一种熵驱动的dna纳米回路及其应用

文档序号：1323083 发布日期：2020-07-14 浏览：9次 >En<

阅读说明：本技术 一种熵驱动的dna纳米回路及其应用 (Entropy-driven DNA nano loop and application thereof ) 是由赵永席陈锋白敏� 于 2020-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种熵驱动的DNA纳米回路及其应用,属于活细胞成像技术领域,利用熵驱动的DNA纳米回路,通过链置换反应和目标物循环反应实现对信号放大,最终实现活细胞内RNA和酶催化联合成像分析。(The invention discloses an entropy-driven DNA nano loop and application thereof, belonging to the technical field of living cell imaging.)

一种熵驱动的DNA纳米回路及其应用

技术领域

本发明属于活细胞成像技术领域，具体涉及一种熵驱动的DNA纳米回路及其应用。

背景技术

基因表达和酶催化在不同的细胞状态和细胞类型是动态变化的，且基因的变化与人类疾病密切相关。例如，在癌组织和正常组织中，非编码miRNA的表达和端粒酶活性均存在差异。因此，监测这种动态变化可以确定细胞的状态或类型，应用于生物研究和临床应用。但是，包括逆转录PCR和测序在内的常规多重RNA检测方法不适用于酶活性分析，并且它们不能观测活细胞中RNA和酶催化的动态变化，时空信息也会被忽略。此外，如何将这些多基因表达和酶催化的特征转化为细胞类型分类和进行癌症评估鲜有报道。因此，开发有效的检测细胞内多种RNA和酶催化的方法成为迫切需要。

新兴的DNA纳米技术由于其可被编程及组装在细胞成像分析中起着重要作用。目前有相关研究通过构建DNA纳米结构来观察活细胞中的分子成像。例如，通过FRET技术建立了DNA四面体纳米杂交器，以准确地成像活细胞中的肿瘤相关mRNA；基于分子信标探针和生物功能化的金纳米颗粒也被设计用于细胞内端粒酶的分析；此外，各种DNA纳米器件和信号放大电路也显著提高活细胞中的检测灵敏度，它们避免了多步扩散和组装程序，并在分子拥挤的细胞环境中实现了快速和均匀的信号放大。

然而，由于这些DNA纳米结构设计的复杂性，难以用其对活细胞中的基因差异表达及酶活性变化进行分析。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种熵驱动DNA纳米回路及其应用，该多价DNA纳米回路结构设计简单，能够实现细胞内RNA和酶催化联合成像分析。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种熵驱动的DNA纳米回路，包括以下三种回路中的一种：

一价DNA纳米回路，包括一种荧光输出信号，以及作为输入分子的端粒酶和miRNA21；

二价DNA纳米回路，包括一种或两种荧光输出信号，以及作为输入分子的端粒酶和miRNA 21；

三价DNA纳米回路，包括三种荧光输出信号，以及作为输入分子的端粒酶、miRNA21和miRNA 31。

优选地，所述一价DNA纳米回路，包括OR逻辑门和AND逻辑门：

对于OR逻辑门，以端粒酶和miRNA 21为输入分子，当存在一种或两种目标物时，该一价DNA纳米回路输出一种荧光信号，该荧光信号为荧光分子FAM的荧光；

对于AND逻辑门，以端粒酶和miRNA 21为输入分子，仅当两种目标物同时存在时，该一价DNA纳米回路输出一种荧光信号，该荧光信号为荧光分子TAMRA的荧光。

优选地，所述二价DNA纳米回路，包括OR逻辑门和AND逻辑门：

对于OR逻辑门，以端粒酶和miRNA 21为输入分子，端粒酶触发荧光分子FAM信号的释放，miRNA 21触发荧光分子TAMRA信号的释放；

对于AND逻辑门，以端粒酶和miRNA 21为输入分子，该二价DNA纳米回路输出一种荧光信号，该信号为荧光分子TAMRA的荧光。

优选地，所述三价DNA纳米回路能够输出三种荧光信号，以端粒酶、miRNA21和miRNA 31为输入分子，端粒酶触发荧光分子FAM信号的释放，miRNA 21触发荧光分子TAMRA信号的释放，miRNA 31触发荧光分子Cy5信号的释放。

本发明还公开了上述的熵驱动的DNA纳米回路在活细胞RNA和酶联催化联合分析中的应用，利用熵驱动的DNA纳米回路，通过链置换反应和目标物循环反应实现对信号放大，最终实现活细胞内RNA和酶催化联合成像分析。

具体地，包括以下操作：

1)制备多价DNA纳米底物(SPs)；

2)将多价DNA纳米底物(SPs)，放大探针(AMPs)及端粒酶识别引物(TRprimer)通过脂质体转染进入活细胞；

3)转染4小时后，用1X PBS清洗细胞三次；

4)通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察。

所述的熵驱动的DNA纳米回路的触发过程为：

在10μL的TEMg反应缓冲液(10mM Tris-HCl，2mM EDTA，1mM Mg²⁺，pH＝8.0)中，加入0.4mM多价DNA纳米底物及0.5mM的放大探针，以及不同浓度的目标探针，在37℃孵育60min，通过LightCycler 96仪器实时监测信号放大过程。

将熵驱动的多价DNA纳米回路体系混合溶液导入活细胞的过程为：以每孔50000个细胞的密度将细胞种于八孔板中，于37℃培养箱中过夜生长，通过Lipofectamine 3000将100nM多价DNA纳米底物(SPs)，125nM放大探针(AMPs)及100nM端粒酶识别引物(TR primer)转染到活细胞中，在37℃下培养4h。用1X PBS清洗细胞三次，通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察。

本发明还公开了上述的熵驱动的DNA纳米回路结合微流控系统用于鉴定混合培养的细胞样本中细胞类型的应用。

本发明还公开了上述的熵驱动的DNA纳米回路结合微流控系统用于分析抗癌药物性能的应用

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明公开的熵驱动的多价DNA回路，设计简单，可操作性强，设计的多价回路通过简单的链置换，在短时间内可实现多种目标物的同时检测；三价、二价回路都是以一价回路的核酸单元为基础进行价态累加的，在检测信号足够的情况下，通过本发明很容易设计出N价回路。

2)本发明通过简单的链置换反应和目标物循环反应实现对信号的显著放大，最终实现活细胞内RNA和酶催化联合成像分析。

3)将该熵驱动的多价DNA纳米回路在微型微流控系统上实施时，可通过熵驱动的多价DNA回路实现三种混合培养的乳腺细胞(MCF-10A，MCF-7，MDA-MB-231)的100％区分。

4)将该熵驱动的多价DNA纳米回路在微型微流控系统上实施时，可通过熵驱动的多价DNA回路实现乳腺癌药物的性能分析。他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)是一种雌激素受体(estrogen receptor，ER)的拮抗剂，通过本发明的方法，发现其与三阴性MDA-MB-231共培养时，ER阳性的MCF-7可以抵抗TAM。这表明在复杂的肿瘤微环境中，三阴性和转移性细胞可能干扰了TAM对ER阳性细胞生长的抑制作用。

5)用熵驱动的多价DNA纳米回路对细胞中RNA和酶催化进行联合分析不仅能准确地鉴定细胞类型，而且还可为疾病诊断和治疗的其他测量方法提供依据。

附图说明

图1为制备DNA纳米回路的原理图；

图2为冷冻电子显微镜下观察到的多价DNA纳米回路；

图3为不同价态DNA纳米结构组装的凝胶电泳分析；

图4为多价DNA纳米回路系统鉴别乳腺癌转移能力的示意图；

图5为三种不同乳腺细胞系在不同通道下的代表性荧光显微镜图像；

图6为多微室芯片中具有代表性的微室的荧光显微镜图像。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

实施例1：结合图1～3，制备熵驱动的DNA纳米回路，通过LightCycler 96仪器实时监测信号放大过程。

图1中包含了一价、二价、三价DNA纳米回路。分别输入端粒酶、miRNA 21和miRNA31，通过链置换反应和目标物循环反应，实现目标信号的显著放大，以三种输出荧光信号(FAM、TAMRA、Cy5)进行检测。

图2显示完全组装的三价DNA纳米结构形态呈现明显的“T”形或“Y”形结构，其尺寸大概在20纳米左右，与预期设计相符，由右侧的放大图可看出，由于核酸是软材料，具有很强的弯曲性，因此呈现出不同角度的T型。；

图3为不同价态DNA纳米结构组装的凝胶电泳分析，从左到右依次为一价DNA纳米纳米底物，二价DNA纳米纳米底物、缺少P2-R31链的三价DNA纳米底物、三价DNA纳米底物以及50bp DNA Ladder；

一价回路、二价回路及三价回路涉及的序列如下表1所示：

表1

实施例2：结合图4～6，利用熵驱动的多价DNA纳米回路进行不同细胞类型的活细胞内RNA和酶催化联合分析。

首先，制备多价DNA纳米底物(SPs)，将2μM启动探针(Bott module)，1.6μM P21探针(P21 module)，1.6μM端粒酶探针(Ptelo module)和P31探针(P31 module)于95℃反应10min，置于45℃杂交3h，制备好的SPs置于-20℃保存待用。

选用人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、人乳腺癌细胞MCF-7以及人乳腺癌细胞MDA-MB-231三种不同细胞系进行以下操作过程。以每孔50000个细胞的密度将细胞种于八孔板中，于37℃培养箱中过夜生长。通过Lipofectamine 3000将100nM多价DNA纳米底物(SPs)，125nM放大探针(AMPs)及100nM端粒酶识别引物(TR primer)转染到活细胞中，在37℃下培养4h。用1X PBS清洗细胞三次，通过激光共聚焦荧光显微镜进行观察。

结果参见图4，根据实验设计，结合三种目标物的表达量，鉴别三种人乳腺细胞，其中，Telomerase及miRNA 21无信号，但miRNA 31高信号的细胞为人正常乳腺上皮细胞MCF-10A；Telomerase及miRNA 21高信号，miRNA 31有信号的细胞为人乳腺癌细胞MCF-7；Telomerase及miRNA 21高信号，miRNA 31无信号的细胞为人乳腺癌细胞MDA-MB-231。

结果参见图5，检测到人正常乳腺上皮细胞MCF-10A高表达miRNA 31，Telomerase及miRNA 21的荧光信号几乎检测不到；人乳腺癌细胞MDA-MB-231中Telomerase和miRNA 21高表达，miRNA 31的荧光信号几乎检测不到；人乳腺癌细胞MCF-7中Telomerase、miRNA 21和miRNA 31的荧光信号都能被检测到；

结果参见图6，人乳腺癌细胞MDA-MB-231产生FAM信号(对应Telomerase)及TAMRA信号(对应miRNA 21)；人乳腺癌细胞MCF-7产生FAM信号(对应Telomerase)、TAMRA信号(对应miRNA 21)及Cy5信号(对应miRNA 31)；人正常乳腺上皮细胞MCF-10A仅产生Cy5信号(对应miRNA 31)；

将MDA-MB-231、MCF-7及MCF-10A分别以1：0：0，0：1：0，0：0：1和1：1：1的比例共培养，接种于微型微流控芯片上的不同微室内。只接种MDA-MB-231细胞的微室，产生FAM信号(对应Telomerase)及TAMRA信号(对应miRNA 21)；只接种MCF-7细胞的微室，产生FAM信号(对应Telomerase)、TAMRA信号(对应miRNA 21)及Cy5信号(对应miRNA 31)；只接种MCF-10A细胞的微室，产生仅产生Cy5信号(对应miRNA 31)；MDA-MB-231、MCF-7及MCF-10A以1：1：1接种的微室，结果如图6所示，在显微镜下观察到，不同的细胞内表达不同的信号，可根据细胞表达的信号来判断细胞类型。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 一种熵驱动的DNA纳米回路及其应用

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA