促进神经再生的活性多肽在材料表面共价接枝的方法及其应用
阅读说明：本技术 促进神经再生的活性多肽在材料表面共价接枝的方法及其应用 (Method for covalently grafting active polypeptide for promoting nerve regeneration on material surface and application thereof ) 是由 张鲁中 杨宇民 李贵才 于 2020-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进神经再生的活性多肽及其在材料表面共价接枝的方法,将生物相容性的天然多糖或蛋白质溶解,冷冻干燥,经酸碱或乙醇变性处理得到天然生物材料支架,天然生物材料支架的羟基与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷发生反应得到甲基丙烯酰基改性的生物材料；促进神经再生的多肽CRSYIG,CRSYIG-Biotin,CGQRKDP,CGQRKDP-Biotin,CFKIDKK,CFKIDKK-Biotin等通过硫醇-烯反应接枝到甲基丙烯酰基改性的生物材料。本发明的生物活性研究表明,多肽改性后的生物材料能够协同促进神经再生。(The invention discloses an active polypeptide for promoting nerve regeneration and a covalent grafting method on the surface of a material, which is characterized in that biocompatible natural polysaccharide or protein is dissolved, freeze-dried and subjected to acid-base or ethanol denaturation treatment to obtain a natural biomaterial scaffold, and hydroxyl of the natural biomaterial scaffold reacts with 3- (methacryloyloxy) propyl trimethoxy silane to obtain a methacryloyl modified biomaterial; the polypeptides CRSYIG, CRSYIG-Biotin, CGQRKDP, CGQRKDP-Biotin, CFKIDKK, CFKIDKK-Biotin and the like for promoting nerve regeneration are grafted to the methacryloyl modified biological material through thiol-ene reaction. The biological activity research of the invention shows that the biological material modified by the polypeptide can synergistically promote nerve regeneration.)
技术领域
本发明具体涉及一种促进神经再生的活性多肽在材料表面共价接枝的方法及其应用。
背景技术
生物材料改性是不改变材料本体性能的前提下，赋予其新的功能，在生物医用材料领域具有广泛的应用前景。生物材料化学改性方法最常见的物理吸附法，共价接枝法等方法。物理吸附主要由材料表面的性质所决定，例如带有正电荷的材料表面，可以吸附带有负电荷的大分子，生物活性多肽及蛋白；利用生物素和链酶亲和素的特异性结合，可以使带有生物素的材料吸附链酶亲和素，实现特异性吸附。虽然物理吸附法操作简便，但是物理吸附法吸附的生物活性分子易于离去，或与其他的蛋白质发生互换，使修饰后的材料表面失去其应有的功能。共价接枝法是使材料通过共价键的形式结合生物活性物质，生物活性物质的一端连接到材料上，相对于物理吸附，通过共价接枝的生物活性分子表现出与可溶解蛋白相同甚至更高的活力。例如硅烷化是一种有效的实现共价接枝的壳聚糖的方法。
近年来，正交反应是一类可在温和条件下进行的化学反应，甚至可以在细胞或动物体内的生理条件下进行的化学反应。这些反应能够在复杂的生理条件下具有特异的选择性，反应过程不会收到复杂的生理条件的影响且无副作用产生。由于正交反应具有简单，高效，高特异性的优点，因此正交反应被认为最有效率的表面修饰的方法。硫醇-烯反应不受水和氧气的影响，定量生成目标产物，此外由于其无需重金属催化剂造成的污染，使其更受重视。通过硫醇-烯的正交化学反应，可以更加便捷的评价生物大分子，多肽或蛋白质的生物活性，在培养细胞条件下实现生物活性物质的特异性标记。
发明内容
发明目的：针对现有缺乏促进神经再生的有效生物活性分子，本发明的目的在于开发新型的促进神经再生的多肽及其共价接枝到改性生物材料表面的方法用于生物材料表面修饰。
技术方案：一种促进神经再生的活性多肽在材料表面共价接枝的方法，为促进神经再生的多肽共价接枝到生物材料表面的体系，包括改性天然生物材料支架，促进神经再生多肽及多肽共价连接到生物材料支架，所述方法为通过硫醇-烯反应的多肽多肽接枝方法，具体操作如下：
步骤一、天然生物材料支架的制备：将生物相容性的天然多糖或蛋白质溶解，冷冻干燥，经酸碱或乙醇变性处理得到天然生物材料支架；
步骤二、甲基丙烯酰基改性的生物材料的制备：天然生物材料支架的羟基与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷发生反应得到甲基丙烯酰基改性的生物材料；
步骤三、生物活性多肽的合成：首先通过计算机模拟筛选出一系列多肽，多肽的合成按照多肽固相合成的方法制备：以2-氯三苯甲基氯树脂和Fmoc保护的氨基酸为起始原料，使用HBTU进行氨基酸之间酰胺键的缩合，最后经三氟乙酸从树脂上切下多肽并除去保护基，经高效液相色谱纯化得到这些生物活性多肽；
步骤四、多肽改性的生物材料的制备：将含生物活性多肽的水溶液加入甲基丙烯酰基改性的生物材料的溶液中，多肽中的巯基就会与生物材料表面的甲基丙烯酰基发生硫醇-烯反应，得到定量高效制备的多肽改性的生物材料。
作为优化：所述的天然多糖是壳聚糖或海藻酸；所述的蛋白质是丝素蛋白或胶原；所述的酸碱或有机醇是盐酸，硫酸，氢氧化钠，氢氧化钾或乙醇。
作为优化：所述的壳聚糖溶解在乙酸的水溶液中，冷冻干燥，经氢氧化钠或氢氧化钾处理，与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷反应得到甲基丙烯酰基改性的壳聚糖。
作为优化：所述的海藻酸溶解在氢氧化钠的水溶液中，冷冻干燥，经盐酸或硫酸处理，与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷反应得到甲基丙烯酰基改性的海藻酸。
作为优化：所述的胶原溶解在乙酸的水溶液中，冷冻干燥，经弱碳酸氢钠水溶液中和，与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷反应得到甲基丙烯酰基改性的胶原。
作为优化：所述的丝素蛋白溶解在溴化锂或氯化钙/乙醇的水溶液中，冷冻干燥，经弱碳酸氢钠水溶液中和，与3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷反应得到甲基丙烯酰基改性的丝素蛋白。
作为优化：所述的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的浓度为0.001％-50％甲醇或乙醇溶液中的一种或两种。所述的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷改性是甲氧基硅烷与多糖或蛋白上的羟基发生反应。
作为优化：所述的生物活性多肽是具有促进神经再生的多肽CRSYIG，CRSYIG-Biotin，CGQRKDP，CGQRKDP-Biotin，CFKIDKK，CFKIDKK-Biotin中的一种或多种。这些多肽具有促进神经再生的功能，经过与雪旺细胞和背根神经元细胞共培养，发现其能够促进雪旺细胞的增殖，迁移和延长神经元细胞的存活时间。含有Biotin的多肽能够显著增加。
作为优化：所述的多肽的水溶液可以是水溶液、磷酸盐缓冲溶液、细胞培养液或生理盐水中的一种或多种。
一种根据所述的促进神经再生的活性多肽在材料表面共价接枝的方法的应用，本发明制备的多肽修饰的方法可以用于心脑血管，骨组织工程，神经组织工程以及皮肤组织工程的领域。
有益效果：本发明的具体优势如下：
(1)本发明通过3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷与生物材料上的羟基发生反应，得到丙烯酰基改性的生物材料。通过硫醇-烯反应可以高效、简便实现生物材料的表面改性。
(2)本发明中的生物活性多肽CRSYIG，CGQRKDP和CFKIDKK能够促进雪旺细胞增殖，迁移以及延长神经元的存活时间，促进神经营养因子的分泌。更重要的是，相比Biotin组，多肽组和Biotin/多肽混合组，偶联有Biotin的多肽更有利于雪旺细胞的增殖和神经元的存活，Biotin和多肽具有协同作用。相比多肽溶液体系，多肽表面修饰的生物材料协同促进神经再生的效果更明显。
相比Biotin组，多肽组和Biotin/多肽混合组，共价连接的Biotin-多肽能够大幅度提升多肽促进雪旺细胞的增殖和延长神经元的存活时间，是由于Biotin的细胞表面受体依赖性复合维生素转运体和YIGSR细胞表面受体层粘连蛋白受体的双重作用的结果。
本发明制备的多肽表面修饰方法简便，制备效率高。相比溶液中的Biotin-多肽，表面修饰有Biotin-多肽的生物材料更有利于雪旺细胞的增殖和神经元的存活。
附图说明
图1为本发明的3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷改性壳聚糖的红外光谱图；(a),壳聚糖,2％(b),5％(c),10％(d),20％(e)甲基丙烯酰改性的壳聚糖；
图2为本发明的2％,5％,10％,20％甲基丙烯酰改性的壳聚糖的双键含量；
图3为本发明的2％,5％,10％,20％甲基丙烯酰改性的壳聚糖的氨基含量；
图4为本发明的壳聚糖,2％,5％,10％,20％甲基丙烯酰改性的壳聚糖表面和横截面扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但是这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例13-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷改性的壳聚糖支架的制备
2％的壳聚糖溶解在2％的乙酸的水溶液中，取1mL壳聚糖溶液冷冻干燥，使用2mol/L氢氧化钠浸泡0.5-4小时，经过双蒸水洗涤，将样品冷冻干燥得到生物材料壳聚糖支架。3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(浓度0.01-20％)溶解在乙醇的溶液中，将壳聚糖支架浸泡在上述乙醇溶液中，干燥得到3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷改性的壳聚糖。壳聚糖的氨基通过茚三酮法标准曲线的方法测定，发现壳聚糖表面的氨基随着3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷改性而减少，可能是由于壳聚糖表面的氨基与部分的丙烯酰基发生反应。3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的含量通过Wijs'试剂的方法测定其含量。
实施例23-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷改性的海藻酸支架的制备
2％的海藻酸溶解在0.5％的氢氧化钠的水溶液中，取1mL壳聚糖溶液冷冻干燥，使用0.5mol/L盐酸浸泡0.5-4小时，经过双蒸水洗涤，将样品冷冻干燥得到生物材料海藻酸支架。3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(浓度0.01-20％)溶解在乙醇的溶液中，将海藻酸支架浸泡在上述乙醇溶液中，干燥得到3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷改性的海藻酸。
实施例3促进神经再生多肽的合成
首先通过计算机模拟筛选出一系列多肽，多肽的合成按照多肽固相合成的方法制备：以2-氯三苯甲基氯树脂和Fmoc保护的氨基酸为起始原料，使用HBTU进行氨基酸之间酰胺键的缩合，最后经三氟乙酸从树脂上切下多肽并除去保护基，经高效液相色谱纯化得到这些多肽。将这些多肽与雪旺细胞共培养之后，经过细胞生物活性实验，细胞增殖实验及细胞迁移实验筛选出具有较好生物活性的多肽序列：CRSYIG，CRSYIG-Biotin，CGQRKDP，CGQRKDP-Biotin，CFKIDKK，CFKIDKK-Biotin和对照组C-Biotin。
实施例4促进神经再生多肽通过正交反应接枝到壳聚糖表面
将多肽溶解在水溶液中，加入到甲基丙烯酰改性的壳聚糖的溶液中发生硫醇-烯反应得到多肽共价接枝的壳聚糖支架材料。甲基丙烯酰氧改性的壳聚糖的氨基通过异硫氰酸荧光素标记为绿色，甲基丙烯酰通过巯基-PEG-罗丹明标记为红色，通过激光共聚焦观察其在材料上的分布。
如图1-4所示，设置空白组、壳聚糖组、甲基丙烯酰改性的壳聚糖组、C-biotin接枝壳聚糖组、CGQRKDP接枝壳聚糖组、CBiotin/CGQRKDP接枝壳聚糖组、CGQRKDP-Biotin接枝壳聚糖组评价雪旺细胞在生物材料表面的生物学行为。相较其他组来说，接枝CGQRKDP-Biotin具有更有效促进雪旺细胞增殖、迁移能力，说明其具有协同促进神经再生的能力。通过细胞粘附试剂盒cytoselectECM进行FITC绿色荧光Laminin染色，CollagenI染色，材料表面通过Avadin-罗丹明红色染色，确定材料表面红色荧光和绿色荧光的共定位情况。通过染色层粘连蛋白受体和整合素受体与YIGSR的结合情况，表明CGQRKDP通过与整合素受体α5结合。