一种重组抗菌肽Mytichitin-A的应用
阅读说明：本技术 一种重组抗菌肽Mytichitin-A的应用 (Application of recombinant antibacterial peptide Myticitin-A ) 是由 樊振川 孙雪晴 孟德梅 高晓芳 于 2019-12-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及一种重组Mytichitin-A抗菌肽(rMytichitin-A的应用。本发明使用的是由毕赤酵母GS115高效表达的rMytichitin-A抗菌肽,具有广谱抗菌活性。所得抗菌肽具有良好的温度稳定性,耐强酸和弱碱,相对的蛋白酶稳定性；对大菱鲆和SD大鼠的红细胞具有极低的溶血性。以上特点使得rMytichitin-A抗菌肽具备在食品、畜牧和医药等领域应用的潜力。同时rMytichitin-A抗菌肽还可以广泛应用于生鲜的防腐保鲜,抑制微生物的生长,降低营养物质的流失。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to recombinant Myticitin-A (application of the rMyticitin-A), wherein the rMyticitin-A is efficiently expressed by pichia pastoris GS115 and has broad-spectrum antibacterial activity.)
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组Mytichitin-A抗菌肽(rMytichitin-A)及其在保鲜防腐的应用。
背景技术：
抗菌肽(Antimicrobial peptides)，一类小分子多肽，是无脊椎和脊椎动物体内先天具有的免疫体系的重要成分。具有广谱抗菌活性和分子量小等特点，此外它还具有良好的稳定性，耐受酸碱和温度变化，不受多种蛋白酶影响，不易产生耐药性。抗菌肽结构稳定的同时，功能也是多样的。抗菌肽具有抗病毒、治疗艾滋病、抑制肿瘤细胞生长、促进伤口愈合和消炎杀菌等作用，还具有抗氧化活性，能够有效的清除氧自由基，具有很大的应用潜力。然而，自然提取成本高、产量低，不便于工业化生产。为满足工业化生产需要，我们尝试利用基因工程的方法将抗菌肽基因整合到毕赤酵母细胞内，诱导表达外源蛋白，降低生产成本。
天然抗菌肽Mytichitin-A是从厚壳贻贝的血清中分离鉴定得到的，由55个氨基酸组成，分子量为6.2KDa，能够抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌和真菌的生长。本实验室已发表文献表明，利用基因工程的方法，已成功将重组抗菌肽Mytichitin-A(rMytichitin-A)转入到毕赤酵母GS115，以甲醇为唯一碳源，可诱导表达抗菌肽，产量可达到45.5μg/mL，对多种病原菌均具有抑菌活性。巴斯德毕赤酵母表达体系具有四个特点：一、自身分泌的蛋白少，且表达的外源蛋白可直接分泌至发酵液中，便于直接提取。二、含有目前最强的启动子之一——醇氧化酶启动子(AOX1)，可受甲醇的严格诱导调控，从而高水平表达外源蛋白。三、多次传代后酵母仍能稳定表达外源蛋白，具有良好的遗传稳定性。四、培养基价格低廉，发酵工艺成熟，适用于工业化生产。
到目前为止，已有多种类型抗菌肽被应用于食品保鲜研究。因其高效的抗菌活性，能够有效的抑制微生物生长，降低蛋白质降解、脂质氧化，保持食品感官品质。抗菌肽可广泛应用于饮料、果蔬、奶制品、鲜肉及肉制品的保鲜。
本发明将毕赤酵母GS115产的重组抗菌肽Mytichitin-A应用于冷鲜猪肉的保鲜，可有效提高保质期。经检索本发明在国内外未见公开报道，在国内外未见公开使用。
发明内容
：本发明的目的在于提供一种重组抗菌肽Mytichitin-A在防腐保鲜中的应用，特别是冷鲜肉制品的防腐保鲜中的应用。
所述rMytichitin-A的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
更进一步地，所述的rMytichitin-A保鲜液为浓度5、15和25μg/mL的rMytichitin-A水溶液，比未经处理的冷鲜肉，可延长保质期1-2天。
具体制备方法如下：
1、rMytichitin-A抗菌肽的表达
将rMytichitin-A抗菌肽的表达菌株进行发酵培养，以甲醇为唯一碳源对其进行诱导表达，获得rMytichitin-A抗菌肽产品；
进一步地，所述发酵培养的方法为：采用1L三角瓶，挑取rMytichitin-A抗菌肽的表达菌株于150mL BMGY培养基中，28℃，220rpm摇床培养，待OD600达到6-8时，把BMGY培养基等体积更换为BMMY培养基，28℃，220rpm摇床培养，每24h补充经过滤除菌的100％甲醇，连续培养至144h；
更进一步地，每次甲醇补充量占发酵液的体积百分比为2％，诱导时间为144h，通过ELISA方法测定上清液中目的蛋白的含量达到133μg/mL；
2、rMytichitin-A抗菌肽产品特性如下：
(1)温度稳定性：rMytichitin-A抗菌肽分别经4℃、25℃、37℃、60℃、80℃、90℃条件下处理1h后用于MIC实验，rMytichitin-A浓度10μg/mL，对金黄色葡萄球菌抑制率无显著性差异，均大于90％。
(2)pH稳定性：rMytichitin-A抗菌肽分别经pH为2、4、6、8、10的缓冲溶液在37℃处理4h后进行MIC实验，rMytichitin-A浓度为10μg/mL，经pH为2，4，6和8的溶液处理后，对金黄色葡萄球菌的抑制率无显著性差异，均大于90％；经pH为10的溶液处理后，对金黄色葡萄球菌的抑制率为33％。
(3)蛋白酶稳定性：分别采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶各0.24U，37℃处理rMytichitin-A抗菌肽2h后用于MIC实验，rMytichitin-A浓度为10μg/mL，经胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶处理后对金黄色葡萄球菌的抑制率无显著性差异，均大于90％；蛋白酶K处理后的抑制率为60％。
综上，本发明中使用的抗菌肽rMytichitin-A具有良好的温度稳定性、相对蛋白酶稳定性，并且能够耐受强酸和弱碱。
(4)溶血性：分别将10μL不同浓度的rMytichitin-A抗菌肽同90μL浓度为4％的红细胞在37℃作用30min后离心测定上清的吸光度值。rMytichitin-A抗菌肽的浓度为10、20、30、40、50和60μg/mL。在60μg/mL浓度范围内，对于大菱鲆和SD大鼠的血红细胞都未出现溶血性。表明，本发明利用的rMytichitin-A抗菌肽具有较高的生物安全性。
(5)防腐保鲜效果：分别用5、15和25μg/mL的rMytichitin-A处理新鲜的猪肉，在4℃条件下贮藏7天，在此期间每24h检测猪肉的菌落总数及酸败程度，并进行感官评价。rMytichitin-A的浓度为25μg/mL时，防腐保鲜效果相对最佳，菌落总数最低，脂肪、蛋白质的氧化降解程度最小，能抑制营养成分的流失，维持良好的感官形态。
有益效果：
(1)本发明使用的rMytichitin-A抗菌肽具有良好的温度稳定性、相对蛋白酶稳定性，并且能够耐受强酸和弱碱，以及极低的细胞溶血性。因此，rMytichitin-A抗菌肽在食品、畜牧和临床医疗等领域具有较好的应用前景。
(2)本发明使用的毕赤酵母表达体系可高效表达外源蛋白，在发酵液上清中rMytichitin-A抗菌肽的含量高达133μg/mL，有利于抗菌肽未来的工业化生产。
(3)本发明中的贮藏保鲜实验数据表明，rMytichitin-A具有良好的防腐保鲜效果，在低温贮藏下，可广泛应用于鲜猪肉的防腐保鲜，抑制微生物的繁殖，降低营养物质的流失，维持猪肉良好的感官形态和营养品质。因此，rMytichitin-A具有成为一种新型天然食品防腐保鲜剂的巨大潜力。
附图说明：
图1为本发明技术路线；
图2为rMytichitin-A抗菌肽特性研究；
其中，A：rMytichitin-A温度稳定性研究；
B：rMytichitin-A pH稳定性研究；
C：rMytichitin-A蛋白酶稳定性研究；
图3为rMytichitin-A杀菌动力学研究；
图4为rMytichitin-A溶血性研究；
其中，A：rMytichitin-A对大菱鲆红细胞的溶血性研究，B：rMytichitin-A对SD大鼠红细胞的溶血性研究；P：以1％Triton X-100作为阳性对照；N：以PBS作为阴性对照；
图5为rMytichitin-A对猪肉防腐保鲜效果的理化指标测定；
其中，A为菌落总数；B为TBARS值；C为TVB-N值；D为汁液流失率；E为pH值；
具体实施方式
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下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1 rMytichitin-A抗菌肽的制备
挑取含有重组rMytichitin-A抗菌肽基因的毕赤酵母单菌落于1L BMGY培养基(2％蛋白胨，1％酵母提取物，10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％YNB，0.004％生物素，1％甘油)中，28℃、220r/min培养。OD600达到6-8后，将BMGY培养基等量更换为BMMY培养基(2％蛋白胨，1％酵母提取物，10mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％YNB，0.004％生物素，2％甲醇)，28℃、220r/min继续培养。每隔24h添加经过滤除菌的100％甲醇至终浓度为2％(体积百分比)，连续培养至144h得到rMytichitin-A抗菌肽。
ELISA法测定目的蛋白含量——取上述发酵液上清用包被液(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，pH 9.6)稀释5倍，取200μL加入96孔板中，4℃过夜包被，PBST溶液清洗3次。用5％PBST-牛奶溶液37℃孵育1h封闭特异性结合位点，PBST溶液清洗3次。一抗使用his-tag，稀释1000倍，每孔加入100μL，37℃孵育1.5h，用PBST溶液清洗3次。二抗使用HRP-Goat-anti-mouse，稀释5000倍，每孔加入100μL，37℃孵育1.5h，用PBST溶液清洗3次。每孔加入150μLTMB显色液，室温避光显色30min，加入50μL终止液(0.5M H2SO4)终止反应，使用酶标仪测定OD450值，代入标曲公式，计算目的蛋白浓度值，在诱导时间为144h，甲醇浓度为2％时，表达量为133μg/mL。
实施例2 rMytichitin-A抗菌肽性能测定
稳定性研究——如未特别说明，以下rMytichitin-A溶液的浓度均为10μg/mL，受试菌为金黄色葡萄球菌。
温度处理：抗菌肽rMytichitin-A溶液分别在4℃、25℃、37℃、60℃、80℃、90℃条件下处理1h后做MIC实验。结果表明，经不同温度处理的抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑制率无显著性差异，均大于90％。
pH处理：用pH分别为2、4、6、8、10的不同缓冲液溶解rMytichitin-A抗菌肽至相同浓度，4h后做MIC实验。结果表明，经pH为2，4，6和8的溶液处理后，对金黄色葡萄球菌的抑制率无显著性差异，均大于90％；经pH为10的溶液处理后，对金黄色葡萄球菌的抑制率为33％。
蛋白酶处理：抗菌肽rMytichitin-A溶液分别加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶37℃处理抗菌肽样品2h后做MIC实验。经胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶处理后对金黄色葡萄球菌的抑制率无显著性差异，均大于90％；蛋白酶K处理后的抑制率为60％。
杀菌动力学——将金黄色葡萄球菌培养至对数期，将金黄色葡萄球菌与抗菌肽rMytichitin-A(浓度为4×MIC)按1∶1(v∶v)的比例混合，37℃培养箱培养3h。在0min及每隔20min收集样品，梯度稀释，均匀涂布于LB平板上，37℃培养箱培养12h后计数可见的菌落。无菌水和浓度为50μg/mL的庆大霉素分别为阴性对照和阳性对照。如图3所示，结果表明，rMytichitin-A不仅具有一定的杀菌能力，在100min内能够杀死全部的金黄色葡萄球菌。
溶血性——分别将10μL不同浓度的抗菌肽rMytichitin-A溶液同90μL体积比为4％的红细胞在37℃作用30min后检测上清在540nm处的吸光度值。抗菌肽rMytichitin-A溶液的浓度分别为：10、20、30、40、50、60μg/mL。阴性对照，即PBS的溶血性为0％，阳性对照，即1％Triton X-100的溶血性为100％。结果表明，如图4所示抗菌肽rMytichitin-A对大菱鲆和SD大鼠的红细胞在60μg/mL浓度范围内不具有溶血性。如图4所示，结果表明，经本发明使用的抗菌肽rMytichitin-A在远大于MIC浓度时不具有溶血性。
实施例3保鲜实验
样品处理——rMytichitin-A抗菌肽浓度分别为5、15、25μg/mL，取100mL抗菌肽溶液过0.22μm水膜置于灭菌的烧杯中，阳性对照为300μg/mL的Nisin溶液，阴性对照为无菌水。将新鲜的精后腿猪肉切割成5g的方正肉块，置于上述溶液中浸泡5min，晾干5min。将肉分装到盘中，用保鲜膜密封并扎孔，置于于4℃冰箱中冷藏，每隔24小时进行感官评价，并取样检测菌落总数、pH、TVBN以及TBARS等指标的变化。
感官评价——根据GB 2707-2016《食品安全国家标准鲜(冻)畜、禽产品》中对感官要求的规定，将样品放置于白色底盘中，感官评价员在自然光下按下表对样品进行评分，满分10分。
表1感官评价表
菌落总数——按照现行国标GB 4789.2-2010《食品微生物学检验菌落总数测定》方法操作。每隔24h取样，每个处理组取3g肉样于50mL无菌离心管中，加入27mL生理盐水均质，分别取1mL均质液进行梯度稀释，选择2～3个稀释度涂板。37℃培养44h后统计菌落总数。用对数形式表示，1g cfu/g。
挥发性盐基氮(TVB-N)——按照现行国标GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》方法操作。
准确称量5组处理组不同储藏时间肉样1g于50mL无菌离心管中，加入10mL生理盐水均质30min，过滤后备用。使用仪器时，先测定4个空白管稳定仪器，再测定空白样品(含10mL生理盐水和5mL氧化镁悬浊液)，最后将滤液倒入消化管中，再加入5mL MgO悬浊液，测定TVB-N值。
硫代巴比妥酸——每24h取样，每组取2g于50mL无菌离心管中，10mL7.5％的三氯醋酸，均质后振摇30min，过滤备用。5mL滤液和5mL 0.02mM的2-硫代巴比妥酸溶液充分混匀，100℃浴60min，室温冷却60min。1600rpm离心5min，取5mL上清液与5mL氯仿充分混匀，静置分层，取上清。用酶标仪分别在532nm和600nm处测定吸光值，按照以下公式计算TBARS值(每100g肉中丙二醛的含量)
TBARS值(mg/100g)＝(A532-A600)/155/10×72.6×100 (式-1)
汁液流失率(Drip Loss)——每天定时固定选取样品，在称重之前，先用灭菌后的吸水纸吸除表面水分，然后放于千分之一天平上，称量样品质量，精确至小数点后三位，按以下公式进行计算。
汁液流失率(％)＝(初始质量-取样时质量)/初始质量×100％ (式-2)
pH——按照GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》中的方法，作适当调整，检测不同贮藏时间下的肉样pH值。在室温约25℃的环境下，分别用pH为4.01和7.00的标准缓冲液校正pH计，然后将pH计探头放入均质液中，待数值稳定后，直接读数。
由表2可以看出，水处理组贮藏至第4天时，感官评分低于6分，猪肉样品表面有黏腻感，气味发酸，发生轻微变质；而300μg/mL Nisin处理组和5、15、25μg/mL rMytichitin-A处理组样品状态保持良好，评分高于6分。图5为在贮藏期间内五种理化指标的变化情况，从图中可以看出，rMytichitin-A抗菌肽具有较好的防腐保鲜效果，并且随着抗菌肽浓度的增加，防腐能力增强。
表2不同浓度的rMytichitin-A处理下鲜肉感官评分结果
注：同行间不同字母表示差异显著(p＜0.05)，相同字母表示差异不显著(p＞0.05)
本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本发明的实施例进行改变。上述实施例只是实例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。