一种医用水凝胶敷料、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种医用水凝胶敷料、其制备方法及应用 (Medical hydrogel dressing, and preparation method and application thereof ) 是由 李泽 王培戈 任建安 黄金健 于航 肖志保 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及一种医用水凝胶敷料、其制备方法及应用,所述医用水凝胶敷料包括间充质干细胞、修饰的纤连蛋白、甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶以及纳米微胶囊水凝胶组成。所述医用水凝胶的制备方法包括：通过改进的双乳法制备包封干细胞生长因子的纳米微胶囊,将纳米微胶囊与甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶混合涂覆于聚丙烯网片上,并将修饰的纤连蛋白添加在水凝胶表面,通过光照形成结构稳定的水凝胶敷料。该水凝胶本身的成分为天然材料,因此生物相容性极高,可作为细胞生长的支架。搭载了间充质干细胞,通过纳米技术,控制干细胞生长因子缓慢释放,为干细胞生长提供合适的微环境,干细胞通过自身增殖分化并通过旁分泌募集更多干细胞,加速组织愈合,加快病损修复,临床应用前景良好。(The invention particularly relates to a medical hydrogel dressing, a preparation method and application thereof, wherein the medical hydrogel dressing comprises mesenchymal stem cells, modified fibronectin, glycidyl methacrylate xanthan gum and nano microcapsule hydrogel. The preparation method of the medical hydrogel comprises the following steps: the nano microcapsule for encapsulating the stem cell growth factor is prepared by an improved double-emulsion method, the nano microcapsule and glycidyl methacrylate xanthan gum are mixed and coated on a polypropylene mesh, modified fibronectin is added on the surface of hydrogel, and the hydrogel dressing with stable structure is formed by illumination. The hydrogel is made of natural materials, so that the hydrogel has extremely high biocompatibility and can be used as a scaffold for cell growth. The mesenchymal stem cells are carried, the slow release of stem cell growth factors is controlled through a nanotechnology, a proper microenvironment is provided for the growth of the stem cells, the stem cells are proliferated and differentiated by themselves and recruited by paracrine, the tissue healing is accelerated, the lesion repair is accelerated, and the clinical application prospect is good.)
技术领域
本发明属于医用水凝胶敷料技术领域，具体涉及一种纳米微胶囊、应用所述纳米微胶囊的水凝胶、及应用所述水凝胶的医用敷料，所述纳米微胶囊、水凝胶及医用敷料的制备方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
腹部败血症，腹腔综合征(ACS)，外伤或手术引起的腹壁缺损是临床上常见的问题，对于上述患者进行腹腔开放治疗目前已存在共识，所谓腹腔开放疗法是指开腹手术后不直接缝合皮肤和筋膜，待器官功能恢复后再关闭腹腔。但是长期开腹容易造成体液丢失和继发的内脏损伤和感染，而且接受腹腔开放治疗的患者还存在发生肠–空气瘘和“冰冻腹”的风险，并且确定的筋膜闭合率较低，而腹壁的重建是解决这些问题的方法，即在肠管上形成足够的肉芽组织时进行皮肤移植。临时腹部闭合(TAC)在筋膜保持打开时为腹部内脏提供保护，为腹壁重建打下了良好的基础。
传统的临时腹部闭合措施如覆盖假体材料已被广泛应用，例如聚丙烯(PP)，其良好的机械性能可提高腹壁筋膜的强度，以防止筋膜回缩。但它也会产生局部副作用，例如粘附，侵蚀和瘘管形成，这主要是因为缺少天然组织来保护内部器官。
间充质干细胞治疗已被用于多种疾病的受损组织再生。其具有容易分离、自我更新能力强、增殖能力强等特点，广泛应用于再生医学领域。间充质干细胞可以促进创面愈合过程中血管的生成，对慢性难愈性伤口或迁延不愈的伤口也有很好的疗效。但是，由于局部干细胞递送后细胞的存活/保留较差，极大影响了干细胞疗法的应用。
水凝胶是聚合材料的三维网络，可以吸收或保留大量的水或生物流体。它在生物医学应用中显示出巨大的潜力，例如药物输送、组织工程和再生医学。水凝胶可以模拟体内组织的许多特性，用作组织工程的支架，以重建和修复体内组织。水凝胶本身的成分主要来自天然材料，使其具有极高的生物相容性，因此可用作细胞培养的二维载体。此外，单纯的水凝胶仅能降低病损周围细胞的炎症反应。然而，由于病损局部增殖能力有限，使得单纯水凝胶的治疗效果一般，所以其在临床上的应用被大大限制了。
发明内容
针对上述研究背景，本发明提供了一种用于腹腔开放临时关腹及大面积皮肤损伤的医用载干细胞的黄原胶水凝胶敷料。所述医用敷料表面搭载间充质干细胞，并且通过纳米微胶囊包载干细胞生长因子促进创面皮肤修复，提高愈合质量。另外，纳米微胶囊配合改性后的黄原胶形成的水凝胶，提供了更为适宜成纤维细胞生长的硬度条件和形变能力。
基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种纳米微胶囊，所述纳米微胶囊的原料包括生长因子、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆、聚乙烯醇。
在上述纳米微胶囊中，其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物/泊洛沙姆构成包裹生长因子的微球。其中，生长因子为通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多功能调节肽，依据所述纳米微胶囊的使用目的进行调整。当作为医用敷料进行使用时，通常添加的生长因子包括表皮生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、血小板衍生生长因子等。
本发明具体提供一种包载干细胞生长因子的纳米微胶囊，与间充质干细胞共培养后用于皮肤创面。其中，纳米微胶囊可控制释放干细胞生长因子，能够促进搭载的间充质干细胞的生长。
本发明第二方面，提供第一方面所述纳米微胶囊的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆的有机溶液与聚乳酸-羟基乙酸共聚物、干细胞生长因子的水溶液混合后乳化得到初始乳液，将初始乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化得到双乳液，除去双乳液中的有机溶剂得到纳米粒子，将纳米粒子与矿物油的海藻酸钠溶液注入水相中得到纳米微胶囊。
采用上述方法制作的纳米微胶囊有着极好的药物控释能力，可以通过调整纳米微胶囊的直径来调控干细胞生长因子的释放速度。用于包载不同类型的生长因子，体释放量均可以达到80％，释放效果良好。因此采用上述方法制作的水凝胶能够为干细胞的存活及生长提供合适的微环境。
本发明第三方面，提供一种水凝胶，所述水凝胶的制备原料包括第一方面所述纳米微胶囊，还包括甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶(XG)。
本发明第四方面，提供第三方面所述水凝胶的制备方法，所述制备方法包括将甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶与纳米微胶囊混合后通过光照固化得到所述水凝胶。
基于上述纳米微胶囊良好的控制作用，将其应用于医用敷料的制备能够实现良好的药物控释效果，或为干细胞生长持续提供营养物质，辅助伤口愈合。本发明进一步的提供了一种水凝胶，为纳米微胶囊提供一种固化的使用形式，另外，通过改性黄原胶与微胶囊形成水凝胶，作为医用敷料具有良好的机械性能。
本发明第五方面，提供第一方面所述纳米微胶囊和/或第三方面所述水凝胶在制备医用敷料中的应用。
本发明第六方面，提供一种医用水凝胶敷料，所述医用水凝胶敷料由第三方面所述水凝胶与网片共同构成间充质干细胞载体。
本发明第七方面，提供第六方面所述医用水凝胶敷料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶与纳米微胶囊混合涂布于网片上，并添加纤连蛋白，通过光照使网片上的物质成为胶状，再将间充质干细胞置于水凝胶上共培养既得。
载间充质干细胞水凝胶通过干细胞的增殖分化，可解决损伤局部增殖能力有限的问题。并通过旁分泌上百种因子，包括生长因子、细胞因子、趋化因子、酶等，加速病损周围组织细胞的增殖并募集更多自体干细胞，在创面局部应用间充质干细胞水凝胶可促进损伤组织的修复并提高愈合质量。
采用上述方法制备的水凝胶敷料的第二层即聚丙烯网片层具有良好的机械性能，可有效防止腹膜回缩。而本发明所述水凝胶敷料的第一层即载干细胞水凝胶层具有良好的柔软性、弹性和润湿性可以大大减少聚丙烯网在肠道上的磨损和炎症反应，对保护肠道浆膜层有很好的效果，还可减少软组织炎症，肠管磨损和肠大气瘘的发生率，并通过搭载间充质干细胞，促进局部损伤组织的修复。
上述医用水凝胶在临床使用中，可通过分离患者自体组织分离的方式降低排异发生概率，所述自体组织包括脐带、骨髓及脂肪，优选的方案采用患者自体脂肪组织进行分离培养。
以上一个或多个技术方案的有益效果如下：
(1)采用上述方法制备的医用水凝胶，可模拟干细胞的细胞外基质，使用时可直接缝合于腹腔开放临时关腹手术中，也可贴合于较大的皮肤创面。水凝胶原料为天然高分子材料，其良好的生物相容性已经在体外细胞实验及动物实验中得到证实。且这种水凝胶敷料添加的光引发剂和各种缓冲剂均无安全性危害。
(2)采用上述方法制备的水凝胶敷料具有良好的硬度，因为水凝胶的硬度影响成纤维细胞的形态，只有强度大于20KPa才能维持其正常形态，而本发明通过压缩测试证实所述水凝胶的强度范围在0.16-0.50MPa之间，所以能够较好地满足成纤维细胞的生长条件。另外，本发明通过流变学测试发现本发明所述的互穿双网络水凝胶较单一水凝胶有更好的流变特性即形变能力，所以采用上述方法制作的水凝胶能够更好地贴合腹腔开放患者的伤口进而减少并发症。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述医用水凝胶敷料的结构示意侧视图；
图2为实施例1中所述医用水凝胶敷料的结构示意俯视图；
图1～图2中，1、载干细胞水凝胶层，2、聚丙烯网片层。
图3为实施例1中所述纳米微胶囊及水凝胶的电镜图；
其中，图3A为所述纳米微胶囊电镜图，图3B为所述水凝胶电镜图。
图4为实施例1中所述水凝胶的频率依赖性流变结果图(应变为1％)；
其中，图4A为水凝胶粘度曲线图；
图4B为水凝胶弹性模量曲线图。
图5为实施例1中所述纳米微胶囊药物释放曲线图；
其中，图5A为包载血管内皮生长因子的纳米微胶囊释放曲线图；
图5B为包载表皮生长因子的纳米微胶囊释放曲线图。
图6为实施例3中采用水凝胶培养间充质干细胞结果图；
其中，图6A为间充质干细胞在水凝胶基质上培养24h后的荧光图；
图6B为间充质干细胞在水凝胶基质上培养48h后的荧光图；
图6C为间充质干细胞在24孔板和水凝胶基质上培养结果直方图(*p<0.05,**p<0.01)。
图7为实施例3中腹腔开放创面7天后新生肉芽组织HE染色图；
其中，图7A为采用聚丙烯补片覆盖创面7天后新生肉芽组织的染色结果图；
图7B为医用敷料覆盖创面7天后新生肉芽组织染色结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种医用水凝胶敷料、其制备方法及应用。
本发明第一方面，提供一种纳米微胶囊，所述纳米微胶囊的原料包括生长因子、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆、聚乙烯醇。
优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆作为生长因子的载体。
优选的，所述生长因子为通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多功能调节肽，依据微胶囊的使用目的进行选择。
进一步优选的，所述生长因子为干细胞生长因子，即表皮生长因子、纤维细胞生长因子以及血管内皮细胞生长因子的混合物。
本发明第二方面，提供第一方面所述纳米微胶囊的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆的有机溶液与聚乳酸-羟基乙酸共聚物、干细胞生长因子的水溶液混合后乳化得到初始乳液，将初始乳液与聚乙烯醇溶液进行乳化得到双乳液，除去双乳液中的有机溶剂得到纳米粒子，将纳米粒子与矿物油的海藻酸钠溶液注入水相中得到纳米微胶囊。
优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆的有机溶液为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆的二氯甲醚溶液。
优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、泊洛沙姆的有机溶液与聚乳酸-羟基乙酸共聚物、干细胞生长因子的水溶液混合后通过超声乳化；进一步优选的，所述超声时间为3～4min。
优选的，所述初始乳液与1.5～2.5％的聚乙烯醇溶液通过声波降解法乳化得到双乳液。
优选的，所述制备方法中，还包括将双乳液加入更低浓度聚乙烯醇溶液中进行搅拌处理的步骤。
进一步优选的，所述更低浓度聚乙烯醇溶液为0.5～0.7％的聚乙烯醇溶液。
进一步优选的，所述搅拌时间为17～23min。
优选的，所述制备方法通过旋转蒸发除去双乳液中的有机溶剂得到纳米粒子。
进一步优选的，所述旋转蒸发的参数如下：转速为12000～14000rpm；离心时间为8～12min。
进一步优选的，所述得到纳米粒子后，还包括洗涤步骤。
优选的，所述水相为氯化钙溶液。
本发明第三方面，提供一种水凝胶，所述水凝胶的制备原料包括第一方面所述纳米微胶囊，还包括甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶(XG)。
本发明第四方面，提供第三方面所述水凝胶的制备方法，所述制备方法包括将甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶(XG)与纳米微胶囊混合后通过光照固化得到所述水凝胶。
优选的，所述制备方法具体步骤如下：将甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶溶于含有光引发剂的PBS溶液得到甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶溶液，将纳米微胶囊与甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶溶液以质量比3～5:5～7进行混合，经紫外光照后得到所述水凝胶。
进一步优选的，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶溶液制备的具体步骤如下：将甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶溶于含有光引发剂的、0.08～0.12％(w/v)的PBS溶液中，得到8～12％(w/v)的甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶溶液。
进一步优选的，所述光引发剂为I-2959，即2-羟基-4`-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮；在一些具体的实施方式中，所述光引发剂的浓度为0.08～0.12％(w/v)。
进一步优选的，所述紫外光波长为365nm，单位面积功率为6.0W/cm2，照射时间为30S。
优选的，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶的制备方法如下：将黄原胶的水溶液加热至75～85℃，之后向其中逐滴加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)并在室温下搅拌，加入酸液调节pH至4.2-4.8，再加热至75～85℃反应10～14h得到混合物，将混合物置于透析膜中进行透析，透析完成后，将透析袋内的溶液冻干即可得到甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶。
进一步优选的，所述黄原胶的水溶液为0.5～0.7％(w/v)。
进一步优选的，所述黄原胶水溶液与甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的体积比为270:1～2。
进一步优选的，所述透析膜的截留分子量为12-14kDa。
本发明第五方面，提供第一方面所述纳米微胶囊和/或第三方面所述水凝胶在制备医用敷料中的应用。
本发明第六方面，提供一种医用水凝胶敷料，所述医用水凝胶敷料由第三方面所述水凝胶与网片共同构成间充质干细胞载体。
优选的，所述水凝胶涂布于网片上通过紫外光照形成胶状，构成间充质干细胞的培养载体。
优选的，所述网片为聚丙烯网片。
本发明第七方面，提供第六方面所述医用水凝胶敷料的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶与纳米微胶囊混合涂布于网片上，并添加纤连蛋白，通过光照使网片上的物质成为胶状，再将间充质干细胞置于水凝胶上共培养既得。
优选的，所述纤连蛋白为丙烯酰聚乙二醇纤连蛋白。
进一步优选的，所述丙烯酰聚乙二醇纤连蛋白的浓度为0.6～0.7umol/ml。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。以下实施例中所采用的血管内皮生长因子购自金瑞斯生物科技有限公司；表皮生长因子购自艾博抗(上海)贸易有限公司；未说明来源试剂均可通过市售途径购买。
实施例1
(1)制备包封干细胞生长因子的纳米微胶囊：将20mg的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和40mg的泊洛沙姆F127，溶于4ml的二氯甲醚中。将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和0.4ml含有干细胞生长因子的去离子水转移到离心管中，超声乳化两种不混溶溶液2分钟得到初始乳液。
之后，将初始乳液和8mL 2％的聚乙烯醇溶液通过超声乳化4分钟获得双乳液，再将其缓缓加入到12ml 0.6％的聚乙烯醇溶液并在室温下搅拌20分钟得到双乳液。所述双乳液旋转蒸发去除有机溶剂后，在室温下13000rpm离心10min收集聚乙烯醇纳米粒子，用去离子水洗涤3次。将含有纳米粒子和矿物油的2％纯化海藻酸钠溶液通过微流控装置，注入氯化钙溶液。
所有溶液均无菌，使用前用10mm羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲以保持pH 7.2。使用注射泵在室温下将溶液注入微流控装置，在油中生成100-400nm的微胶囊，然后将其提取到氯化钙溶液(水相)中。该设备的出口连接到一个100毫升含有等渗甘露醇溶液的离心管。
(2)合成甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶(XG)：将黄原胶粉末溶解在去离子水中，搅拌过夜制备黄原胶水溶液(0.6％w/v)。然后，将270mL所述黄原胶水溶液倒入圆底烧瓶中并使用油浴加热至80℃。然后，逐滴加入1.88mL甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)并在室温下搅拌混合物，并使用盐酸将其pH调节至4.2-4.8。在80℃反应12小时后，收集所得溶液。最后，使用透析膜(截留分子量：12-14kDa)对去离子水透析混合物3天，每8小时更换一次沉透介质，并将透析膜内的溶液在冷冻干燥器中冻干即可得到甲基丙烯酸缩水甘油酯黄原胶(XG)。将XG溶于含有0.1％(w/v)I-2959的0.1％(w/v)PBS水中，得到10％(w/v)浓度的XG溶液。
(3)制作载干细胞的黄原胶水凝胶敷料：将XG溶于含有0.1％(w/v)I-2959的0.1％(w/v)PBS水中，得到10％(w/v)浓度的XG溶液。将纳米微胶囊与XG溶液以体积比为4∶6比例混合，将该水凝胶混合溶液涂布于聚丙烯网片(图1中2指示)上后添加0.64umol/mL丙烯酰聚乙二醇纤连蛋白，再使用紫外灯照射后即可成胶，将间充质干细胞置于水凝胶上共培养后即为载干细胞水凝胶敷料(图1中1指示)。
实施例2
本实施例中，所述间充质干细胞通过实验鼠脂肪组织分离提取得到。将间充质干细胞置于24孔板以及复合水凝胶表面进行培养24小时以及72小时，通过活/死细胞染色试剂盒(大连美伦生物技术有限公司)进行染色后，采用荧光显微镜记录图像进行比较的结果可以看出，水凝胶无细胞毒性并促进了细胞的增殖。动物实验结果提示干细胞水凝胶有助于大鼠腹腔开放创面的组织修复。
实施例3
本实施例中，针对实施例1中制备得到的纳米微胶囊及水凝胶微观结构、流变性能及释放性能进行考察。所述纳米微胶囊及水凝胶微观结构如图3所示，纳米微胶囊呈现近球状，均匀分布于水凝胶基质中。
所述水凝胶流变性能及弹性模量测试结果如附图4所示，流变实验在流变仪(型号：MCR302,Anton Paar Co.Ltd,Austria)上进行。环境温度为25℃，平行板的间隙保持在1mm，恒定应变为1％。弹性模量实验先将复合水凝胶用2.5mL注射器制备水凝胶样品，得到直径为9mm，长度为6mm的圆柱形状。在Universal试验机(型号：BAB-10MT，MTS SystemsCo.Ltd，China)上设定0.1N的预载力，并且每个试验在5mm×min-1的压缩速度下进行。
从附图4中可以看出，实施例1中制备的水凝胶具有良好的硬度效果，强度范围在0.16-0.50MPa之间，适于成纤维细胞的生长。
所述纳米微胶囊中生长因子释放效果如附图5所示，从附图5中可以看出，纳米微胶囊中包载血管内皮生长因子及表皮生长因子时，相同粒径、不同生长因子的释放效果相当。主要影响释放速率的为纳米微胶囊的粒径，并且释放速率与粒径呈负相关。另外，不同类型、不同粒径的生长因子最终释放量均可以达到75％以上，释放较为彻底。
本实施例中，针对水凝胶对干细胞的培养进行了考察，结果如图6所示，可以看出，通过水凝胶培养的干细胞增殖效果显著超过对照组(采用培养液进行培养)的效果，证明该水凝胶有利于干细胞的生长，将其应用于医用敷料能够有效促进间充质干细胞的生长，增加旁泌因子的释放，辅助伤口愈合。
本实施例中，采用动物模型进行了腹腔开放创面实验，对照组采用聚丙烯补片对腹腔开放创面进行覆盖，实验组采用实施例1中制备的医用敷料进行覆盖。7天后对创面新生肉芽组织进行HE染色，结果附图7所示，图中箭头指示部分为新生肉芽组织，可以看出，采用医用水凝胶进行创面覆盖的肉芽组织厚度显著多于对照组，新生细胞形态饱满，且密度也高于对照组，证明实施例1中制备的医用水凝胶辅料能够有效促进腹腔创面中新生肉芽组织的形成。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。