一种具有美白抗衰功效的发酵液、发酵多肽及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种具有美白抗衰功效的发酵液、发酵多肽及其制备方法和应用 (Fermentation liquor with whitening and anti-aging effects, fermented polypeptide, and preparation method and application thereof ) 是由 张冬生 周安 吴成亮 高先亭 刘玉梅 于 2021-07-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有美白抗衰功效的发酵液、发酵多肽及其制备方法和应用,所述发酵液是以具有美白抗衰作用的天然植物为原料,先利用植物乳杆菌对原料进行一次发酵,再利用酿酒酵母对一次发酵产物进行二次发酵制备获得,所述发酵多肽是以发酵液中的蛋白为原料,经酶解制备获得,另外提供了发酵液及发酵多肽的制备方法和应用。本发明将混合的玫瑰与黄精粉末经植物乳杆菌发酵、超声,再次经酿酒酵母低温发酵、超声,获得的发酵液具有较强的抗氧化作用,发酵液蛋白经酶解制得的多肽对酪氨酸酶具有抑制作用,另外发酵液及发酵多肽制备过程简单易得,并且无任何添加剂和有机试剂,应用于美白抗衰类化妆品可提升皮肤的健康微生态。(The invention relates to a fermentation broth with whitening and anti-aging effects, a fermented polypeptide, a preparation method and application thereof. The rose and sealwort mixed powder is fermented and subjected to ultrasonic treatment by lactobacillus plantarum, and is subjected to low-temperature fermentation and ultrasonic treatment by saccharomyces cerevisiae again, so that the obtained fermentation liquor has a strong antioxidation effect, the polypeptide prepared by enzymolysis of protein in the fermentation liquor has an inhibition effect on tyrosinase, and the preparation processes of the fermentation liquor and the fermented polypeptide are simple and easy to obtain, and no additive or organic reagent is contained, so that the rose and sealwort mixed powder is applied to whitening and anti-aging cosmetics and can improve the healthy microecology of skin.)
技术领域
本发明属于微生物发酵和生物
技术领域
，具体涉及一种具有美白抗衰功效的发酵液、发酵多肽及其制备方法和应用。背景技术
益生菌的健康作用由俄国科学家Mctchnikoff首次提出益生菌具有延长寿命且防止腐败菌，且在医学上治疗肠道失调以及抗肿瘤等作用，由于其无毒性、无残留、无污染等优点，在医疗保健和食品上得到广泛的应用。我国农业部公布6种益生菌，酵母菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、粪链球菌、DM423腊样芽孢杆菌和SA38腊样芽孢杆菌，益生菌具有多方面的生物学功效，产生有益的代谢产物，如有机酸；且益生菌产生挥发性酸、维生素、叶酸、烟酸和泛酸等多种营养活性成分。另一方面，益生菌提高巨噬细胞活性，进而增强机体免疫功能，产蛋白酶的益生菌饲肉鸡促进免疫器官的生长发育。通过白鼠实验益生菌制剂具有抗辐射、抗疲劳等作用。酵母主要是酵母单细胞蛋白，因此又称单细胞蛋白。酵母作为真菌培养物含有大量有效蛋白质且有益菌生长，抑制病原微生物繁殖，提高机体免疫力和抗病力，酵母产物营养丰富，富含粗蛋白质、B族维生素、矿物质、消化酶、促生长因子和较齐全的氨基酸)，被广泛应用于医药保健、工业生产。酵母可以分为营养性酵母和功能性酵母，营养性酵母主要是啤酒酵母或面包酵母发酵后经过酶解处理喷雾干燥而成的产品，这类产品含有丰富的蛋白质、小肽、核苷酸、维生素等。功能性酵母主要是一些酵母的衍生物和活性干酵母等，富含酵母细胞壁多糖、酵母硒和酵母铬等营养物质。植物乳杆菌作为常见的益生菌之一，日常生活中发挥这抗衰、抗氧化、抗菌等发面的作用。
酵素是利用微生物发酵植物和菌类来源产生具有含有酶、催化类及其他多重生物学活性物质，其本身作为一类在机体参与新陈代谢的复杂性蛋白，广泛存在于活细胞中并发挥着重要的功能，因此酵素产品被广泛的认知，各种食用性酵素产品层出不穷。目前利用益生菌对中药发酵已经得到广泛的应用，其中改善药物功效物质含量、提升发酵物的功效及降低毒性等多重作用。我国有着丰富的植物资源，其利用开发主要方式通过提取、萃取的方法应用，导致过程繁琐并且可能带入有毒有害物质的残留。因此改变对植物资源的利用方式，提高资源的利用率具有重要的研究意义。
玫瑰花具有美白、改善皮肤质地以及促进血液循环及新陈代谢的功效，而黄精现代研究发现，其含有黄精皂苷、烟酸、糖类、醌类、氨基酸及微量元素等，具有美容养颜抗衰老的功效，利用微生物可以将玫瑰花或黄精进行发酵产生含有酶、催化类及其他多重生物学活性物质的植物酵素，使其具有很好的美白抗衰功效，但目前作为大分子的酵素难以被皮肤直接吸收与利用，制约了其在化妆品领域的发展。
不光针对玫瑰花及黄精组合物，现有的大部分单纯植物化妆品原料经过生物发酵都可以充分释放与利用植物当中的有效成分及代谢产生大量的有益于人体皮肤吸收的益生元，将植物本身难以被人体吸收的大分子转化成小分子，另一方面酶解技术的运用将大分子蛋白经过酶解转化成多肽，进而可高效的作用于不同的靶点发挥相应的生物学活性。而作为大分子的酵素难以被皮肤直接吸收与利用，为此，我们提出了一种具有美白抗衰功效的发酵液、发酵多肽及其制备方法和应用。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供了一种具有美白抗衰功效的发酵液、发酵多肽及其制备方法和应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种具有美白抗衰功效的发酵液，所述发酵液是以具有美白抗衰作用的天然植物为原料，先利用植物乳杆菌对原料进行一次发酵，再利用酿酒酵母对一次发酵产物进行二次发酵制备获得。
作为本发明的进一步优化方案，所述具有美白抗衰功效作用的天然植物原料为玫瑰花和黄精的组合物。
一种如上述任一所述的发酵液在制备美白抗衰类化妆品中的应用。
一种具有美白抗衰功效的发酵多肽，所述发酵多肽是以上述任一所述的发酵液中的蛋白为原料，经酶解制备获得。
作为本发明的进一步优化方案，所述发酵液中的蛋白的提取方法为硫酸铵沉淀法。
作为本发明的进一步优化方案，利用复合酶对发酵液中的蛋白进行酶解，所述复合酶的组分包括：胃蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶。
一种如上述所述的发酵多肽在制备美白抗衰类化妆品中的应用。
一种如上述所述的发酵液或发酵多肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)培养基配制
将粉碎后的玫瑰花与黄精以1-40：1-40的质量比添加于发酵培养基中，经灭菌后待用；
(2)接种发酵
向发酵培养基中先接种1-20％体积比的植物乳杆菌种子液并置于20-50℃恒温振荡器发酵24-96h，得到一次发酵产物后置于超声仪中超声处理，向超声处理后的一次发酵产物中再接种1-15％酿酒酵母种子液并置于10-40℃恒温振荡器中发酵2-10d，将二次发酵产物再次置于超声仪中超声处理，随后经离心获得上层发酵清液，即为所述发酵液，将发酵液储存备用；
(3)发酵液蛋白提取
向步骤(2)获得的发酵液中加入硫酸铵提取发酵清液中的蛋白，经离心获得沉淀，所述硫酸铵的加入量为每100ml发酵液中加入10-80g硫酸铵；
(4)发酵液酶解制备发酵多肽
向步骤(3)中获得的蛋白质沉淀中以1-20：1-100的质量比添加复合酶酶解5-30h后，获得所述发酵多肽。
作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)中，一次发酵产物和二次发酵产物均经过40KHz频率超声波处理，超声时间1-20min，间隔3-30min。
作为本发明的进一步优化方案，所述的复合酶为胃蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶以1-10：1-10：1-10的质量比混合配制而成。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用天然植物玫瑰花与黄精组合物，玫瑰花具有美白、改善皮肤质地以及促进血液循环及新陈代谢的功效，而黄精经现代研究发现，其含有黄精皂苷、烟酸、糖类、醌类、氨基酸及微量元素等，具有美容养颜抗衰老的功效，两者经生物发酵可应用于制备美白抗类的产品。
(2)本发明采用酿酒酵母与植物乳杆菌作为发酵菌种，并利用两种益生菌温度差异性进行发酵，联合发酵方式可间接提高有效成分的释放与次生代谢产物的生物转化；发酵采用的益生菌均来源于日常生活，产生的小分子物质易于被人体吸收发挥作用；
(3)本发明采用生物发酵法降低植物源材料提取过程的繁琐程序和有机试剂的引入，降低安全风险，发酵产生的发酵液具有较强DPPH清除的功效且发酵多肽具有较强酪氨酸酶抑制作用和抑菌作用效果。
附图说明
图1是本发明提供的发酵液与发酵多肽的制备流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
一种具有美白抗衰功效的发酵液或发酵多肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)培养基配制
S1：将玫瑰花与黄精使用高速粉碎机进行粉碎并以1-40：1-40质量比进行混匀备用，将混合原料添加以1-50g加入100mL发酵培养基，特别优选为5g/100mL、10g/100mL和15g/100mL三个浓度进行发酵培养基的配制，将其置于121℃温度条件下灭菌15min后，备用；
其中，发酵培养基组成：10.0g/L酪蛋白胨、8.0g/L牛肉粉、4.0g/L酵母粉、葡萄糖20g/L、0.2g/L硫酸镁、5.0g/L乙酸钠、2.0g/L柠檬酸三胺、2.0g/L磷酸氢二钾、0.05g/L硫酸锰和1.0g/L吐温80，培养基pH调节至6.2±0.2；
S2：将发酵所需的植物乳杆菌和酿酒酵母进行活化培养，再将其分别接种于MRS和YM培养基，将接种两种菌的培养基分别置于37℃和28℃的温度条件下培养至OD600均为0.8，即得到发酵所需的植物乳杆菌种子液和酿酒酵母种子液；
(2)接种发酵
S1：将含有黄精和玫瑰的培养基中接种1-20％体积比的植物乳杆菌种子液，并将其置于20-50℃恒温振荡器上培养24-96h，最佳的发酵温度为37℃，待发酵结束时，将其置于40KHz频率超声波中以1-20min/间隔3-30min进行超声处理，特别优选超声5min，间隔15min；
S2：超声处理结束时再以1-15％体积比接种酿酒酵母种子液，并将其置于20-40℃恒温振荡器上培养2-10d，最佳的发酵温度为15℃，发酵时间为5d，待酿酒酵母发酵结束时将其置于40KHz频率超声波以1-20min/间隔3-30min进行超声处理,特别优选超声5min，间隔15min，最后，将发酵液其置于离心机中经过4000-10000rpm/min离心5-20min，特别优选5000rpm/min离心5min，收集上层发酵清液；
(3)发酵液蛋白的制备
将步骤(2)得到的发酵清液经硫酸铵处理并置于4℃冰箱冷藏过夜，再将其置于高速冷冻离心机中以5000rpm/min离心5min，弃去上清液收集底部沉淀，所述硫酸铵的加入量为每100ml发酵液中加入10-80g硫酸铵；
(4)发酵液酶解制备发酵多肽
将(3)中获得的蛋白质沉淀使用复合酶(胃蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶以1-10：1-10：1-10的质量比混合配制而成)进行酶解，即获得发酵多肽，酶解时采用蛋白质与酶的质量比为1-50：1-100，酶解时间为5-30h，特别优选碱性蛋白酶：胰蛋白酶：胃蛋白酶＝1：1：1，蛋白质：复合酶为1：40，酶解时间为12h。
实施例1
本实施例提供一种具有美白抗衰功效的发酵液或发酵多肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)培养基配制
将粉碎后的玫瑰花与黄精以1：1的质量比添加于发酵培养基中，经灭菌后待用；
(2)接种发酵
向发酵培养基中先接种1％体积比的植物乳杆菌种子液并置于20℃恒温振荡器发酵24h，得到一次发酵产物后置于超声仪中超声处理，向超声处理后的一次发酵产物中再接种1％体积比的酿酒酵母种子液并置于10℃恒温振荡器中发酵2d，将二次发酵产物再次置于超声仪中超声处理，随后经离心获得上层发酵清液，即为发酵液，储存备用；
(3)发酵液蛋白的制备
向步骤(2)获得的发酵液中加入硫酸铵提取发酵清液中的蛋白，经离心获得沉淀，所述硫酸铵的加入量为每100ml发酵液中加入10g硫酸铵；
(4)发酵液酶解制备发酵多肽
向步骤(3)中获得的蛋白质沉淀中以1：40的质量比添加复合酶酶解5h后，获得发酵多肽。
实施例2
本实施例提供一种具有美白抗衰功效的发酵液或发酵多肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)培养基配制
将粉碎后的玫瑰花与黄精以20：40的质量比添加于发酵培养基中，经灭菌后待用；
(2)接种发酵
向发酵培养基中先接种10％体积比的植物乳杆菌种子液并置于37℃恒温振荡器发酵48h，得到一次发酵产物后置于超声仪中超声处理，向超声处理后的一次发酵产物中再接种8％体积比的酿酒酵母种子液并置于15℃恒温振荡器中发酵5d，将二次发酵产物再次置于超声仪中超声处理，随后经离心获得上层发酵清液，即为发酵液，储存备用；
(3)发酵液蛋白的制备
向步骤(2)获得的发酵液中加入硫酸铵提取发酵清液中的蛋白，经离心获得沉淀，所述硫酸铵的加入量为每100ml发酵液中加入50g硫酸铵；
(4)发酵液酶解制备发酵多肽
向步骤(3)中获得的蛋白质沉淀中以1：40的质量比添加复合酶酶解12h后，获得发酵多肽。
实施例3
本实施例提供一种发酵液或发酵多肽的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)培养基配制
将粉碎后的玫瑰花与黄精以40：20的质量比添加于发酵培养基中，经灭菌后待用；
(2)接种发酵
向发酵培养基中先接种20％体积比的植物乳杆菌种子液并置于50℃恒温振荡器发酵96h，得到一次发酵产物后置于超声仪中超声处理，向超声处理后的一次发酵产物中再接种15％体积比的酿酒酵母种子液并置于40℃恒温振荡器中发酵10d，将二次发酵产物再次置于超声仪中超声处理，随后经离心获得上层发酵清液，即为发酵液，储存备用；
(3)发酵液蛋白的制备
向步骤(2)获得的发酵液中加入硫酸铵提取发酵清液中的蛋白，经离心获得沉淀，所述硫酸铵的加入量为每100ml发酵液中加入80g硫酸铵；
(4)发酵液酶解制备发酵多肽
向步骤(3)中获得的蛋白质沉淀中以1：100的质量比添加复合酶酶解30h后，获得发酵多肽。
实施例4
为验证本发明产品的有益效果，本实施例提供了发酵液或发酵多肽的制备和验证方法，其中，所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
所述方法的步骤具体包括：
1、采用酿酒酵母发酵玫瑰花与黄精组合物
(1)将粉碎后的玫瑰花与黄精以1：1质量比混合均匀，再分别以5％、10％和15％质量比添加于3个MRS培养基中，待灭菌结束并冷却至室温后，依次接种1％体积比的酿酒酵母种子液，再置于15℃恒温振荡器上并以200r/min发酵5d；
(2)待发酵结束时将其分别置于超声仪中进行超声处理，超声5min，间隔20min，共超声4次；
(3)待发酵液超声结束时，再次接种接种1％体积比的酿酒酵母种子液，再置于15℃恒温振荡器上并以200r/min发酵5d，发酵结束分别置于超声仪中进行超声处理后，再将其分别置于离心机中以5000rpm/min离心15min，收集3个MRS培养基中的上层发酵清液，即为发酵液。
2、采用植物乳杆菌发酵玫瑰花与黄精组合物
(1)将粉碎后的玫瑰花与黄精以1：1质量比混合均匀，再分别以5％、10％和15％质量比添加于3个MRS培养基中，再将其一并置于121℃温度条件下灭菌15min，待灭菌结束并冷却至室温后，依次接种1％体积比的植物乳杆菌种子液，再置于37℃恒温振荡器上并以200r/min发酵48h；
(2)待发酵结束时将其分别置于超声仪中进行超声处理，超声5min间隔20min，共超声4次；
(3)待超声结束时，再次接种1％体积比的植物乳杆菌种子液，再置于37℃恒温振荡器上并以200r/min发酵48h，发酵结束分别置于超声仪中进行超声处理后，再将其分别置于离心机中以5000rpm/min离心15min，收集3个MRS培养基中的上层发酵清液。
3、采用植物乳杆菌与酿酒酵母联合发酵玫瑰花与黄精组合物
(1)将粉碎后的玫瑰花与黄精以1：1质量比混合均匀，再分别以5％、10％和15％质量比添加于3个MRS培养基中，再将其一并置于121℃温度条件下灭菌15min，待灭菌结束并冷却至室温后，依次接种1％体积比的植物乳杆菌种子液再置于37℃恒温振荡器上并以200r/min发酵48h；
(2)待发酵结束时将其分别置于超声仪中进行超声处理，超声5min间隔20min，共超声4次；
(3)待超声结束时，依次接种1％体积比的酒酵母种子液，置于37℃恒温振荡器上并以200r/min发酵5d；
(4)待发酵结束时，再次将其分别置于超声仪中以超声5min间隔20min频率进行超声，超声结束时将其5000rpm/min离心15min，收集3个MRS培养基中的上层发酵清液。
4、发酵多肽制备
(1)将步骤1、2和3收集的样品分别取10mL于容器中，依次加入5g硫酸铵粉末，将其置于4℃冰箱冷藏过夜；
(2)将步骤(1)处理的3组样品分别置于离心机中以5000rpm/min离心15min，依次收集下层沉淀；
(3)将步骤(3)收集的3组沉淀样品以1：40的质量比依次添加复合酶(碱性蛋白酶：胰蛋白酶：蛋白酶＝1：1：1)酶解12h；
(4)酶解结束后将3组酶解液样品置于55℃温度条件下钝化30min，得到酶解产物，即发酵多肽，备用；
(5)将发酵多肽经过真空冷冻干燥制备成粉末，备用。
为了验证采用不同益生菌发酵玫瑰花与黄精组合物制备的发酵液及发酵多肽的功效作出一系列验证实验，如下：
DPPH·活性实验
DPPH·是以氮为中心稳定的自由基，其无水乙醇溶液置于517nm波长处出现最大吸收。存在自由基清除剂时，可结合或替代DPPH·使自由基数量减少导致吸光度减小。
(1)试剂配制，精密称取DPPH3.0mg置10ml容量瓶中，加少量无水乙醇使其溶解，并定容至刻度，摇匀。另取2ml至100ml容量瓶中，定容摇匀，得浓度为0.006mg/ml DPPH溶液。
(2)将步骤1、2、3和4收集的待测样品均稀释成不同倍数；
(3)将4组样品管中对应加入3.0mLDPPH溶液和0.5mL 2.1、2.2、2.3和2.4的待测样品溶液，对照管中加入3.0mL无水乙醇和0.5mL待测样品溶液；空白对照加入3.0mLDPPH溶液和0.5mL蒸馏水；
(4)待4组样品管、对照管和空白管加入试剂完成后，将反应液均置于黑暗条件下反应30min；
(5)待反应结束后以3.0mL无水乙醇和0.5mL蒸馏水调零，将其分别置于517nm波长条件下检测各反应空吸光度的变化并设置3个平行反应孔计算其平均值的变化。
(6)DPPH清除实验结果
比较不同浓度的发酵原料(黄精：玫瑰花＝1：1)经酿酒酵母、植物乳杆菌及两种益生菌联合发酵制备的发酵液及发酵多肽对DPPH的清除作用效果，结果如表1。
表1 DPPH抑制效果
备注：所有样品均使用蒸馏水稀释，步骤1、2、3和4中的发酵液样品均被稀释30倍；发酵多肽将其配制成0.1mg/ml储备液，再将其稀释30倍配制成0.0033mg/ml工作液进行实验。
实验结论：经过益生菌发酵的发酵液对DPPH清除效果较未发酵高且菌株联合发酵高于单一菌株发酵清除效果。
另外，经过酿酒酵母与植物乳杆菌发酵制备得到的发酵多肽对DPPH的清除效果强于未发酵的发酵多肽，两种菌株的联合发酵进一步提高发酵多肽对DPPH的清除效果均高于单一菌株发酵的作用效果。
抑制酪氨酸酶活性实验
酪氨酸酶是一种氧化酶，且是调控黑色素生成的限速酶。这种酶参与黑色素合成的两个反应：第一步将单酚羟基化为二酚，第二步将邻二酚氧化为邻二醌。邻二醌再经过几步反应后就变为黑色素。在皮肤黑素细胞的黑色素体中能发现酪氨酸酶，因此，抑制酪氨酸酶活性实验可用来评定美白成分功效。
(1)试剂配制
①50mM磷酸缓冲液(pH6.8)
精密称取磷酸二氢钾3.42g将其定容至125mL，称取氢氧化钠0.49g将其定容至59mL，将两者混合并使用水定容至500mL。
②1.8mM L-酪氨酸：精密称取0.0659gL-酪氨酸将其溶解并定容至200mL。
③125unit/mL(0.25mg/mL)酪氨酸酶：精密称取0.25mg酪氨酸酶并加入1mL50mM磷酸缓冲液使其充分溶解。
④100mg/mL熊果苷储备液：精密称取200mg熊果苷加入50mM磷酸缓冲液2mL，置于-20℃下保存备用，0.12mg/mL熊果苷配制：精密称取6mg将其定容至50mL。
(2)参照表2所示的酪氨酸酶抑制实验反应体系，依次将50mM磷酸缓冲液、实验样品和1.8mM L-酪氨酸加入反应体系后将其置于37℃孵育5min，待孵育结束加入125unit/mL酪氨酸酶置于37℃孵育15min，将其置于475nm波长检测其吸光度的变化。
计算公式：抑制率(％)＝[1-(C-D)/(A-B)]×100％。
表2酪氨酸酶抑制实验反应体系
(3)酪氨酸酶抑制实验结果
比较不同浓度的发酵原料(黄精：玫瑰花＝1：1)经酿酒酵母、植物乳杆菌及两种益生菌联合发酵制备的发酵液及发酵多肽对酪氨酸酶抑制率，结果如表3。
表3发酵液与发酵多肽对酪氨酸酶的抑制作用
备注：所有样品均使用蒸馏水稀释，步骤1、2、3和4中的发酵液样品均被稀释30倍；发酵多肽制备成冻干粉，将其配制成100mg/mL浓度检测发酵多肽对酪氨酸酶的抑制作用。
实验结论：单一菌株发酵与多菌株联合发酵的发酵液对酪氨酸酶的抑制作用较未发酵均有增强，对酪氨酸酶的抑制作用均低于20％，阳性对照对酪氨酸酶的抑制作用远高于发酵液。
另外，将制备得到的多肽粉末均使用50mM磷酸缓冲液将其配成100mg/mL，未发酵制备得到的多肽对酪氨酸酶的抑制作用仅仅为35.23％。单一菌株发酵制备得多肽对酪氨酸酶的抑制作用效果低于两种菌株联合发酵，其中发酵液中原料添加量为15％制备得到的多肽对酪氨酸酶的抑制作用达到68.68％。
抑菌实验
(1)菌株活化
将大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分别接种于LB培养基并将其置于37℃恒温培养箱中培养24h，挑单菌落接种于LB液体培养基以200r/min培养至OD600为0.6，将菌液稀释10倍保存备用；
(2)将培养基、发酵液和多肽溶液使用0.45μm无菌滤头进行过滤；
(3)以1mg/mL青-链霉素混合液作为阳性对照，以培养基作为阴性对照；
(4)接种步骤(1)稀释后菌液100μL于LB培养基并涂布均匀，培养皿中心部位加入50μL待检样品和阳性对照；
(5)将步骤(4)培养基置于37℃培养24h，使用游标卡尺检测抑菌圈的直径大小。
(6)发酵液的抑菌作用效果
比较发酵液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，结果如表4。
表4发酵液的抑菌作用效果
备注：所有样品均使用蒸馏水稀释，步骤1、2、3和4中的发酵液样品均被稀释30倍。
实验结论：单一菌株发酵得到的发酵液抑菌作用效果较两种菌株联合发酵效果差。发酵液抑制金黄色葡萄球菌的效果较大肠杆菌作用强，植物乳杆菌抑菌作用效果较酿酒酵母作用效果强。
(7)发酵多肽的抑菌作用效果
将收集到的多肽粉末配制成0.1mg/mL研究抑菌作用效果，比较发酵多肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，结果如表5。
表5发酵多肽的抑菌作用效果
备注：发酵多肽制备成冻干粉，将其配制成100mg/mL浓度检测发酵多肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用。
实验结论：植物乳杆菌发酵制备的多肽抑菌活性较酿酒酵母强，两种菌株的联合发酵可以提高多肽的抑菌活性，多肽抑制金黄色葡萄球菌的作用强于大肠杆菌。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
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