-A尾中的一个或多个位置处被一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚”“中断”。poly-A尾可包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸，但也包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的poly-A尾可包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔中断腺嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸定位成中断连续腺嘌呤核苷酸，以使得poly(A)结合蛋白可结合至一段连续腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-100个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸在一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个腺嘌呤核苷酸之后并且之后为至少8个连续腺嘌呤核苷酸。
poly-A尾可包含一个连续腺嘌呤核苷酸序列，之后为一个或多个非腺嘌呤核苷酸，任选地继之以额外腺嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，poly-A尾包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或2-10个非腺嘌呤核苷酸的一个连续段。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些情况下，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情况下，非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸为胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸为胸腺嘧啶核苷酸。在其中存在超过一个非腺嘌呤核苷酸的一些情况下，非腺嘌呤核苷酸可选自：a)鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；b)鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或d)鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。包含非腺嘌呤核苷酸的示例性poly-A尾以SEQ ID NO:62形式提供。
在一些实施方案中，对mRNA进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀、酒精沉淀或等效方法，例如如本文所述)对mRNA进行纯化。在一些实施方案中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等效方法(例如如本文所述)对mRNA进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者对mRNA进行纯化。
在一些实施方案中，与本文所公开的mRNA组合提供至少一种gRNA。在一些实施方案中，以与mRNA分离的分子的形式提供gRNA。在一些实施方案中，以本文所公开的mRNA的一部分，诸如UTR的一部分的形式提供gRNA。
化学修饰的gRNA
在一些实施方案中，gRNA是经化学修饰的。包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA称作“修饰的”gRNA或“化学修饰的”gRNA，用于描述替代或外加典型A、G、C和U残基使用的一种或多种非天然和/或天然存在的组分或配置的存在。在一些实施方案中，修饰的gRNA由非典型核苷或核苷酸合成，此处称作“修饰的”。修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一者或多者：(i)磷酸二酯主链键联中的非键联磷酸氧中的一者或两者和/或键联磷酸氧中的一者或多者的改变，例如置换(示例性主链修饰)；(ii)核糖成分，例如核糖上的2'羟基的改变，例如置换(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头批量置换磷酸酯部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或置换，包括用非典型核碱基(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸酯主链的置换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)寡核苷酸的3'端或5’端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或者置换或部分、帽或接头的缀合(此类3'或5’帽修饰可包括糖和/或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或置换(示例性糖修饰)。
在一些实施方案中，gRNA在一些或全部尿苷位置处包含修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在5位处，例如用卤素或C1-C6烷氧基修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在1位处，例如用C1-C6烷基修饰的假尿苷。修饰的尿苷可为例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置为修饰的尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为修饰的尿苷，例如5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。
化学修饰(诸如以上列出的那些)可组合以得到修饰的gRNA，所述修饰的gRNA包含可具有两个、三个、四个或更多个修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)。举例而言，修饰的残基可具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的各碱基是修饰的，例如所有碱基具有修饰的磷酸酯基团，诸如硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，gRNA分子的所有或基本上所有磷酸酯基团被硫代磷酸酯基团置换。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的5'端处或附近包含至少一个修饰的残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的3'端处或附近包含至少一个修饰的残基。
在一些实施方案中，gRNA包含一个、两个、三个或更多个修饰的残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA中至少5％(例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的位置为修饰的核苷或核苷酸。
未修饰的核酸可易于通过例如细胞内核酸酶或血清中发现的那些核酸酶降解。举例而言，核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。因此，在一方面，本文所述的gRNA可含有一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如以引入朝向细胞内核酸酶或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，本文所述的修饰的gRNA分子可在体内和离体引入至细胞群体中时展现减少的先天性免疫反应。术语“先天性免疫反应”包括对外源性核酸(包括单链核酸)的细胞反应，涉及诱导细胞因子(特别是干扰素)表达和释放，和细胞死亡。
在主链修饰的一些实施方案中，修饰的残基的磷酸酯基团可通过用不同取代基置换一个或多个氧来加以修饰。另外，修饰的残基，例如存在于修饰的核酸中的修饰的残基可包括用如本文所述的修饰的磷酸酯基团批量置换未修饰的磷酸酯部分。在一些实施方案中，磷酸酯主链的主链修饰可包括产生不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的改变。
修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子为非手性的。然而，用以上原子或原子组中的一者置换非桥联氧中的一者可使得磷原子为手性的。立体对称磷原子可具有“R”构型(本文中为Rp)或“S”构型(本文中为Sp)。主链也可通过用氮(桥联氨基磷酸酯)、硫(桥联硫代磷酸酯)和碳(桥联亚甲基膦酸酯)置换桥联氧(即，连接磷酸酯与核苷的氧)来加以修饰。置换可发生在任一连接氧或两个连接氧处。
磷酸酯基团可在某些主链修饰中被不含磷的连接基团置换。在一些实施方案中，带电磷酸酯基团可被中性部分置换。可置换磷酸酯基团的部分的实例可包括但不限于例如膦酸甲酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲氧基甲基亚氨基。
模板核酸
本文所公开的组合物和方法可包括模板核酸。模板可用于在Cas核酸酶的靶位点处或附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括将模板引入至细胞。在一些实施方案中，可提供单一模板。在其他实施方案中，可提供两种或更多种模板以使得编辑可发生在两个或更多个靶位点处。举例而言，可提供不同模板以编辑细胞中的单一基因，或细胞中的两种不同基因。
在一些实施方案中，模板可用于同源重组中。在一些实施方案中，同源重组可导致模板序列或模板序列的一部分整合至靶核酸分子中。在其他实施方案中，模板可用于同源定向修复，同源定向修复涉及核酸中裂解位点处的DNA链侵袭。在一些实施方案中，同源定向修复可导致编辑的靶核酸分子中包括模板序列。在其他实施方案中，模板可用于由非同源末端连接介导的基因编辑。在一些实施方案中，模板序列与裂解位点附近的核酸序列不具有类似性。在一些实施方案中，并入模板或模板序列的一部分。在一些实施方案中，模板包括侧接反向末端重复(ITR)序列。
在一些实施方案中，模板可包含第一同源臂和第二同源臂(也称作第一核苷酸序列和第二核苷酸序列)，它们分别与位于裂解位点上游和下游的序列互补。当模板含有两个同源臂时，各臂可为相同长度或不同长度，并且同源臂之间的序列可基本上类似于或等同于同源臂之间的靶序列，或者所述序列可完全无关。在一些实施方案中，模板上的第一核苷酸序列与裂解位点上游的序列之间，和模板上的第二核苷酸序列与裂解位点下游的序列之间的互补性程度或同一性百分比可准许模板与靶核酸分子之间的同源重组，诸如高保真同源重组。在一些实施方案中，互补性程度可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为至少98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为至少98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为100％。
在一些实施方案中，模板序列可对应于、包含或由靶细胞的内源序列组成。模板序列可另外或替代地对应于、包含或由靶细胞的外源序列组成。如本文所用，术语“内源序列”是指原生于细胞的序列。术语“外源序列”是指非原生于细胞的序列，或在细胞的基因组中的原生位置处于不同位置的序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源序列可为染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的质粒序列。在一些实施方案中，模板序列可与细胞中裂解位点处或附近的内源序列的一部分基本上相同，但包含至少一个核苷酸变化。在一些实施方案中，用模板编辑裂解靶核酸分子可导致包含靶核酸分子的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代的突变。在一些实施方案中，突变可导致由包含靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸变化。在一些实施方案中，突变可导致由靶基因表达的RNA中的一个或多个核苷酸变化。在一些实施方案中，突变可改变靶基因的表达水平。在一些实施方案中，突变可导致靶基因的表达增加或减少。在一些实施方案中，突变可导致基因敲低。在一些实施方案中，突变可导致基因敲除。在一些实施方案中，突变可导致恢复基因功能。在一些实施方案中，用模板编辑裂解靶核酸分子可导致靶核酸分子(诸如DNA)的外显子序列、内含子序列、调控序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或非编码序列的变化。
在其他实施方案中，模板序列可包含外源序列。在一些实施方案中，外源序列可包含可操作地连接至外源启动子序列的蛋白质或RNA编码序列，使得当外源序列整合至靶核酸分子中时，细胞能够表达由所述整合序列编码的蛋白质或RNA。在其他实施方案中，当将外源序列整合至靶核酸分子中时，可通过内源性启动子序列调控整合序列的表达。在一些实施方案中，外源序列可提供编码蛋白质或蛋白质的一部分的cDNA序列。在其他实施方案中，外源序列可包含或由外显子序列、内含子序列、调控序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或非编码序列组成。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致恢复基因功能。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致基因敲入。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致基因敲除。
模板可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，模板的长度可包含10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000或更多个核苷酸。模板可为单链核酸。模板可为双链或部分双链核酸。在某些实施方案中，单链模板的长度为20、30、40、50、75、100、125、150、175或200个核苷酸。在一些实施方案中，模板可包含与包含靶序列的靶核酸分子的一部分互补的核苷酸序列(即，“同源臂”)。在一些实施方案中，模板可包含与位于靶核酸分子上的裂解位点上游或下游的序列互补的同源臂。
在一些实施方案中，模板含有具有侧接反向末端重复(ITR)序列的ssDNA或dsDNA。在一些实施方案中，模板以载体、质粒、微环、纳米环或PCR产物的形式提供。
核酸的纯化
在一些实施方案中，对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀、酒精沉淀或等效方法，例如如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等效方法(例如如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者对核酸进行纯化。
靶序列
在一些实施方案中，本公开的CRISPR/Cas系统可定向并裂解靶核酸分子上的靶序列。举例而言，靶序列可由Cas核酸酶识别和裂解。在某些实施方案中，Cas核酸酶的靶序列位于核酸酶的同源PAM序列附近。在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可通过gRNA引导至靶核酸分子的靶序列，其中gRNA与靶序列杂交并且2类Cas蛋白质裂解靶序列。在一些实施方案中，指导RNA与靶序列杂交并且2类Cas核酸酶裂解靶序列，所述靶序列邻近于或包含其同源PAM。在一些实施方案中，靶序列可与指导RNA的靶向序列互补。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与杂交至指导RNA的对应靶序列部分之间的互补性程度可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与杂交至指导RNA的对应靶序列部分之间的同一性百分比可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，标靶的同源区邻近于同源PAM序列。在一些实施方案中，靶序列可包含与指导RNA的靶向序列100％互补的序列。在其他实施方案中，相比于指导RNA的靶向序列，靶序列可包含至少一个错配、缺失或插入。
靶序列长度可取决于所使用的核酸酶系统。举例而言，CRISPR/Cas系统的指导RNA的靶向序列的长度可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或超过50个核苷酸并且靶序列为对应长度，任选地邻近于PAM序列。在一些实施方案中，靶序列的长度可包含15-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列的长度可包含17-21个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列的长度可包含20个核苷酸。当使用切口酶时，靶序列可包含由裂解DNA分子的相对链的一对切口酶识别的一对靶序列。在一些实施方案中，靶序列可包含由裂解DNA分子的相同链的一对切口酶识别的一对靶序列。在一些实施方案中，靶序列可包含由一种或多种Cas核酸酶识别的靶序列的一部分。
靶核酸分子可为任何相对于细胞为内源或外源的DNA或RNA分子。在一些实施方案中，靶核酸分子可为来自细胞或在细胞中的游离型DNA、质粒、基因组DNA、病毒基因组、线粒体DNA或染色体DNA。在一些实施方案中，靶核酸分子的靶序列可为来自细胞(包括人类细胞)或在细胞中的基因组序列。
在其他实施方案中，靶序列可为病毒序列。在其他实施方案中，靶序列可为病原体序列。在其他实施方案中，靶序列可为合成序列。在其他实施方案中，靶序列可为染色体序列。在某些实施方案中，靶序列可包含易位接合点，例如与癌症相关联的易位。在一些实施方案中，靶序列可在真核染色体，诸如人类染色体上。在某些实施方案中，靶序列为肝特异性序列，因为其在肝脏细胞中表达。
在一些实施方案中，靶序列可位于基因的编码序列、基因的内含子序列、调控序列、基因的转录控制序列、基因的翻译控制序列、剪接位点或基因之间的非编码序列中。在一些实施方案中，基因可为蛋白质编码基因。在其他实施方案中，基因可为非编码RNA基因。在一些实施方案中，靶序列可包含疾病相关基因的全部或一部分。在一些实施方案中，靶序列可位于基因组中的非基因功能位点，例如控制染色质组织方面的位点，诸如支架位点或基因座控制区中。
在涉及Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶的实施方案中，靶序列可邻近于原间隔区邻近基序(“PAM”)。在一些实施方案中，PAM可邻近于或在靶序列的3'端的1、2、3或4个核苷酸内。PAM的长度和序列可取决于所使用的Cas蛋白质。举例而言，PAM可选自特定Cas9蛋白质或Cas9直系同源物的共同序列或特定PAM序列，包括Ran等人,Nature,520:186-191(2015)的图1，和Zetsche 2015的图S5中公开的那些，所述文献的相关公开内容各自以引用方式并入本文。在一些实施方案中，PAM的长度可为2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。非限制性的示例性PAM序列包括NGG、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA、TTN和NNNNGATT(其中N定义为任何核苷酸，并且W定义为A或T)。在一些实施方案中，PAM序列可为NGG。在一些实施方案中，PAM序列可为NGGNG。在一些实施方案中，PAM序列可为TTN。在一些实施方案中，PAM序列可为NNAAAAW。
脂质制剂
本文公开RNA(包括CRISPR/Cas货物)的LNP制剂的各种实施方案。此类LNP制剂包括“胺脂质”，连同辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，此类LNP制剂包括“胺脂质”，连同辅助脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，LNP制剂包括小于1％中性磷脂。在一些实施方案中，LNP制剂包括小于0.5％中性磷脂。“脂质纳米粒子”意指包含通过分子间力彼此物理缔合的多个(即，超过一个)脂质分子的粒子。
胺脂质
用于递送生物活性剂的LNP组合物包含“胺脂质”，所述胺脂质定义为脂质A或其等效物，包括脂质A的缩醛类似物。
在一些实施方案中，胺脂质为脂质A，所述脂质A为十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称作(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可描绘为：
可根据WO2015/095340(例如第84-86页)合成脂质A。在某些实施方案中，胺脂质为脂质A的等效物。
在某些实施方案中，胺脂质为脂质A的类似物。在某些实施方案中，脂质A类似物为脂质A的缩醛类似物。在特定LNP组合物中，缩醛类似物为C4-C12缩醛类似物。在一些实施方案中，缩醛类似物为C5-C12缩醛类似物。在另外的实施方案中，缩醛类似物为C5-C10缩醛类似物。在另外的实施方案中，缩醛类似物选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11和C12缩醛类似物。
适用于本文所述的LNP的胺脂质为体内可生物降解的并且适合于将生物活性剂，诸如RNA递送至细胞。胺脂质具有低毒性(例如在动物模型中容许而无大于或等于10mg/kg的量的RNA货物下的不良影响)。在某些实施方案中，包含胺脂质的LNP包括这样的LNP：其中在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除至少75％的胺脂质。在某些实施方案中，包含胺脂质的LNP包括这样的LNP：其中在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除至少50％的mRNA或gRNA。在某些实施方案中，包含胺脂质的LNP包括这样的LNP：其中例如通过测量脂质(例如胺脂质)、RNA(例如mRNA)或另一种组分，在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除至少50％的LNP。在某些实施方案中，测量LNP的脂质囊封的相对于游离的脂质、RNA或核酸组分。
脂质清除率可如文献中所述来测量。参见Maier,M.A.等人Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics.Mol.Ther.2013,21(8),
1570-78(“Maier”)。举例而言，在Maier中，以0.3mg/kg通过静脉内快速注射经由侧尾静脉向六至八周龄雄性C57Bl/6小鼠施用含有靶向荧光素酶的siRNA的LNP-siRNA系统。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时收集血液、肝脏和脾脏样品。在收集组织之前向小鼠灌注生理盐水并且处理血液样品以获得血浆。处理并且通过LC-MS分析所有样品。此外，Maier描述了一种用于评定施用LNP-siRNA制剂之后的毒性的程序。举例而言，以0、1、3、5和10mg/kg(5只动物/组)经由单一静脉内快速注射以5mL/kg的剂量体积向雄性斯普拉格-杜勒大鼠(Sprague-Dawley rat)施用靶向荧光素酶的siRNA。24小时之后，自清醒的动物的颈静脉获得约1mL血液并且分离血清。在给药后72小时，将所有动物安乐死以用于尸体剖检。进行临床征象、体重、血清化学、器官重量和组织病理学的评定。尽管Maier描述了用于评定siRNA-LNP制剂的方法，但这些方法也可适用于评定本公开的LNP组合物的施用的清除率、药代动力学和毒性。
胺脂质可导致增加的清除率。在一些实施方案中，清除率为脂质清除率，例如从血液、血清或血浆清除脂质的速率。在一些实施方案中，清除率为RNA清除率，例如从血液、血清或血浆清除mRNA或gRNA的速率。在一些实施方案中，清除率为从血液、血清或血浆清除LNP的速率。在一些实施方案中，清除率为从组织，诸如肝脏组织或脾脏组织清除LNP的速率。在某些实施方案中，高清除率产生不具有显著不良影响的安全概况。胺脂质可减少循环中和组织中的LNP积聚。在一些实施方案中，循环中和组织中的LNP积聚减少产生不具有显著不良影响的安全概况。
取决于本公开的胺脂质所处的介质的pH，本公开的胺脂质为可电离的(例如，可形成盐)。举例而言，在弱酸性介质中，胺脂质可经质子化并且因此带有正电荷。相反地，在弱碱性介质，诸如pH为大约7.35的血液中，胺脂质可不经质子化并且因此不带电荷。在一些实施方案中，可在至少约9的pH下对本公开的胺脂质进行质子化。在一些实施方案中，可在至少约9的pH下对本公开的胺脂质进行质子化。在一些实施方案中，可在至少约10的pH下对本公开的胺脂质进行质子化。
对胺脂质进行主要质子化的pH与胺脂质的内在pKa相关。在一些实施方案中，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.1至约7.4范围内的pKa。在一些实施方案中，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.5至约6.6范围内的pKa。在一些实施方案中，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.6至约6.4范围内的pKa。在一些实施方案中，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.8至约6.2范围内的pKa。举例而言，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.8至约6.5范围内的pKa。胺脂质的pKa可为配制LNP的重要考虑因素，因为已发现具有在约5.1至约7.4范围内的pKa的阳离子型脂质对体内递送货物(例如递送至肝脏)有效。此外，已发现，具有在约5.3至约6.4范围内的pKa的阳离子型脂质对体内递送(例如递送至肿瘤)有效。参见例如WO 2014/136086。
另外的脂质
适用于本公开的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性脂质、不带电脂质或两性离子型脂质。适用于本公开的中性磷脂的实例包括但不限于5-十七基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。在一个实施方案中，中性磷脂可选自由以下组成的组：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，中性磷脂可为二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。在另一个实施方案中，中性磷脂可为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)。
“辅助脂质”包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适用于本公开的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中，辅助脂质可为胆固醇。在一个实施方案中，辅助脂质可为胆固醇半琥珀酸酯。
PEG脂质为改变纳米粒子可在体内(例如血液中)存在的时长的隐形脂质。PEG脂质可通过例如减少粒子聚集并且控制粒度来辅助配制过程。本文所用的PEG脂质可调节LNP的药代动力学特性。通常，PEG脂质包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分。
在一些实施方案中，脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺(diacylglycamide)、包括包含具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些，其中该链可包含一个或多个官能团，诸如酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团可还包含一个或多个取代的烷基。链长可为对称或不对称的。
除非另外指明，否则如本文所用，术语“PEG”意指任何聚乙二醇或其他聚亚烷醚聚合物。在一个实施方案中，PEG部分为乙二醇或环氧乙烷的任选地取代的直链或支链聚合物。在某些实施方案中，PEG部分为或者，PEG部分可被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。在一个实施方案中，PEG部分包括PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical andbiomedical applications(1992))；或者，PEG部分不包括PEG共聚物，例如其可为PEG单聚物。在一个实施方案中，PEG的分子量为约130至约50,000，在子实施方案中，为约150至约30,000，在子实施方案中，为约150至约20,000，在子实施方案中，为约150至约15,000，在子实施方案中，为约150至约10,000，在子实施方案中，为约150至约6,000，在子实施方案中，为约150至约5,000，在子实施方案中，为约150至约4,000，在子实施方案中，为约150至约3,000，在子实施方案中，为约300至约3,000，在子实施方案中，为约1,000至约3,000，并且在子实施方案中，为约1,500至约2,500。
在某些实施方案中，PEG(例如与脂质部分或脂质，诸如隐形脂质缀合)为“PEG-2K”，也称为“PEG 2000”，其平均分子量为约2,000道尔顿。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n为45，意指数均聚合度包含约45个亚单位然而，可使用本领域中已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数均聚合度包含约23个亚单位(n＝23)和/或68个亚单位(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可在约30至约60的范围内。在一些实施方案中，n可在约35至约55的范围内。在一些实施方案中，n可在约40至约50的范围内。在一些实施方案中，n可在约42至约48的范围内。在一些实施方案中，n可为45。在一些实施方案中，R可选自H、取代的烷基和未取代的烷基。在一些实施方案中，R可为未取代的烷基。在一些实施方案中，R可为甲基。
在本文所述的任一实施方案中，PEG脂质可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，获自NOF,Tokyo,Japan)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(目录号DSPE-020CN，NOF,Tokyo,Japan)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)(目录号880150P，获自Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，获自Avanti PolarLipids,Alabaster,Alabama,USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，NOF Tokyo,Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSG。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSPE。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMA。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C-DMA。在一个实施方案中，PEG脂质可为化合物S027，其公开于WO2016/010840的第[00240]段至第[00244]段中。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSA。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C11。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C14。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C16。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C18。
LNP制剂
本公开的实施方案提供根据制剂中脂质组分的各自摩尔比描述的脂质组合物。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约30mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约40mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约45mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约50mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约55mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约50mol％至约55mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约50mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约55mol％。在一些实施方案中，LNP批料的胺脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，LNP批料的胺脂质mol％将为目标mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。所有mol％数均以LNP组合物的脂质组分的分率给定。在某些实施方案中，胺脂质mol％的LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约5mol％至约15mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约7mol％至约12mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约0mol％至约5mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约0mol％至约10mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约5mol％至约10mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约8mol％至约10mol％。
在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约12mol％、约13mol％、约14mol％或约15mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约9mol％。
在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约1mol％至约5mol％。在一个实施方案中，中性脂质的mol％可为约0.1mol％至约1mol％。在一个实施方案中，中性脂质，诸如中性磷脂的mol％可为约0.1mol％、约0.2mol％、约0.5mol％、1mol％、约1.5mol％、约2mol％、约2.5mol％、约3mol％、约3.5mol％、约4mol％、约4.5mol％或约5mol％。
在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可小于约1mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可小于约0.5mol％。在一个实施方案中，中性脂质，例如中性磷脂的mol％可为约0mol％、约0.1mol％、约0.2mol％、约0.3mol％、约0.4mol％、约0.5mol％、约0.6mol％、约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％或约1mol％。在一些实施方案中，本文所公开的制剂不含中性脂质(即，0mol％中性脂质)。在一些实施方案中，本文所公开的制剂基本上不含中性脂质(即，约0mol％中性脂质)。在一些实施方案中，本文所公开的制剂不含中性磷脂(即，0mol％中性磷脂)。在一些实施方案中，本文所公开的制剂基本上不含中性磷脂(即，约0mol％中性磷脂)。
在一些实施方案中，LNP批料的中性脂质mol％将为目标中性脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约20mol％至约60mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约55mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约50mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约40mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约30mol％至约50mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约30mol％至约40mol％。在一个实施方案中，基于胺脂质、中性脂质和PEG脂质浓度而调整辅助脂质的mol％以使脂质组分达到100mol％。在一个实施方案中，基于胺脂质和PEG脂质浓度而调整辅助脂质的mol％以使脂质组分达到100mol％。在一个实施方案中，基于胺脂质和PEG脂质浓度而调整辅助脂质的mol％以使脂质组分达到至少99mol％。在一些实施方案中，LNP批料的辅助脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。
在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约1mol％至约10mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约10mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约8mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约4mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2.5mol％至约4mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约3mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2.5mol％。在一些实施方案中，LNP批料的PEG脂质mol％将为目标PEG脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。
在某些实施方案中，货物包括编码RNA指导的DNA结合剂(例如Cas核酸酶、2类Cas核酸酶或Cas9)的mRNA，和gRNA或编码gRNA的核酸，或mRNA和gRNA的组合。在一个实施方案中，LNP组合物可包含脂质A或其等效物。在一些方面，胺脂质为脂质A。在一些方面，胺脂质为脂质A等效物，例如脂质A的类似物。在某些方面，胺脂质为脂质A的缩醛类似物。在各种实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、中性脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些实施方案中，辅助脂质为胆固醇。在某些实施方案中，中性脂质为DSPC。在特定实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质A、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、DSPC、胆固醇和PEG脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含PEG脂质，所述脂质包含DMG。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A，和脂质A的等效物，包括脂质A的缩醛类似物。在另外的实施方案中，LNP组合物包含脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。
在各种实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在各种实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、辅助脂质、中性磷脂和PEG脂质。在各种实施方案中，LNP组合物包含脂质组分，所述脂质组分由胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质组成。在各种实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些实施方案中，LNP组合物不包含中性脂质，诸如中性磷脂。在各种实施方案中，LNP组合物包含脂质组分，所述脂质组分由胺脂质、辅助脂质和PEG脂质组成。在某些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DAPC、DMPC、DOPC、DOPE和DSPE中的一者或多者。在某些实施方案中，中性脂质为DSPC。在某些实施方案中，中性脂质为DPPC。在某些实施方案中，中性脂质为DAPC。在某些实施方案中，中性脂质为DMPC。在某些实施方案中，中性脂质为DOPC。在某些实施方案中，中性脂质为DOPE。在某些实施方案中，中性脂质为DSPE。在某些实施方案中，辅助脂质为胆固醇。在特定实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质A、辅助脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分由脂质A、辅助脂质和PEG脂质组成。在一些实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、胆固醇和PEG脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含脂质组分，所述脂质组分由胺脂质、胆固醇和PEG脂质组成。在一些实施方案中，LNP组合物包含PEG脂质，所述脂质包含DMG。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A，和脂质A的等效物，包括脂质A的缩醛类似物。在某些实施方案中，胺脂质为脂质A的C5-C12或C4-C12缩醛类似物。在另外的实施方案中，LNP组合物包含脂质A、胆固醇和PEG2k-DMG。
本发明的实施方案还提供根据胺脂质的带正电胺基团(N)与待囊封的核酸的带负电磷酸酯基团(P)之间的摩尔比描述的脂质组合物。此可由方程式N/P数学表示。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质；和核酸组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含胺脂质、辅助脂质和PEG脂质；和核酸组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和辅助脂质；和RNA组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含胺脂质、辅助脂质和PEG脂质；和RNA组分，其中N/P比为约3至10。在一个实施方案中，N/P比可为约5至7。在一个实施方案中，N/P比可为约3至7。在一个实施方案中，N/P比可为约4.5至8。在一个实施方案中，N/P比可为约6。在一个实施方案中，N/P比可为6±1。在一个实施方案中，N/P比可为6±0.5。在一些实施方案中，N/P比将为目标N/P比的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。
在一些实施方案中，核酸组分，例如RNA组分可包含mRNA，诸如编码Cas核酸酶的mRNA。RNA组分包括RNA，任选地伴以额外核酸和/或蛋白质，例如RNP货物。在一个实施方案中，RNA包含Cas9 mRNA。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，LNP还包含gRNA核酸，诸如gRNA。在一些实施方案中，RNA组分包含Cas核酸酶mRNA和gRNA。在一些实施方案中，RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
在某些实施方案中，LNP组合物可包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些实施方案中，LNP组合物可包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA、胺脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其他包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其他包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的特定组合物中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在一些实施方案中，LNP组合物可包含gRNA。在某些实施方案中，LNP组合物可包含胺脂质、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些实施方案中，LNP组合物可包含胺脂质、gRNA、辅助脂质和PEG脂质。在某些包含gRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其他包含gRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在一个实施方案中，LNP组合物可包含sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可包含Cas9 sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可包含Cpf1 sgRNA。在一些包含sgRNA的组合物中，LNP包括胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一些包含sgRNA的组合物中，LNP包括胺脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些包含sgRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其他包含sgRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其他包含sgRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在某些实施方案中，LNP组合物包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA，所述gRNA可为sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可包含胺脂质、编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一个实施方案中，LNP组合物可包含由胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质组成的脂质组分；和由编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA组成的核酸组分。在一个实施方案中，LNP组合物可包含由胺脂质、辅助脂质和PEG脂质组成的脂质组分；和由编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA组成的核酸组分。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物包含小于约1mol％的中性脂质，例如中性磷脂。某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物包含小于约0.5mol％的中性脂质，例如中性磷脂。在某些组合物中，LNP不包含中性脂质，例如中性磷脂。在其他包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。
在某些实施方案中，LNP组合物包含Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas mRNA和至少一种gRNA。在某些实施方案中，LNP组合物包含比率为约25:1至约1:25的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，LNP制剂包含比率为约10:1至约1:10的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，LNP制剂包含比率为约8:1至约1:8的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。如本文中所测量，比率是按重量计的。在一些实施方案中，LNP制剂包含比率为约5:1至约1:5的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas mRNA。在一些实施方案中，比率范围为约3:1至1:3、约2:1至1:2、约5:1至1:2、约5:1至1:1、约3:1至1:2、约3:1至1:1、约3:1、约2:1至1:1。在一些实施方案中，gRNA与mRNA的比率为约3:1或约2:1在一些实施方案中，gRNA与Cas核酸酶mRNA(诸如2类Cas核酸酶)的比率为约1:1。比率可为约25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:25。
本文所公开的LNP组合物可包括模板核酸。模板核酸可与编码Cas核酸酶的mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA共配制。在一些实施方案中，模板核酸可与指导RNA共配制。在一些实施方案中，模板核酸可与编码Cas核酸酶的mRNA和指导RNA两者共配制。在一些实施方案中，模板核酸可与编码Cas核酸酶的mRNA或指导RNA分开配制。模板核酸可与LNP组合物一起或与其分开递送。在一些实施方案中，模板核酸可为单链或双链的，这取决于所需的修复机制。模板可具有与靶DNA或与邻近于靶DNA的序列同源的区域。
在一些实施方案中，LNP是通过混合RNA水溶液与基于有机溶剂的脂质溶液，例如100％乙醇而形成。合适的溶液或溶剂包括或可含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。可将药学上可接受的缓冲剂用于例如LNP的体内施用。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施方案中，组合物的pH在约7.2至约7.7的范围内。在另外的实施方案中，组合物的pH在约7.3至约7.7的范围内或约7.4至约7.6的范围内。在其他实施方案中，组合物的pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。组合物的pH可用微型pH探针测量。在某些实施方案中，组合物中包括低温保护剂。低温保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可包括至多10％低温保护剂，诸如蔗糖。在某些实施方案中，LNP组合物可包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％低温保护剂。在某些实施方案中，LNP组合物可包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％蔗糖。在一些实施方案中，LNP组合物可包含缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液可包含磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或它们的混合物。在某些示例性实施方案中，缓冲液包含NaCl。在某些实施方案中，省去NaCl。NaCl的示例性量可在约20mM至约45mM的范围内。NaCl的示例性量可在约40mM至约50mM的范围内。在一些实施方案中，NaCl的量为约45mM。在一些实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。Tris的示例性量可在约20mM至约60mM的范围内。Tris的示例性量可在约40mM至约60mM的范围内。在一些实施方案中，Tris的量为约50mM。在一些实施方案中，缓冲液包含NaCl和Tris。LNP组合物的某些示例性实施方案含有5％蔗糖和含45mM NaCl的Tris缓冲液。在其他示例性实施方案中，组合物含有呈约5％w/v的量的蔗糖、约45mM NaCl和约50mM Tris(pH 7.5)。盐、缓冲液和低温保护剂量可有所变化以使总制剂的重量克分子渗透浓度得以维持。举例而言，最终重量克分子渗透浓度可维持在小于450mOsm/L。在其他实施方案中，重量克分子渗透浓度在350与250mOsm/L之间。某些实施方案的最终重量克分子渗透浓度为300+/-20mOsm/L。
在一些实施方案中，使用微流体混合、T型混合或交叉混合。在某些方面，流动速率、接头大小、接头几何结构、接头形状、管径、溶液和/或RNA和脂质浓度可有所变化。LNP或LNP组合物可例如经由渗析、切向流过滤或色谱法加以浓缩或纯化。LNP可以例如悬浮液、乳液或冻干粉末形式储存。在一些实施方案中，LNP组合物储存在2℃-8℃下，在某些方面，LNP组合物储存在室温下。在另外的实施方案中，冷冻储存，例如在-20℃或-80℃下储存LNP组合物。在其他实施方案中，将LNP组合物储存在约0℃至约-80℃范围内的温度下。冷冻LNP组合物可在使用之前，例如在冰上、在室温下或在25℃下解冻。
LNP可例如为微球(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”—在一些实施方案中为大体上球形的层状相脂质双层—并且在更特定实施方案中可包含水性核心，例如包含大部分RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
此外，LNP组合物是可生物降解的，因为它们不在治疗有效剂量下体内积聚至细胞毒性水平。在一些实施方案中，LNP组合物不在治疗剂量水平下引起导致重大不良影响的先天性免疫反应。在一些实施方案中，本文所提供的LNP组合物不在治疗剂量水平下引起毒性。
在一些实施方案中，pdi可在约0.005至约0.75的范围内。在一些实施方案中，pdi可在约0.01至约0.5的范围内。在一些实施方案中，pdi可在约零至约0.4的范围内。在一些实施方案中，pdi可在约零至约0.35的范围内。在一些实施方案中，pdi可在约零至约0.35的范围内。在一些实施方案中，pdi可在约零至约0.3的范围内。在一些实施方案中，pdi可在约零至约0.25的范围内。在一些实施方案中，pdi可在约零至约0.2的范围内。在一些实施方案中，pdi可小于约0.08、0.1、0.15、0.2或0.4。
本文所公开的LNP的尺寸(例如Z-平均直径)为约1至约250nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约10至约200nm。在其他实施方案中，LNP的尺寸为约20至约150nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约50至约150nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约50至约100nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约50至约120nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约60至约100nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约75至约150nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约75至约120nm。在一些实施方案中，LNP的尺寸为约75至约100nm。除非另外指明，否则本文所提及的所有尺寸为完全成形纳米粒子的平均尺寸(直径)，如通过Malvern Zetasizer上的动态光散射所测量。纳米粒子样品稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以使得计数率为大约200-400kcps。数据呈现为强度量度的加权平均值(Z-平均直径)。
在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约50％至约100％范围内的平均包封效率。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约50％至约70％范围内的平均包封效率。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约70％至约90％范围内的平均包封效率。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约90％至约100％范围内的平均包封效率。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约75％至约95％范围内的平均包封效率。
在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约1.00E+05g/mol至约1.00E+10g/mol范围内的平均分子量。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约5.00E+05g/mol至约7.00E+07g/mol范围内的平均分子量。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约1.00E+06g/mol至约1.00E+10g/mol范围内的平均分子量。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约1.00E+07g/mol至约1.00E+09g/mol范围内的平均分子量。在一些实施方案中，LNP被形成为具有在约5.00E+06g/mol至约5.00E+09g/mol范围内的平均分子量。
在一些实施方案中，多分散性(Mw/Mn；重均摩尔质量(Mw)与数均摩尔质量(Mn)之比)可在约1.000至约2.000的范围内。在一些实施方案中，Mw/Mn可在约1.00至约1.500的范围内。在一些实施方案中，Mw/Mn可在约1.020至约1.400的范围内。在一些实施方案中，Mw/Mn可在约1.010至约1.100的范围内。在一些实施方案中，Mw/Mn可在约1.100至约1.350的范围内。
对细胞进行工程化的方法；工程化的细胞
本文所公开的LNP组合物可用于在体内和体外通过基因编辑对细胞进行工程化的方法中。在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与本文所述的LNP组合物接触。
在一些实施方案中，所述方法涉及接触受试者，诸如哺乳动物，诸如人类的细胞。在一些实施方案中，细胞处于器官，诸如肝脏，诸如哺乳动物肝脏，诸如人类肝脏中。在一些实施方案中，细胞为肝脏细胞，诸如哺乳动物肝脏细胞，诸如人类肝脏细胞。在一些实施方案中，细胞为肝细胞，诸如哺乳动物肝细胞，诸如人类肝细胞。在一些实施方案中，肝脏细胞为干细胞。在一些实施方案中，人类肝脏细胞可为肝窦内皮细胞(LSEC)。在一些实施方案中，人类肝脏细胞可为库普弗细胞(Kupffer cell)。在一些实施方案中，人类肝脏细胞可为肝星状细胞。在一些实施方案中，人类肝脏细胞可为肿瘤细胞。在一些实施方案中，人类肝脏细胞可为肝脏干细胞。在另外的实施方案中，细胞包含ApoE结合受体。在一些实施方案中，肝脏细胞，诸如肝细胞处于原位。在一些实施方案中，肝脏细胞，诸如肝细胞分离于例如培养物中，诸如原代培养物中。还提供对应于本文所公开的用途的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的LNP组合物或使细胞(诸如上文所述的那些细胞)与本文所公开的LNP组合物接触。
在一些实施方案中，提供工程化细胞，例如来源于前述段落的细胞类型中的任一者的工程化细胞。此类工程化细胞根据本文所述的方法来制备。在一些实施方案中，工程化细胞驻存于组织或器官，例如受试者的肝脏内。
在本文所述的一些方法和细胞中，细胞包含修饰，例如靶序列中的核苷酸的插入或缺失(“insertion ordeletion(indel)”)或取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4或5个或更多个核苷酸的插入。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的插入。在其他实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包含导致靶序列中的移码突变的插入或缺失。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含由并入模板核酸，例如本文所述的任一模板核酸产生的一个或多个核苷酸插入、缺失或取代。
在一些实施方案中，提供包含工程化细胞的细胞群体，例如包含根据本文所述的方法进行工程化的细胞的细胞群体。在一些实施方案中，群体包含体外培养的工程化细胞。在一些实施方案中，群体驻存于组织或器官，例如受试者的肝脏内。在一些实施方案中，群体内的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多的细胞经工程化。在某些实施方案中，本文所公开的方法导致至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％编辑效率(或“编辑百分比”)，其由检测插入或缺失定义。在其他实施方案中，本文所公开的方法导致至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％DNA修饰效率，其由检测序列变化(通过插入、缺失、取代或以其他方式)定义。在某些实施方案中，本文所公开的方法导致细胞群体中约5％至约100％、约10％至约50％、约20％至约100％、约20％至约80％、约40％至约100％或约40％至约80％之间的编辑效率水平或DNA修饰效率水平。
在本文所述的一些方法和细胞中，群体内的细胞包含靶序列处的修饰，例如插入或缺失或取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4或5个或更多个核苷酸的插入。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的插入。在其他实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰导致靶序列中的移码突变。在一些实施方案中，修饰包含导致靶序列中的移码突变的插入或缺失。在一些实施方案中，群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更多的工程化细胞包含移码突变。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含由并入模板核酸，例如本文所述的任一模板核酸产生的一个或多个核苷酸插入、缺失或取代。
基因编辑方法
本文所公开的LNP组合物可用于体内和体外基因编辑。在一个实施方案中，可向有需要的受试者施用一种或多种本文所述的LNP组合物。在一个实施方案中，一种或多种本文所述的LNP组合物可与细胞接触。在一个实施方案中，治疗有效量的本文所述的组合物可与有需要的受试者的细胞接触。在一个实施方案中，可通过使细胞与本文所述的LNP组合物接触来产生基因工程化细胞。在各种实施方案中，所述方法包括将模板核酸引入至细胞或受试者，如上文所阐述。
在一些实施方案中，所述方法涉及将LNP组合物施用至与肝脏病症相关联的细胞。在一些实施方案中，所述方法涉及治疗肝脏病症。在某些实施方案中，所述方法涉及使肝脏细胞与LNP组合物接触。在某些实施方案中，所述方法涉及使肝细胞与LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法涉及使ApoE结合细胞与LNP组合物接触。
在一个实施方案中，可将包含编码2类Cas核酸酶的mRNA和gRNA的LNP组合物施用至细胞，诸如ApoE结合细胞。在另外的实施方案中，将模板核酸也引入至细胞。在某些情况下，可将包含2类Cas核酸酶和sgRNA的LNP组合物施用至细胞，诸如ApoE结合细胞。在一个实施方案中，可将包含编码2类Cas核酸酶的mRNA、gRNA和模板的LNP组合物施用至细胞。在某些情况下，可将包含Cas核酸酶和sgRNA的LNP组合物施用至肝脏细胞。在一些情况下，肝脏细胞在受试者中。
在某些实施方案中，受试者可接受单次剂量的LNP组合物。在其他实例中，受试者可接受多次剂量的LNP组合物。在一些实施方案中，施用LNP组合物2-5次。在施用超过一个剂量时，可相隔约1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天；相隔约2、3、4、5或6个月；或相隔约1、2、3、4或5年施用所述剂量。在某些实施方案中，编辑在再施用LNP组合物后得到改善。
在一个实施方案中，可与包含gRNA的组合物的施用分开，将包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的LNP组合物施用至细胞。在一个实施方案中，可与将模板核酸施用至细胞分开，将包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA和gRNA的LNP组合物施用至细胞。在一个实施方案中，可将包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的LNP组合物施用至细胞，接着将包含gRNA的LNP组合物和模板依序施用至细胞。在包含编码Cas核酸酶的mRNA的LNP组合物在包含gRNA的LNP组合物之前施用的实施方案中，施用可相隔约4、6、8、12或24小时；或2、3、4、5、6或7天。
在一个实施方案中，LNP组合物可用于编辑基因，导致基因敲除。在一实施方案中，LNP组合物可用于编辑基因，导致细胞群体中的基因敲落。在另一个实施方案中，LNP组合物可用于编辑基因，导致基因校正。在另一个实施方案中，LNP组合物可用于编辑细胞，导致基因插入。
在一个实施方案中，施用LNP组合物可导致基因编辑，其导致持续反应。举例而言，施用可导致一天、一个月、一年或更长的反应持续时间。如本文所用，“反应持续时间”意指在已使用本文所公开的LNP组合物编辑细胞之后，所得修饰在施用LNP组合物之后仍存在一定时间段。修饰可通过测量靶蛋白水平来检测。修饰可通过检测靶DNA来检测。在一些实施方案中，反应持续时间可为至少1周。在其他实施方案中，反应持续时间可为至少2周。在一个实施方案中，反应持续时间可为至少1个月。在一些实施方案中，反应持续时间可为至少2个月。在一个实施方案中，反应持续时间可为至少4个月。在一个实施方案中，反应持续时间可为至少6个月。在某些实施方案中，反应持续时间可为约26周。在一些实施方案中，反应持续时间可为至少1年。在一些实施方案中，反应持续时间可为至少5年。在一些实施方案中，反应持续时间可为至少10年。在一些实施方案中，通过测量靶蛋白水平或通过检测靶DNA，持续反应在至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、21或24个月之后可检测。在一些实施方案中，通过测量靶蛋白水平或通过检测靶DNA，持续反应在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20年之后可检测。
可肠胃外施用LNP组合物。可将LNP组合物直接施用至血流、组织、肌肉或内部器官中。施用可为全身性的，例如针对注射或输注。施用可为局部的。合适的施用方法包括静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、视网膜下、玻璃体内、前房内、肌肉内、滑膜内、皮内和皮下。适用于施用的装置包括针(包括微针)注射器、无针注射器、渗透泵和输注技术。
LNP组合物将一般(但未必)以与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合的制剂形式施用。术语“赋形剂”包括除本公开的化合物、其他脂质组分和生物活性剂以外的任何成分。赋形剂可赋予制剂功能(例如药物释放速率控制)和/或非功能(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂的选择在很大程度上将取决于诸如特定施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响和剂型性质的因素。
肠胃外制剂通常为水性或油性溶液或悬浮液。当制剂为水性时，可使用诸如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选为3至9的pH)的赋形剂，但对于一些应用，制剂可更适当地配制为无菌非水性溶液或配置为待与合适的媒介物诸如无菌无热原质的水(WFI)结合使用的干燥形式。
虽然结合所说明的实施方案来描述本发明，但应理解不意欲将本发明限于那些实施方案。相反，本发明意欲涵盖所有替代方案、修改和等效物，包括特定特征的等效物，它们可包括在如由所附权利要求所定义的本发明内。
前述一般描述和详细描述，以及下述实施例均仅为示例性和解释性的并且不限制教导内容。本文所用的章节标题仅出于组织目的，而不应理解为以任何方式限制所需主题。在以引用方式并入的任何文献与本说明书中定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。除非另外陈述，否则本申请中给出的所有范围均涵盖端点。
应注意，除非上下文另外明确指示，否则如本申请中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该”包括复数指示物。因此，举例而言，提及的“组合物(a composition)”包括多个组合物并且提及的“细胞(a cell)”包括多个细胞等等。除非另外陈述，否则使用的“或”为包括性的并且意指“和/或”。
数值范围包括限定所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，所测量和可测量值应理解为大致的。术语“约”或“大致”意指如由本领域普通技术人员所测定的特定值的可接受误差，其部分取决于如何测量或测定该值。在范围之前或在值的清单之前使用诸如“约”的修饰语修饰范围的各端点或清单中的各值。“约”也包括值或端点。举例而言，“约50-55”涵盖“约50至约55”。另外，使用“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”不具限制性。
除非在上述说明书中明确指出，否则本说明书中陈述“包含”各种组分的实施方案还考虑为“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“由”各种组分“组成”还考虑为“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“约”各种组分的实施方案还考虑为“处于”所述组分；并且本说明书中陈述“基本上由”各种组分“组成”还考虑为“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(此互换性不适用于在权利要求中使用这些术语)。
实施例
实施例1-用于在小鼠中进行体内编辑的LNP组合物
制备各种LNP组合物的小规模制剂以调查其特性。在关于小鼠的肝脏编辑％的测定中，靶向小鼠TTR序列的Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA以如下表2中所述的改变PEGmol％、脂质A mol％和N:P比在LNP中配制。
表2.LNP组合物.
LNP#
脂质A mol％
PEG-DMG mol％
N:P比
(各种)
45
2、2.5、3、4、5
4.5
(各种)
45
2、2.5、3、4、5
6
(各种)
50
2、2.5、3、4、5
4.5
(各种)
50
2、2.5、3、4、5
6
(各种)
55
2、2.5、3、4、5
4.5
(各种)
55
2、2.5、3、4、5
6
在图1中，LNP制剂基于其脂质A mol％和N:P比鉴别于X轴上，标注为“％CL；N:P”。如图1的图例中所指示，用以下各项配制2mol％、2.5mol％、3mol％、4mol％或5mol％的PEG-2k-DMG浓度：(1)45mol％脂质A；4.5N:P(“45；4.5”)；(2)45mol％脂质A；6N:P(“45；6”)；(3)50mol％脂质A；4.5N:P(“50；4.5”)；(4)50mol％脂质A；6N:P(“50；6”)；(5)55mol％脂质A；4.5N:P(“55；4.5”)；和(6)55mol％脂质A；6N:P(“55；6”)。将DSPC mol％保持恒定于9mol％并且添加胆固醇mol％以使各制剂脂质组分的其余部分达到100mol％。如下所述配制30种制剂中的每一者，并且以1mg/kg或0.5mg/kg剂量的总RNA的单次剂量形式施用(分别为图1A和图1B)。
LNP制剂-NanoAssemblr
将脂质纳米粒子组分以上述脂质组分摩尔比溶解于100％乙醇中。将RNA货物溶解于25mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH 5.0中，产生大约0.45mg/mL的RNA货物浓度。以约4.5或约6的脂质胺与RNA磷酸酯(N:P)摩尔比和按重量计1:1的mRNA与gRNA比率配制LNP。
根据根据制造商的方案，使用Precision Nanosystems NanoAsse mblrTM台式仪器将脂质和RNA溶液微流体混合来形成LNP。使用差分流动速率在混合期间维持水相与有机溶剂的2:1比率。混合之后，收集LNP，在水中稀释(大约1:1v/v)，在室温下保持1小时，并且进一步用水稀释(大约1:1v/v)，之后进行最终缓冲液更换。用PD-10除盐柱(GE)来完成将最终缓冲液更换为50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)。如果需要，用Amicon100kDa离心过滤器(Millipore)通过离心浓缩制剂。所得混合物接着使用0.2μm无菌过滤器过滤。将最终LNP储存在-80℃下直至进一步使用。
制剂分析
使用动态光散射(“DLS”)表征本公开的LNP的多分散性指数(“pdi”)和尺寸。DLS测量由将样品置于光源下而产生的光的散射。如根据DLS测量所测定，PDI表示群体中粒度的分布(平均粒度周围)，其中完全均一群体的PDI为零。
使用电泳光散射表征指定pH下的LNP的表面电荷。表面电荷，或ζ电位是LNP悬浮液中的粒子之间的静电斥力/引力的量值的量度。
非对称流场流分离-多角度光散射(AF4-MALS)用于根据流体动力学半径分离制剂中的粒子并且接着测量分离粒子的分子量、流体动力学半径和均方根半径。此允许评定分子量和尺寸分布以及二级特征，诸如Burchard-Stockmeyer曲线图(表明粒子的内部核心密度的随时间推移的均方根(“rms”)半径与流体动力学半径的比)和rms构造图(rms半径的对数相对于分子量的对数，其中所得线性拟合的斜率给出相对于伸长率的紧密度)的能力。
纳米粒子追踪分析(NTA，Malvern Nanosight)可用于测定制剂粒度分布以及粒子浓度。将LNP样品以适当方式稀释并且注射至显微镜载片上。相机在粒子缓慢输注通过视场时记录散射光。在捕获影片之后，纳米粒子追踪分析通过追踪像素并计算扩散系数来处理影片。此扩散系数可转译成粒子的流体动力学半径。仪器还对分析中计数的个别粒子的数目计数以得到粒子浓度。
低温电子显微镜法(“cryo-EM”)可用于测定LNP的粒度、形态和结构特征。
可根据液体色谱法继之以电气溶胶检测法(LC-CAD)测定LNP的脂质组成分析。此分析可提供实际脂质含量相对于理论脂质含量的比较。
分析LNP制剂的平均粒度、多分散性指数(pdi)、总RNA含量、RNA包封效率和ζ电位。可进一步通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或cryo-EM表征LNP制剂。通过动态光散射(DLS)使用Malvern Zetasizer仪器测量平均粒度和多分散性。在通过DLS进行测量之前，将LNP样品在PBS中稀释30X。连同数均直径和pdi一起报告Z-平均直径，所述Z-平均直径为平均粒度的基于强度的量度。Malvern Zetasizer仪器还用于测量LNP的ζ电位。在测量之前，将样品在0.1X PBS，pH 7.4中以1:17(50μL于800μL中)稀释。
使用基于荧光的测定(ThermoFisher Scientific)来测定总RNA浓度和游离RNA。包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1xTE缓冲液以适当方式稀释LNP样品以测定总RNA或用1x TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制造制剂并且在1x TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中稀释的起始RNA溶液制备标准曲线。接着将稀释的染料(根据制造商的说明书)添加至标准品和样品中的每一者中，并且使它们在不存在光的情况下在室温下孵育大约10分钟。使用SpectraMaxM5微板读数器(Molecular Devices)，以分别设定成488nm、515nm和525nm的激发波长、自动截止波长和发射波长来读取样品。根据适当标准曲线测定总RNA和游离RNA。
包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。可使用相同程序来测定基于DNA或含核酸的货物组分的包封效率。对于单链DNA，可使用Oligreen染料，并且对于双链DNA，可使用Picogreen染料。
使用AF4-MALS自那些计算结果查看分子量和尺寸分布以及二次统计数据。将LNP以适当方式稀释并且使用HPLC自动进样器注射至AF4分离通道中，LNP在所述自动进样器中集中并且接着跨越通道在交叉流中以指数梯度洗脱。所有流体通过HPLC泵和WyattEclipse仪器驱动。自AF4通道洗脱的粒子流经UV检测器、多角度光散射检测器、准弹性光散射检测器和示差折光率检测器。通过使用Debeye模型处理原始数据以根据检测器信号测定分子量和rms半径。
通过耦合至电气溶胶检测器(CAD)的HPLC定量分析LNP中的脂质组分。通过反相HPLC来实现4种脂质组分的色谱分离。CAD为破坏性的基于质量的检测器，其检测所有非挥发性化合物并且不管分析物结构如何，信号都是一致的。
Cas9 mRNA和gRNA货物
通过体外转录制备Cas9 mRNA货物。通过使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶进行体外转录产生包含1X NLS(SEQ ID NO:48)的封端且聚腺苷酸化的Cas9 mRNA。通过在以下条件下与XbaI一起在37℃下孵育2小时来线性化含有T7启动子和100nt poly(A/T)区的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。通过在65℃下加热反应物20分钟来使XbaI失活。使用二氧化硅最大旋柱(Epoch Life Sciences)自酶和缓冲盐纯化线性化质粒并且通过琼脂糖凝胶加以分析以证实线性化。将用于产生Cas9修饰的mRNA的IVT反应物在37℃下在以下条件下孵育4小时：50ng/μL线性化质粒；2mM的GTP、ATP、CTP和N1-甲基假UTP(Trilink)中的每一者；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。在4小时孵育之后，添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)至0.01U/μL的最终浓度，并且再孵育反应物30分钟以去除DNA模板。使用MegaClear转录清除试剂盒根据制造商的方案(ThermoFisher)自酶和核苷酸纯化Cas9 mRNA。或者，用LiCl沉淀法纯化Cas9 mRNA。
此实施例中的sgRNA是化学合成的并且源自商业供应商。sg282序列在下文提供，其中2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键联如下所示(m＝2’-OMe；*＝硫代磷酸酯)：
mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU.(SEQ ID NO:42)。
LNP
根据上文提供的分析方法表征最终LNP以测定包封效率、多分散性指数和平均粒度。
将LNP投配至小鼠(1mg/kg或0.5mg/kg的单次剂量)并且分离基因组DNA以用于如下所述的NGS分析。
体内LNP递送
在各研究中使用6至10周龄范围内的CD-1雌性小鼠。对动物称重并且根据体重分组以基于组平均体重制备投配溶液。经由侧尾静脉以每只动物0.2mL(每公斤体重大致10mL)的体积投配LNP。在给药后大致6小时处对动物观测不良影响。在施用后二十四小时处测量体重，并且通过在异氟烷麻醉下经由心脏穿刺放血在各个时间点将动物安乐死。如本文所述的那样将血液收集至血清分离管中或含有缓冲柠檬酸钠的管中以获得血浆。对于涉及体内编辑的研究，从来自各动物的中叶或三个独立叶片(例如右中、左中和左外侧叶片)收集肝脏组织用于DNA提取和分析。
通过下一代测序(NGS)和血清TTR水平(数据未示出)测量小鼠群组的肝脏编辑。
运甲状腺素蛋白(TTR)ELISA分析
收集血液并且如所指出的那样分离血清。使用小鼠前白蛋白(运甲状腺素蛋白)ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology，目录号OKIA00111)测定小鼠总TTR血清水平。根据制造商的方案，使用大鼠特异性ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology目录号OKIA00159)来测量大鼠TTR血清水平。简而言之，用试剂盒样品稀释剂将血清连续稀释至最终稀释度为10,000倍。接着将此稀释样品添加至ELISA板并且随后根据指示进行测定。
NGS测序
简而言之，为了定量地测定基因组中靶位置处的编辑效率，分离基因组DNA并且利用深度测序鉴别由基因编辑引入的插入和缺失的存在。
在靶位点(例如TTR)周围设计PCR引物，并且扩增目标基因组区域。引物序列在下文提供。根据制造商的方案(Illumina)进行额外PCR以添加测序所必需的化学性质。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段之后，将读段与人类参考基因组(例如hg38)比对。将含有读段的所得文件映射至参考基因组(BAM文件)，其中选择与目标靶区重叠的读段并且计算野生型读段的数目相对于含有插入、取代或缺失的读段的数目。
编辑百分比(例如“编辑效率”或“编辑％”)定义为具有插入或缺失的序列读段的总数相比于包括野生型的序列读段的总数。
图1示出如通过NGS所测量的小鼠肝脏中的编辑百分比。如图1A中所示，当投配1mg/kg RNA时，体内编辑百分比在约20％至超过60％肝脏编辑的范围内。在0.5mg/kg剂量下，图1B，观测到约10％至60％肝脏编辑。在此小鼠体内测试中，所有组合物有效地将Cas9mRNA和gRNA递送至肝脏细胞，证据为通过针对各LNP组合物的NGS所测量的靶位点处的活跃CRISPR/Cas核酸酶活性。含有5％PEG脂质的LNP具有较低包封效率(数据未示出)，和略微降低的效能。
实施例2-LNP组合物分析
LNP的分析表征显示由增加量的脂质A和PEG-脂质配制的LNP中改善的物理化学参数。包含2mol％或3mol％PEG脂质(PEG2k-DMG)的组合物提供于下表3中。
表3.
LNP制剂-交叉流
LNP由冲击射流混合含脂质的乙醇与两个体积的RNA溶液和一个体积的水而形成。经由混合十字管使含脂质的乙醇与两个体积的RNA溶液混合。经由沿线三通管将第四水流与十字管的出口流混合。(参见WO2016010840的图2)。将LNP维持在室温下1小时，并且接着另外用水(大致1:1v/v)稀释。使用切向流过滤在平板滤筒(Sartorius，100kD MWCO)上浓缩经稀释的LNP，并且接着通过渗滤，将其缓冲液更换为50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)。或者，用PD-10脱盐柱(GE)来完成将最终缓冲液更换为TSS。如果需要，用Amicon 100kDa离心过滤器(Millipore)通过离心浓缩制剂。所得混合物接着使用0.2μm无菌过滤器过滤。将最终LNP储存在4℃或-80℃下直至进一步使用。
如同实施例1制备Cas9 mRNA和sgRNA，除了封端和聚腺苷酸化Cas9 U耗尽(Cas9Udep)的mRNA包含SEQ ID N:43。Sg282描述于实施例1中，并且sg534的序列(“G534”)在下面提供：
mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:72)
如实施例1中所述地分析LNP制剂的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA包封效率。
对平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA包封效率的分析结果显示于表4中。除LNP组合物的理论脂质浓度以外，脂质分析也展示实际mol％脂质水平，如下表5中所指示。
表4.
表5.
为了进一步分析物理化学特性，对LNP897、LNP898、LNP966和LNP969进行非对称流场流分离-多角度光散射(AF4-MALS)分析。AF4-MALS仪器测量粒度和分子量分布，并且提供关于粒子构型和密度的信息。
将LNP使用HPLC自动进样器注射至AF4分离通道中，LNP在所述自动进样器中集中并且接着跨越通道在交叉流中以指数梯度洗脱。所有流体通过HPLC泵和Wyatt Eclipse仪器驱动。自AF4通道洗脱的粒子流经UV检测器、Wyatt Heleos II多角度光散射检测器、准弹性光散射检测器和Wyatt Optilab T-rEX示差折光率检测器。通过使用Debeye模型在WyattAstra 7软件中处理原始数据以根据检测器信号测定分子量和rms半径。
LNP的对数差分摩尔质量曲线以图2A形式提供。简而言之，X轴指示摩尔质量(g/mol)，并且Y轴指示差分数分率。对数差分摩尔质量曲线显示针对特定制剂测量的不同分子量的分布。此给出关于制剂内的分子量以及总体分子量分布模式的数据，其给出比平均分子量更好的粒子异质性图像。
通过测量不同摩尔质量矩并计算重均摩尔质量(Mw)与数均摩尔质量(Mn)之比以得到Mw/Mn的多分散性来测定不同LNP制剂的异质性。这些不同制剂的多分散性的图将提供于图2B中。
数据指示在N/P 6.0下，在3mol％PEG以及50mol％和55mol％脂质A下的更紧密粒子分布，如图2A中所示。这反映在如图2B中所示的紧密多分散性中。
实施例3-AF4 MALS数据-其他制剂
LNP的分析表征显示由增加量的脂质A配制的LNP中改善的物理化学参数。包含45mol％、50mol％或55mol％脂质A与两种不同gRNA的组合物提供于下表6中。
表6.
如实施例2中所述地形成LNP。
如上文所述地制备Cas9 mRNA和sgRNA。
如实施例1中所述地表征LNP组合物以测定包封效率、多分散性指数和平均粒度。
对平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA包封效率的分析结果显示于表7中。除LNP组合物的理论脂质浓度以外，脂质分析也展示实际mol％脂质水平，如下表8中所指示。
表7.
表8.
为了进一步分析物理化学特性，对LNP1021、LNP1022、LNP1023、LNP1024和LNP1025进行非对称流场流分离-多角度光散射(AF4-MALS)分析。AF4-MALS仪器测量粒度和分子量分布，并且提供关于粒子构型和密度的信息。
如实施例1中所述地在AF4-MALS上运行LNP。
LNP的对数差分摩尔质量曲线以图3A形式提供。简而言之，X轴指示摩尔质量(g/mol)，并且Y轴指示差分数分率。对数差分摩尔质量曲线显示针对特定制剂计算的不同分子量的分布。此给出关于制剂内的分子量以及总体分子量分布模式的数据，其给出比平均分子量更好的粒子异质性图像。
平均分子量标绘于图3B中。平均分子量为总体分布的平均值，但未给出关于该分布的形状的信息。LNP1022和LNP1025具有相同平均分子量，但LNP1022具有略微较宽的分布。
通过查看不同摩尔质量矩并计算重均摩尔质量(Mw)与数均摩尔质量(Mn)之比以得到Mw/Mn的多分散性来计算不同LNP制剂的异质性。这些不同制剂的多分散性的图将提供于图4A中。
另外，LNP制剂的Burchard-Stockmeyer曲线图以图4B形式提供。Burchard-Stockmeyer曲线图显示跨越自AF4通道洗脱的制剂的rms半径相对于流体动力学半径的比。这给出关于脂质纳米粒子的内部密度的信息。图4B显示LNP1021、LNP1022和LNP1023在此测量中具有不同概况。
实施例4-增加的PEG脂质维持效能伴以减少的细胞因子反应
在另一项研究中，在包含2mol％或3mol％PEG脂质的LNP制剂中比较PEG DMG脂质。包含2mol％或3mol％PEG DMG的组合物提供于下表9中。
表9.
LNP是由实施例2中所述的方法形成。
如实施例1中所述地制备Cas9 mRNA和sgRNA，sg390的序列(“G390”)在下面提供：
mG*mC*mC*GAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:69)。
如实施例1中所述地分析LNP制剂的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA包封效率。
对平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA包封效率的分析结果显示于表10中。除LNP组合物的理论脂质浓度以外，脂质分析也展示实际mol％脂质水平，如下表11中所指示。
表10.
表11.
使用分析MCP-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ的Luminex磁珠多重测定(Milliplex MAP磁珠测定，得自Millipore Sigma，目录号RECYTMAG-65K)来评估大鼠血清细胞因子。在BioRadBioPlex-200上读取测定珠粒并且以BioPlex Manager软件版本6.1使用4参数逻辑拟合自标准曲线计算细胞因子浓度。数据在图5中图示。参见图5A(血清TTR)、图5B(肝脏编辑)和图5C(细胞因子p-MCP1)。
根据制造商的方案，使用大鼠特异性ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology目录号OKIA00159)来测量大鼠TTR血清水平。简而言之，用试剂盒样品稀释剂将血清连续稀释至最终稀释度为10,000倍。接着将此稀释样品添加至ELISA板并且随后根据指示进行测定。
从大约10mg肝脏组织分离基因组DNA并且如上文所述地使用NGS加以分析。用于扩增的PCR引物序列描述于下文。
图5A和图5B显示血清TTR敲落和肝脏编辑在2mol％和3mol％PEG制剂中足够。图5C显示MCP-1反应在使用3mol％PEG制剂时降低。
实施例5-向非人类灵长类动物的LNP递送
用如实施例1中所述制备的LNP制剂进行三项研究。特定摩尔量和货物提供于表12-表26中。含有Cas9 mRNA和指导RNA(gRNA)的各制剂具有按重量计1:1的mRNA:gRNA比率。在表格中指示LNP的剂量(以mg/kg为单位，总RNA含量)、施用途径和动物是否接受地塞米松预处理。对于接受地塞米松(Dex)预处理的动物，在施用LNP或媒介物之前1小时通过IV快速注射以2mg/kg施用Dex。
对于血液化学分析，在如关于测量的各因素在下表中所指示的时间从动物抽取血液。在治疗前和治疗后NHP中测量细胞因子诱导。从受约束的清醒动物的外周静脉将最少0.5mL的全血收集至4ml血清分离管中。在室温下使血液凝结成块持续最少30分钟，之后以2000xg离心15分钟。将血清等分到2个各120μL的聚丙烯微管中，并且储存在-60℃至-86℃下直至分析。使用来自Meso Scale Discovery(MSD)的非人类灵长类动物U-Plex细胞因子定制试剂盒来进行分析。分析中包括以下参数：INF-g、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p40、MCP-1和TNF-a，其中集中于IL-6和MCP-1。如制造商的方案中所指导地制备试剂盒试剂和标准品。以纯形式使用NHP血清。将板在MSD Sector Imager 6000上运行，并且用MSD Discovery work bench软件版本4012进行分析。
在治疗前和治疗后动物中通过酶免疫测定测量补体水平。从受约束的清醒动物的外周静脉将全血(0.5mL)收集至含有0.5mL k2EDTA的管中。将血液以2000xg离心15分钟。将血浆等分到2个各120μL的聚丙烯微管中，并且储存在-60℃至-86℃下直至分析。使用Quidel MicroVue Complement Plus EIA试剂盒(C3a-目录号A031)或(Bb-目录号A027)来进行分析。如制造商的方案中所指导地制备试剂盒试剂和标准品。将板在450nm的光密度下的MSD Sector Imager 6000上运行。使用4参数曲线拟合分析结果。
细胞因子诱导和补体活化的数据提供于下表中。“BLQ”意指小于定量限值。
表12.研究1.
表13.研究2.
表14.研究3.
表15.来自研究1的IL-6测量结果.
表16.来自研究1的MCP-1测量结果.
治疗组
出血前
6小时
24小时
(1)TSS(媒介物)
810.49±178.27
1351.16±397.31
745.25±56.49
(2)LNP699G502
842.31±350.65
19298.49±11981.14
2092.89±171.21
(3)LNP688G506
1190.79±383.64
13500.17±12691.60
1414.71±422.43
(4)LNP689G509
838.63±284.42
14427.7±8715.48
1590±813.23
(5)LNP690G510
785.32±108.97
52557.24±48034.68
6319.77±983.37
表17.来自研究1的补体C3a测量结果.
治疗组
出血前
6小时
第7天
(1)TSS(媒介物)
23.9±11.95
25.51±14.79
30.67±18.36
(2)LNP699G502
32.36±11.29
94.33±58.45
38.50±12.69
(3)LNP688G506
22.30±1.73
127.00±22.34
37.80±6.86
(4)LNP689G509
35.83±21.94
174.00±44.51
50.83±21.92
(5)LNP690G510
36.30±8.21
163.00±40.60
42.50±12.44
表18.来自研究1的补体bb测量结果.
治疗组
04-bb
出血前
6小时
第7天
(1)TSS(媒介物)
对照
1.53±0.19
3.37±2.13
1.43±0.71
(2)LNP699G502
G502
1.45±0.39
9.01±5.28
1.57±0.54
(3)LNP688G506
G506
1.45±0.78
11.78±2.33
1.78±0.84
(4)LNP689G509
G509
1.95±0.99
15.73±2.23
2.83±0.88
(5)LNP690G510
G510
2.12±0.44
13.57±1.23
2.21±0.72
表19.来自研究2的IL-6测量结果.
表20.来自研究2的MCP-1测量结果.
治疗组
出血前
90分钟
6小时
24小时
第7天
(1)TSS(媒介物)
312.12
197.24
145.36
177.02
403.82
(2)TSS(媒介物)
232.44
175.08
187.72
136.64
325.69
(3)LNP898G502
249.1
2183.5
1814.64
1887.41
372.38
(4)LNP898G502
349.51
430.49
5635.55
953.05
236.6
(5)LNP897G502
492.3
989.98
409.08
302.97
506.82
(6)LNP897G502
283.79
225.1
1141.08
484.59
259.46
(7)LNP897G502
223.16
349.79
398.57
172.67
287.09
(8)LNP897G502
584.42
853.51
3880.81
1588.46
692.99
(9)LNP916GFP
325.84
BLQ
1189.97
2279.82
BLQ
(10)LNP916GFP
175.47
BLQ
3284.16
2023.53
BLQ
表21.来自研究2的补体C3a测量结果.
治疗组
出血前
90分钟
6小时
24小时
第7天
(1)TSS(媒介物)
0.087
0.096
0.048
0.033
0.038
(2)TSS(媒介物)
0.369
0.311
0.146
0.1
0.106
(3)LNP898G502
0.087
0.953
0.647
0.277
0.065
(4)LNP898G502
0.099
0.262
0.123
0.049
0.044
(5)LNP897G502
0.067
0.479
0.209
0.036
0.036
(6)LNP897G502
0.141
0.433
0.34
0.11
0.074
(7)LNP897G502
0.1
0.345
0.396
0.096
0.127
(8)LNP897G502
0.261
0.458
0.409
0.244
0.313
(9)LNP916GFP
0.149
BLQ
0.714
0.382
BLQ
(10)LNP916GFP
0.117
BLQ
0.752
0.723
BLQ
表22.来自研究2的补体bb测量结果.
表23.来自研究3的IL-6测量结果.
表24.来自研究2的MCP-1测量结果.
表25.来自研究3的补体C3a测量结果.
表26.来自研究3的补体bb测量结果.
实施例6-PEG脂质筛选
在另一项研究中，在包含2mol％或3mol％PEG脂质的LNP制剂中比较替代PEG脂质。
在该研究中使用三种PEG脂质：脂质1(DMG-PEG2k；Nof)描述为：
脂质2，如Heyes等人,J.Controlled Release,107(2005),第278-279页(参见“Synthesis of PEG2000-C-DMA”)中所述地合成，可描述为：
和脂质3，公开于WO2016/010840(参见化合物S027，第[00240]段至第[00244]段)和WO2011/076807中，可描绘为：
由2mol％和3mol％的各PEG脂质配制脂质A。将脂质纳米粒子组分以上述脂质组分摩尔比溶解于100％乙醇中。简而言之，在25mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH 5.0中制备RNA货物，产生大约0.45mg/mL的RNA货物浓度。以约4.5的脂质胺与RNA磷酸酯(N:P)摩尔比和按重量计1:1的mRNA与gRNA比率配制LNP。
表27.
如实施例1中所述地制备Cas9 mRNA、sg282和LNP。
将具有脂质1、脂质2或脂质3的LNP组合物施用至雌性CD-1小鼠并且如实施例1中所述地在1mg/kg和0.5mg/kg体重下进行评定。根据实施例1的方法通过下一代测序(NGS)和血清TTR水平测量小鼠群组的肝脏编辑。
图6A和图6B比较PEG脂质制剂之间的血清TTR水平。图6A以μg/mL为单位显示血清TTR，并且图6B将数据显示为敲落百分比(％TSS)。图6C显示在肝脏中达到的编辑百分比。数据指示具有各测试PEG脂质的LNP组合物在2mol％和3mol％下测试效能，其中脂质1始终比脂质2和脂质3表现略好。
实施例7-脂质A类似物
合成脂质A的多种结构类似物并且在本文所述的LNP组合物中测试。
合成：如下制得脂质A：使4,4-双(辛氧基)丁酸(WO2015/095340的实施例13中的“中间体13b”)与十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-羟基-2-(羟基甲基)丙酯(“中间体13c”)反应，随后通过使中间体13b和中间体13c的产物与3-二乙氨基-1-丙醇反应来添加头基。(参见WO2015/095340的第84-86页)。
如下经由4,4-双(辛氧基)丁腈合成来自WO2015/095340的中间体13b(4,4双(辛氧基)丁酸)：
中间体13a：4,4-双(辛氧基)丁腈
在室温下向4,4-二乙氧基丁腈(9.4g，60mmol)和辛-1-醇(23.1g，178mmol)的混合物中添加对甲苯磺酸吡锭(748mg，3.0mmol)。将混合物升温至105℃并且在反应容器空气流通并且未装有回流冷凝器的情况下搅拌18小时。接着将反应混合物冷却至室温并且硅胶纯化(0-5％梯度的乙酸乙酯于己烷中)，得到10.1g(31.0mmol)呈透明油状物的中间体13a。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.55(t,J＝5.3Hz,1H),3.60(dt,J＝9.2,6.6Hz,2H),3.43(dt,J＝9.2,6.6Hz,2H),2.42(t,J＝7.4Hz,2H),1.94(td,J＝7.4,5.3Hz,2H),1.63–1.50(m,4H),1.38–1.19(m,20H),0.93–0.82(m,6H)ppm。
随后，在室温下向中间体13a(8.42g，31mmol)于乙醇(30mL)中的溶液中添加31mL氢氧化钾水溶液(2.5M，30.9mL，77.3mmol)。在为容器装配回流冷凝器后，将混合物加热至110℃并且搅拌24小时。接着将混合物冷却至室温，用盐酸水溶液(1N)酸化至pH值5，并且萃取至己烷中三次。将合并的有机萃取物用水(两次)和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩，获得8.15g(23.6mmol)呈透明油状物的中间体13b，其不经进一步纯化即使用。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.50(t,J＝5.5Hz,1H),3.57(dt,J＝9.4,6.7Hz,2H),3.41(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.40(t,J＝7.4Hz,2H),1.92(td,J＝7.4,5.3Hz,2H),1.56(m,4H),1.37–1.21(m,20H),0.92–0.83(m,6H)ppm(结构如下)。
中间体13b
使用上文所述的方法，使用适当烷-1-醇试剂制备C(5、6、7、9和10)-缩醛酸中间体，称作中间体B3-F3并且描绘于下文。
中间体B3 4,4-双(戊氧基)丁酸
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.52(t,J＝5.5Hz,1H),3.58(dt,J＝9.3,6.6Hz,2H),3.41(dt,J＝9.3,6.7Hz,2H),2.45(t,J＝7.4Hz,2H),1.94(m,2H),1.57(m,4H),1.32(m,J＝3.7Hz,8H),0.95–0.83(m,6H)ppm。
中间体C3：4,4-双(己氧基)丁酸
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.44(t,J＝5.6Hz,1H),3.49(dt,J＝9.3,6.9Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.8Hz,2H),2.12(t,J＝7.6Hz,2H),1.79(q,J＝7.0Hz,2H),1.54(m,4H),1.29(m,12H),0.94–0.82(m,6H)ppm。
中间体D3：4,4-双(庚氧基)丁酸
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.85(br s,1H),4.46(t,J＝5.6Hz,1H),3.52(dt,J＝9.4,6.8Hz,2H),3.39(dt,J＝9.3,6.8Hz,2H),2.26(t,J＝7.6Hz,2H),1.85(q,J＝7.0Hz,2H),1.53(m,4H),1.29(m,16H),0.94–0.80(m,6H)ppm。
中间体E3：4,4-双(壬氧基)丁酸
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.32(br s,1H),4.44(t,J＝5.6Hz,1H),3.49(dt,J＝9.3,6.9Hz,2H),3.38(dt,J＝9.4,6.9Hz,2H),2.10(t,J＝7.6Hz,2H),1.78(q,J＝7.0Hz,2H),1.53(m,4H),1.27(m,24H),0.88(t,J＝6.6Hz,6H)ppm。
中间体F3：4,4-双(癸氧基)丁酸：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.48(t,J＝5.5Hz,1H),3.55(m,2H),3.42(m,2H),2.29(dd,J＝10.8,7.5Hz,2H),1.90–1.82(m,2H),1.55(m,4H),1.27(m,28H),0.88(t,J＝6.7Hz,6H)ppm。
如下合成脂质A的缩醛类似物(C(8))：使C(5、6、7、9或10)-缩醛酸中间体(B3-F3)与中间体13c反应，随后使该步骤的产物与3-二乙氨基-1-丙醇反应。(参见WO2015/095340的第84-86页)。合成各类似物并且通过1H NMR(数据未示出)进行表征。
在45mol％脂质A类似物、2mol％DMG-PEG2k、9mol％DSPC和44mol％胆固醇以及4.5的N:P比下配制C7、C9和C10类似物。另外在55mol％脂质A类似物、2.5mol％DMG-PEG2k、9mol％DSPC和38.5mol％胆固醇以及6的N:P比下配制各类似物。将脂质纳米粒子组分以上述脂质组分摩尔比溶解于100％乙醇中。在25mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH 5.0中制备RNA货物，产生大约0.45mg/mL的RNA货物浓度。
RNA货物包括如上文所述制备的包含SEQ ID NO:43和sg282的Cas9 mRNA。如实施例1中所述地形成LNP。
除先前组以外，还测试扩展组的缩醛类似物，包括包含C(5)和C(6)脂质A类似物的LNP组合物。如上文所述，在55mol％脂质A类似物、2.5mol％DMG-PEG2k、9mol％DSPC和33.5mol％胆固醇以及6的N/P比下配制两种新类似物。分析指示所有LNP的尺寸低于120nm，PDI低于0.2并且囊封RNA％高于80％。制剂的分析结果在下表28中。
表28.
使用溶解于水中的6-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(“TNS”)评定类似物的pKa。在此测定中，在介于4.5至10.5范围内的不同pH值下制备0.1M磷酸盐缓冲液。在100％乙醇中单独地制备各类似物。接着将脂质和TNS添加于个别pH缓冲液中并且转移至板以在SpectraMax酶标仪上在321-488nm波长下进行分析。绘制值以产生pKa，将logIC50用作pKa。
如实施例1中所述地以0.3mg/kg(图7A-图7E)或以0.1mg/kg(图7F-图7G)向雌性CD-1小鼠给药。简而言之，向来自Charles River Laboratories的CD-1雌性小鼠(n＝5/组)施用改变剂量的LNP组合物。尸体剖检(给药后7天)时，收集血清用于TTR分析并且收集肝脏用于编辑分析。如实施例1中所述地进行血清TTR和编辑百分比测定。来自图7A-图7E的血清TTR水平和肝脏编辑指示所有类似物在0.3毫克/公斤体重下的表现与脂质A相当。图7F-图7G指示尽管脂质A具有最高效能，但新合成的类似物全部具有合适的TTR敲落和肝脏编辑。
实施例8-剂量反应曲线-原代食蟹猴肝细胞
原代肝细胞.将原代食蟹猴肝细胞(PCH)(Gibco)解冻并且重悬于具有补充剂的肝细胞解冻培养基(Gibco，目录号CM7000)中，之后以80g离心4分钟。丢弃上清液并将沉淀的细胞重悬于肝细胞平铺培养基加补充包(Invitrogen，目录号A1217601和CM3000)中。对细胞进行计数并且以50,000个细胞/孔的密度平铺在经Bio-coat胶原蛋白I包被的96孔板(ThermoFisher，目录号877272)上。在LNP施用之前使平铺的细胞在组织培养孵育器(37℃和5％CO2气氛)中静置和粘附24小时。在孵育之后，针对单层形式检查细胞并且用具有无血清补充包(Invitrogen，目录号A1217601和CM4000)的肝细胞培养基替换培养基。
如上文所述地制备用于此研究的LNP制剂(LNP1021、LNP1022、LNP1023、LNP1024、LNP1025和LNP897)。
在原代食蟹猴肝细胞上测试各种剂量的含有修饰的sgRNA的脂质纳米粒子制剂以产生剂量反应曲线。在平铺和培养24小时之后，将LNP在含有6％食蟹猴血清的肝细胞维持培养基中在37℃下孵育5分钟。孵育后，将LNP以起始于100ng mRNA的8点2倍剂量反应曲线添加至原代食蟹猴肝细胞上。如实施例1中所述地将细胞在处理后72小时溶解用于NGS分析。针对各种LNP组合物测定编辑百分比并且将数据图示于图8A中。Cas9 mRNA(SEQ ID NO48)和U耗尽Cas9 mRNA(SEQ I NO:43)的编辑％呈现于图8B中。LNP组合物描述于表2(LNP897)和表5(LNP 1021、1022、1023、1024和1025)中。
结果显示用于比较效能评定的定量测定，表明mRNA和LNP组合物均影响效能。
实施例9-RNA货物：mRNA和gRNA共制剂
此研究评估不同gRNA与mRNA比率在小鼠体内的功效。通过如实施例1中所指示的IVT合成用替代尿苷三磷酸的N1-甲基假尿苷三磷酸来制得经CleanCapTM加帽的具有SEQ IDNO:4的ORF、HSD5’UTR、人类白蛋白3’UTR、Kozak序列和poly-A尾的Cas9 mRNA。
由所述mRNA和如实施例2中所述的sg282(SEQ ID NO:42；G282)与脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG以50:38:9:3摩尔比并且以6的N:P比制备LNP制剂。制剂的gRNA:Cas9mRNA重量比如表29中所示。
表29.
对于体内表征，以每千克0.1mg总RNA(指导RNA毫克数+mRNA毫克数)向小鼠施用以上LNP(n＝5/组)。在给药后7至9天，将动物处死，收集血液和肝脏，并且如实施例1中所述测量血清TTR和肝脏编辑。血清TTR和肝脏编辑结果显示于图9A和图9B中。向阴性对照小鼠投配TSS媒介物。
此外，以每千克0.05mg mRNA的恒定mRNA剂量(n＝5/组)，同时将gRNA剂量自0.06mg/kg变为0.4mg/kg来向小鼠施用以上LNP。在给药后7至9天，将动物处死，收集血液和肝脏，并且测量血清TTR和肝脏编辑。血清TTR和肝脏编辑结果显示于图9C和图9D中。向阴性对照小鼠投配TSS媒介物。
实施例10-中性脂质
为了评估LNP的体内功效，如实施例2中所述地用实施例2的mRNA和sg534(SEQ IDNO:72；G534)制备LNP制剂。将脂质纳米粒子组分以下述脂质组分摩尔比溶解于100％乙醇中。简而言之，在25mM柠檬酸盐和100mM NaCl的缓冲液(pH 5.0)中制备RNA货物，产生大约0.45mg/mL的RNA货物浓度。以约6的脂质胺与RNA磷酸酯(N:P)摩尔比和按重量计1:2的gRNA与mRNA比率配制LNP。
如实施例1中所述地分析LNP制剂的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA包封效率。对平均粒度、多分散性(PDI)、总RNA含量和RNA包封效率的分析结果显示于表30中。脂质的摩尔比以胺脂质(脂质A)/中性脂质/辅助脂质(胆固醇)/PEG脂质(PEG2k-DMG)形式提供。中性脂质为DSP、DPPC或不存在(如所指定的)。
表30.LNP组合物和数据.(脂质的摩尔比以胺脂质(脂质A)/中性脂质/辅助脂质(胆固醇)/PEG脂质(PEG2k-DMG)形式提供。)
对于体内表征，将以上LNP以每千克体重0.3mg总RNA(指导RNA和mRNA)静脉内施用至雌性斯普拉格杜勒大鼠(Sprague Dawley rat)。每组存在五只大鼠。在给药后七天，将动物处死，收集血液和肝脏，并且如实施例1中所述测量血清TTR和肝脏编辑。向阴性对照动物投配TSS媒介物。血清TTR和肝脏编辑结果显示于图10A和10B，以及表30(上文)中。
公开序列表简述
关于序列本身，参见下文序列表。转录物序列通常包括呈与ARCA一起使用的前三个核苷酸形式的GGG或呈与CleanCapTM一起使用的前三个核苷酸形式的AGG。因此，前三个核苷酸可经过修饰以与其他加帽方法，诸如牛痘加帽酶一起使用。启动子和poly-A序列不包括在转录物序列中。启动子，诸如T7启动子(SEQ ID NO:31)和poly-A序列，诸如SEQ ID NO:62或63可在5’端和3’端处分别附接于所公开的转录物序列。大多数核苷酸序列以DNA形式提供，但可通过将T变成U而容易地转化成RNA。
序列表
以下序列表提供本文所公开的序列的清单。应理解，如果相对于RNA提及DNA序列(包含T)，则T应被U(取决于上下文，其可为修饰的或未修饰的)置换，反之亦然。
*＝PS键联；'m'＝2'-O-Me核苷酸
小鼠G000282NGS引物序列
正向引物：
CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTTTGTTCCAGAGTCTATCACCG
反向引物：
GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACACGAATAAGAGCAAATGGGAAC
大鼠G000390NGS引物序列
正向引物：
CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCATTTCATGAGACCGAAAACA
反向引物：
GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTACAGTAGAGCTGTACATAAAACTT
GFP序列：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAGGAATTATGCAGTCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCTAGACTTAAGCTTGATGAGCTCTAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCG