一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法
阅读说明：本技术 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法 (Method for detecting enrofloxacin by using fluorescent dipeptide nano microspheres/nucleic acid aptamer ) 是由 汤轶伟 闫蓉芳 温振华 王向红 张福源 刘卫华 张雪梅 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法,该方法具体步骤如下：(1)制备二肽荧光纳米微球；(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物；(3)制备磁性Fe-(3)O-(4)微球；(4)合成磁性Fe-(3)O-(4)偶联恩诺沙星适配体偶联物；(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe-(3)O-(4)-Apt混合；(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe-(3)O-(4)-Apt混合,测定上清液荧光强度,对照标准曲线,计算样品中恩诺沙星含量。本发明用于检测方法的二肽荧光纳米微球制备方法简单、环境友好、荧光信号稳定；检测方法灵敏度高、抗干扰能力强、应用前景巨大。(The invention relates to a method for detecting enrofloxacin by using fluorescent dipeptide nano microspheres/aptamer, which comprises the following steps: (1) preparing dipeptide fluorescent nano microspheres; (2) synthesizing a dipeptide fluorescent nano microsphere enrofloxacin aptamer complementary strand conjugate; (3) preparation of magnetic Fe 3 O 4 Microspheres; (4) synthesis of magnetic Fe 3 O 4 Coupling an enrofloxacin aptamer conjugate; (5) the sample to be detected and the Fe synthesized in the step (4) 3 O 4 -Apt mixing; (6) mixing the DNPs-cDNA synthesized in step (2) with Fe synthesized in step (5) 3 O 4 -Apt mixing, measuring the fluorescence intensity of the supernatant, comparing with a standard curve, calculating the Ennoxate in the sampleStar content. The dipeptide fluorescent nano-microsphere used for the detection method has the advantages of simple preparation method, environmental friendliness and stable fluorescent signal; the detection method has high sensitivity, strong anti-interference capability and huge application prospect.)
技术领域
本发明属于生物、材料、生物检测等交叉领域，主要涉及二肽荧光纳米微球制备技术，特别涉及一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法。
背景技术
自组装肽荧光纳米材料因其组装过程可控，生物相容性良好、化学可修饰性强、稳定性强、环境友好等优点成为目前检测方法中最具潜力的荧光标记材料。目前，肽荧光纳米材料主要基于具有荧光特性的氨基酸组成的寡肽制备而成。与传统的有机染料和量子点荧光标记材料相比，上转换发光材料以其荧光效率高、稳定性好、分辨率高、灵敏度高、毒性小、机体损伤小等特点，是理想的荧光探针标记物。
核酸适配体是一类人工合成配体，是利用体外筛选技术筛选出的单链DNA或RNA片段，对多数的靶物都具有较强的亲和力。与传统抗体相比，核酸适配体在纳摩尔到微摩尔浓度下对物质具有相似的亲和力，具有目标多样性，稳定性高，成本低等特点，是荧光传感器中潜力巨大的特异性新型分子识别元件。
磁性纳米颗粒拥有优异的磁分离性能，已广泛应用于生物大分子的分离与纯化，利用磁性微球的磁分离特点结合核酸适配体的特异性识别功能，开发新型荧光检测方法，可大大简化检测步骤，缩短检测时间。
第三代氟喹诺酮类抗生素恩诺沙星(ENR)抗菌广谱、高效，广泛应用于畜禽、水产等养殖过程中的疾病预防和治疗。然而，不规范或违法使用ENR造成的动物源食品药物残留极大损害了人体健康，还对环境造成了污染，提高了细菌的耐药性。因此，建立一种简单、灵敏、抗干扰的荧光检测方法具有重要意义。
发明内容
发明目的：
本发明提出一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法，旨在利用小分子生物配体二肽制备荧光纳米微球作为荧光信号元件，利用特异性核酸适配体为分子识别元件建立一种检测恩诺沙星的方法，该方法过程简单，抗干扰能力强，具有很好的应用前景。
技术方案：
一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法，其步骤如下：(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球：
将色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与氯化锌水溶液混合，混合均匀后加入水热反应釜内在70-80℃加热反应55-65min，反应结束后在70-80℃温度下干燥获得DNPs，干燥后的DNPs复溶于水中，DNPs浓度为0.1mg/mL，用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联，色氨酸-苯丙氨酸二肽与氯化锌的质量比为1：1.5-2.0；溶剂异丙醇与溶剂水的体积比为9：1；
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物：
向步骤(1)合成的DNPs溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶液和cDNA，振荡条件下反应10～12h，反应结束后透析24-26h得到DNPs-cDNA；所述的DNPs、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的体积质量比为0.8-1.2mL：4mg：4mg；DNPs和cDNA的体积质量摩尔比为0.8-1.2mL：0.001μmol；
(3)制备磁性Fe3O4微球；
将1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠混合，加入一定体积的乙二醇，搅拌至固体全部溶解，将制得的溶液置于水热反应釜中于加热反应6-8h，反应完成后，自然冷却至室温，取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗后于60℃下真空干燥10-12h制得磁性Fe3O4微球；六水合三氯化铁和乙二醇的质量体积比为1g：30-40mL；
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物；
将步骤(3)制备的Fe3O4分散于磷酸盐缓冲液中，Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg：1mL；超声分散均匀后加入戊二醛反应2-4h，Fe3O4与戊二醛(25％)的质量体积比为10mg：1.25mL，磷酸盐缓冲液清洗3-6次除去戊二醛，再次分散于磷酸盐缓冲液，Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg：1mL，加入恩诺沙星核酸适配体反应12-16h，Fe3O4与恩诺沙星核酸适配体的质量摩尔比为10mg：0.00015μmol，除去未反应的恩诺沙星核酸适配体后用牛血清白蛋白封闭1h，磷酸盐缓冲液清洗3次去除未吸附的牛血清白蛋白后得到Fe3O4-Apt；
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合；
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合，37℃孵育15-20min，磁铁辅助分离去除上清液，用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次；
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合；
向步骤(5)用PBS清洗后的Fe3O4-Apt中加入体积为300-400μL的DNPs-cDNA溶液，37℃孵育15-20min，测定上清液的荧光强度，对照标准曲线，计算样品中恩诺沙星含量。
步骤(1)所述的制备的DNPs直径2.5-3.0nm。
步骤(2)透析使用的透析袋的分子量截取值为7000D。
步骤(2)中cDNA为氨基化的cDNA，序列为5'-GTG TTA GCC TAG CCC CCT GAT-NH2-3'。
步骤(3)所述的1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠的质量比为6.5-7.5：1.0：2.0；水热反应釜反应温度为198℃；用无水乙醇和去离子水反复清洗的次数为5-8次；水热反应釜外壳为不锈钢，内胆为聚四氟乙烯。
步骤(4)所述的磷酸盐缓冲液的pH为7.4；Fe3O4与磷酸盐缓冲液的质量体积比为2mg：1mL；Fe3O4与25％戊二醛的质量体积比为10mg：1.25mL；Fe3O4与Apt的质量摩尔比为10mg：0.00015μmol。
核酸适配体为氨基化修饰的恩诺沙星核酸适配体，序列为5'-CCC ATC AGG GGGCTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-NH2-3'。
优点及效果：
以二肽荧光纳米微球为荧光信号，适配体为分子识别元件，结合磁性Fe3O4适宜的操作性，建立的恩诺沙星荧光检测方法抗干扰能力强、灵敏度高、生物相容性好、环境友好、操作简单，适合实际样品中恩诺沙星的荧光快速测定。
附图说明
图1为色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的透射电镜图。图中显示：色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的直径约2.5-3.0nm。
图2为不同恩诺沙星浓度下该检测方的荧光光谱图。随着恩诺沙星浓度的增大荧光强度不断增强，可说明该发明建立的检测方法对目标物恩诺沙星具有较好的识别行为。
图3为一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法的标准曲线图。由图3可以看到，目标物恩诺沙星的浓度与荧光信号增强程度ΔF在0-10ng/mL范围内呈线性关系，线性方程为ΔF＝95.1539C+37.4452，相关系数为0.9738，灵敏度为0.37ng/mL。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行详细的说明：
本发明将核酸适配体及互补链、磁性材料与肽荧光纳米材料联合，结合核酸适配体的高特异性与肽纳米材料荧光检测技术的高灵敏性，设计一种利用二肽荧光纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法，该检测方法抗干扰能力强、灵敏度高、生物相容性好、环境友好、操作简单，具有广阔的应用前景。
一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法，是以色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球、恩诺沙星核酸适配体、适配体互补链、磁性Fe3O4微球为材料检测的恩诺沙星检测方法，其制备步骤如下：
(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球(DNPs)：
将色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与氯化锌水溶液混合，混合均匀后70-80℃加热反应55-65min，反应结束后在70-80℃干燥箱中干燥获得DNPs，干燥后的DNPs复溶于水中，DNPs水溶液中DNPs浓度为0.1mg/mL，DNPs水溶液用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联。所述的色氨酸-苯丙氨酸二肽与氯化锌的质量比为1：1.5-2.0；溶剂异丙醇与溶剂水的体积比为9：1；所使用的水为去离子水；
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物(DNPs-cDNA)：
向步骤(1)合成的DNPs溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液和cDNA，振荡条件下反应10～12h，反应结束后将反应液转移至透析袋中透析24-26h得到DNPs-cDNA。所述的DNPs、EDC和NHS的体积质量比为0.8-1.2mL：4mg：4mg；DNPs和cDNA的体积质量摩尔比为0.8-1.2mL：0.001μmol；所述的cDNA氨基化的序列为5'-GTG TTA GCC TAG CCC CCT GAT-NH2-3'；
(3)制备磁性Fe3O4微球；
将1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠置于烧杯中，加入一定体积的乙二醇，搅拌至固体全部溶解的混合溶液，将制得的混合溶液置于水热反应釜中于加热反应6-8h，反应完成后，自然冷却至室温，取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗，至清洗液为中性，后于60℃下真空干燥10-12h制得磁性Fe3O4微球；六水合三氯化铁和乙二醇的质量体积比为1g：30-40mL；
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物(Fe3O4-Apt)；
将步骤(3)制备的磁性Fe3O4微球分散于磷酸盐缓冲液(PBS)中，超声分散均匀后加入戊二醛反应2-4h，PBS清洗3-6次除去戊二醛，再次分散于PBS后加入恩诺沙星核酸适配体(Apt)反应12-16h，除去未反应的Apt后用牛血清白蛋白(BSA)封闭1h，PBS清洗3次去除未吸附的BSA后得到Fe3O4-Apt。所述的恩诺沙星核酸适配体氨基化的序列为5'-CCC ATC AGGGGG CTA GGC TAA CAC GGT TCG GCT CTC TGA GCC CGG GTT ATT TCA GGG GGA-NH2-3'；
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合；
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合，37℃孵育15-20min，磁铁辅助分离去除上清液，用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次。
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合；
向步骤(5)用PBS清洗后的Fe3O4-Apt中加入体积为300-400μL的DNPs-cDNA溶液，37℃孵育15-20min，测定上清液中的荧光强度，对照标准曲线，计算样品中恩诺沙星含量。
步骤(1)所述的制备的DNPs直径约2.5-3.0nm。图1为色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的透射电镜图。图中显示：色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球的直径约2.5-3.0nm。增大了反应的表面积。
步骤(2)所述的透析袋的分子量截取值为7000D。
步骤(3)所述的1,6-己二胺、六水合三氯化铁和无水乙酸钠的质量比为6.5-7.5：1.0：2.0；水热反应釜反应温度为198℃；用无水乙醇和去离子水反复清洗的次数为5-8次；水热反应釜外壳为不锈钢，内胆为聚四氟乙烯。
步骤(4)所述的PBS的pH为7.4；Fe3O4与PBS的质量体积比为2mg：1mL；Fe3O4与戊二醛(25％)的质量体积比为10mg：1.25mL；Fe3O4与Apt的质量摩尔比为10mg：0.00015μmol。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球(DNPs)：
取900μL含有1mg的色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与100μL含有1.5mg的氯化锌水溶液混合，混合均匀后70℃加热反应55min，反应结束后在70℃干燥箱中干燥获得DNPs，干燥后的DNPs复溶于2mL水中，DNPs浓度为0.1mg/mL，用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联。
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物(DNPs-cDNA)：
取0.8mLDNPs溶液中分别加入400μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(10mg/mL)、400μL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液(10mg/mL)和100μL的cDNA溶液(10μmol/L)，振荡条件下反应10h，反应结束后将反应液转移至7000D的透析袋中透析24h，得到DNPs-cDNA。
(3)制备磁性Fe3O4微球；
将6.5g的1,6-己二胺、1.0g的六水合三氯化铁和2.0g的无水乙酸钠置于烧杯中，加入30mL的乙二醇，搅拌至固体全部溶解，将制得的溶液置于水热反应釜中于198℃加热反应6h，反应完成后，自然冷却至室温，取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗5次后于60℃下真空干燥10h制得磁性Fe3O4微球。
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物(Fe3O4-Apt)；
取10mg的Fe3O4分散于5mL的磷酸盐缓冲液(PBS)中(pH为7.4)，超声分散均匀后加入1.25mL的戊二醛溶液(25％)反应2h，PBS清洗3次除去戊二醛，再次分散于PBS后加入15μL的恩诺沙星核酸适配体(Apt)溶液(10μmol/L)反应12h，除去未反应的Apt后用牛血清白蛋白(BSA)封闭1h，PBS清洗3次去除未吸附的BSA后得到Fe3O4-Apt。
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合；
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合，37℃孵育15-20min，磁铁辅助分离去除上清液，用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次；
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合；
向步骤(5)Fe3O4-Apt中加入DNPs-cDNA溶液，37℃孵育15-20min，测定上清液中的荧光强度，对照标准曲线，计算样品中恩诺沙星含量。
实施例2
(1)制备色氨酸-苯丙氨酸二肽荧光纳米微球(DNPs)：
取900μL含有1mg的色氨酸-苯丙氨酸二肽的异丙醇溶液与100μL含有2.0mg的氯化锌水溶液混合，混合均匀后80℃加热反应60min，反应结束后在80℃干燥箱中干燥获得DNPs，干燥后的DNPs复溶于2mL水中，DNPs浓度为0.1mg/mL，用于与恩诺沙星核酸适配体互补链偶联。
(2)合成二肽荧光纳米微球恩诺沙星核酸适配体互补链偶联物(DNPs-cDNA)：
取1.2mLDNPs溶液中分别加入400μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液(10mg/mL)、400μL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液(10mg/mL)和100μL的cDNA溶液(10μmol/L)，振荡条件下反应12h，反应结束后将反应液转移至7000D的透析袋中透析26h，得到DNPs-cDNA。
(3)制备磁性Fe3O4微球；
将7.5g的1,6-己二胺、1.0g的六水合三氯化铁和2.0g的无水乙酸钠置于烧杯中，加入40ml的乙二醇，搅拌至固体全部溶解，将制得的溶液置于水热反应釜中于198℃加热反应8h，反应完成后，自然冷却至室温，取下层黑色固体用无水乙醇和去离子水反复清洗5次后于60℃下真空干燥12h制得磁性Fe3O4微球。
(4)合成磁性Fe3O4偶联恩诺沙星适配体偶联物(Fe3O4-Apt)；
取10mg的Fe3O4分散于5mL的磷酸盐缓冲液(PBS)中(pH为7.4)，超声分散均匀后加入1.25mL的戊二醛溶液(25％)反应4h，PBS清洗5次除去戊二醛，再次分散于PBS后加入15μL的恩诺沙星核酸适配体(Apt)溶液(10μmol/L)反应14h，除去未反应的Apt后用牛血清白蛋白(BSA)封闭1h，PBS清洗3次去除未吸附的BSA后得到Fe3O4-Apt。
(5)待测样品与步骤(4)合成的Fe3O4-Apt混合；
体积为300-400μL的待测样品与质量为1-1.5mg的Fe3O4-Apt混合，37℃孵育15-20min，磁铁辅助分离去除上清液，用PBS清洗Fe3O4-Apt 3-5次；
(6)将步骤(2)中合成的DNPs-cDNA与步骤(5)中Fe3O4-Apt混合；
向步骤(5)用PBS清洗后的Fe3O4-Apt中加入体积为300-400μL的DNPs-cDNA溶液，37℃孵育15-20min，测定上清液中的荧光强度，对照标准曲线，计算样品中恩诺沙星含量。
图2为不同恩诺沙星浓度下该检测方法的荧光光谱图。随着恩诺沙星浓度的增大荧光强度不断增强，可说明该发明建立的检测方法对目标物恩诺沙星具有较好的识别行为。
图3为一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法的标准曲线图。由图3可以看到，目标物恩诺沙星的浓度与荧光信号增强程度ΔF在0-10ng/mL范围内呈线性关系，线性方程为ΔF＝95.1539C+37.4452，相关系数为0.9738，灵敏度为0.37ng/mL。
实施例3
鸡肉和鳗鱼样品经以下处理方法处理后，采用上述检测方法检测结果见表1。
鸡肉：确称取5g鸡肉糜样品，置于50mL离心管中，加入10mL乙腈震荡混匀，超声提取后离心，取上清液，残渣再次加入10mL乙腈，重复上述方法提取，获得两次的上清液，合并两次上清液，将其置于旋转蒸发仪中50℃旋转蒸发20min，蒸干后用PBS缓冲液溶解，备用。
鳗鱼：鳗鱼去皮取肌肉部分制成肉糜，置于冰箱储藏备用。称取5g样品，放入50mL离心管中，加入25mL乙腈，均质后离心，分离上清液，残渣再加入10mL乙腈，重复上述步骤三次，获得三次的上清液，将三次上清液合并，定容至40mL，摇匀后量取10mL提取液，加入正己烷振摇脱脂，然后置于分液漏斗中，充分静置，取下层乙腈层置于烧瓶中，50℃蒸干，用PBS缓冲液溶解，备用。
表1鸡肉、鳗鱼样品中ENR的检测
从表1中可知样品的添加回收率为84.36-96.43％，相对标准偏差为1.19-5.84％。说明本发明方法的稳定性和回收率好。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一种利用荧光二肽纳米微球/核酸适配体检测恩诺沙星的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgttagcct agccccctga t 21
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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