一种灵芝口服液制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种灵芝口服液制备方法及其应用 (Preparation method and application of lucid ganoderma oral liquid ) 是由 年华 于 2021-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种灵芝口服液及制备方法,涉及中药领域。灵芝口服液的制备方法包括如下步骤：将黄芪、党参、地骨皮、莲翘、青蒿、何首乌、罗汉果、青皮、水,煎煮成中药提取液；再取份灵芝、桦褐孔菌,加入中药提取液混合,浸泡得浸出液；将浸出液进行过滤,得滤液灵芝口服液。本发明灵芝口服液的制备方法,主要根据各种中药里面含有有效成分的物理和化学特性来进行控温提取,再将灵芝、桦褐孔菌和中药提取液一起混合再提取,既保证中药有效成分充分分解出来,而且经过浸泡温度控制来保持中药抗癌主要活性成分的活性。(The invention discloses lucid ganoderma oral liquid and a preparation method thereof, and relates to the field of traditional Chinese medicines. The preparation method of the ganoderma lucidum oral liquid comprises the following steps: decocting radix astragali, radix Codonopsis, cortex Lycii, fructus forsythiae, herba Artemisiae Annuae, Polygoni Multiflori radix, fructus Siraitiae Grosvenorii, pericarpium Citri Reticulatae viride and water to obtain Chinese medicinal extractive solution; adding the traditional Chinese medicine extracting solution into the ganoderma lucidum and the inonotus obliquus, mixing and soaking to obtain a leaching solution; filtering the leaching solution to obtain the filtrate ganoderma lucidum oral liquid. The preparation method of the ganoderma lucidum oral liquid mainly carries out temperature-controlled extraction according to the physical and chemical characteristics of active ingredients contained in various traditional Chinese medicines, and then the ganoderma lucidum, the inonotus obliquus and the traditional Chinese medicine extracting solution are mixed and extracted together, thereby ensuring that the active ingredients of the traditional Chinese medicines are fully decomposed, and the activity of the main anticancer active ingredients of the traditional Chinese medicines is kept through controlling the soaking temperature.)
技术领域
本发明涉及中药领域，特别涉及一种灵芝口服液制备方法及应用。
背景技术
桦褐孔菌化学成分有多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化 合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、 丁香酸及γ羟基苯甲酸等。桦褐孔菌含有大量的抗癌、降血压、降血糖、复活免 疫作用的植物纤维类多糖体，可以提高免疫细胞的活力，抑制癌细胞扩散和复发， 在胃肠内防止致癌物质等有害物质的吸收，并促进排泄。
桦褐孔菌拥有极高的SOD活性，对多种肿瘤细胞，如乳房癌、唇癌、胃癌、 耳下腺癌、肺癌、皮肤癌、直肠癌、霍金斯淋巴癌有明显的抑制作用；防止癌细 胞转移和复发；并能配合恶性肿瘤者的放疗、化疗、增强病人的耐受性，减轻毒 副作用，并缓解癌症患者的特有疼痛。
灵芝药用在我国已有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正 固本的神奇珍品，主含氨基酸、多肽、蛋白质、真菌溶菌酶，以及糖类(还原糖 和多糖)、麦角甾醇、三萜类、香豆精甙、挥发油、硬脂酸、苯甲酸、生物碱、 维生素B2及C等，主要作用有抗肿瘤、抗放疗与抗化疗、免疫双向调节等。
桦褐孔菌和灵芝的药用价值大，如何有效提取其中有效成分，使其达到高 效的抗肿瘤效果，是现阶段重要的研究方向。
CN108853350A公开的一种治疗糖尿病的发酵中药配方，通过桦褐孔菌、铁 皮石斛、茯苓、灵芝等组分于40-70℃的条件下发酵5-7天，得到发酵中药的方 案。
CN102488719A公开一种提高灵芝液体发酵菌丝体三萜产量的方法，采用含 中药提取物的培养基进行灵芝菌丝体液体发酵培养，中药提取物的中药材为板 蓝根、连翘、泽泻、黄芪或酸枣仁。
CN104878065A公开一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法，包括：将 灵芝接种到种子培养基中培养后，再接入发酵培养基中进行发酵培养，从发酵液 中提取灵芝三萜，发酵培养基以麦芽汁为碳源、以酵母浸出粉为氮源。
以上公开的技术方案，是将灵芝发酵培养得到高含量活性物质，或直接将 灵芝与中药直接混合发酵培养，增强药效。还没有关于同时将灵芝和桦褐孔菌同 时应用中药提取液浸泡，制备用于抗癌细胞的中药口服液的研究。
发明内容
本申请的灵芝口服液，是经过多年研究而成，其主要成分包含灵芝、桦褐 孔菌、黄芪、党参、地骨皮、莲翘、青蒿、何首乌、罗汉果、青皮的有效成分。 该灵芝口服液是经过对200多种中药的筛选组合、多次试验，历经五年多的时间 才研制成功，达到中药能够同时治疗多种癌细胞的中药口服液，具体方案如下：
一种灵芝口服液的制备方法，包括如下步骤：
1)将黄芪0.45-0.8份、党参0.2-0.4份、地骨皮0.25-0.35份、莲翘0.4-0.6 份，青蒿0.4-0.5份、何首乌0.5-0.8份、青皮0.22-0.3份、罗汉果0.005-0.01 份、水50～55份，置于非金属容器升温至85-95℃，然后放置15-25分钟，再 控制容器内液体温度80-85℃煎煮1.5-3小时，冷却后过滤得中药提取液；
2)按重量份，取1.5-2.5份灵芝、0.8-1份桦褐孔菌，加入上述中药提取 液20-40份混合，55-65℃浸泡36-50小时，得浸出液；
3)将浸出液进行过滤，得滤液灵芝口服液。
优选的，所述的步骤1)中，黄芪0.6份、党参0.3份、地骨皮0.3份、莲 翘0.5份，青蒿0.45份、何首乌0.6份、青皮0.25份、罗汉果0.008份、水 53份。
优选的，所述的步骤1)中，置于非金属容器升温至85-95℃，然后放置20 分钟，再控制容器内液体温度80-85℃煎煮2小时。
优选的，所述的步骤2)中，灵芝、桦褐孔菌、中药提取液的重量比为1.5-2.5： 0.8-1：30。
优选的，所述灵芝、桦褐孔菌、中药提取液的重量比为1.5-2.5：0.8-1： 30。
优选的，所述的步骤2)中，浸泡时间为48小时。
优选的，所述非金属容器为玻璃、陶或瓷容器。
优选的，其特征在于，所述的步骤3)中，浸出液过滤后，还包括将滤液 105-125℃灭菌20-30分钟。
具体的，灵芝口服液的制备方法，包括如下步骤：
1)将黄芪450-800克、党参200-400克、地骨皮250-350克、莲翘400-600 克，青蒿400-500克、何首乌500-800克、青皮220-300克、罗汉果5-10克、 水50～55升，置于非金属容器升温至85-95℃，然后放置15-25分钟，再控制 容器内液体温度80-85℃煎煮1.5-3小时，冷却后过滤得中药提取液；
2)按重量份，取1500-2500克灵芝、800-1000克桦褐孔菌，加入上述中药 提取液30升混合，55-65℃浸泡36-50小时，得浸出液；
3)将浸出液进行过滤，得滤液灵芝口服液。
优选的，灵芝口服液的制备方法，包括如下步骤：
1)将黄芪450-800克、党参200-400克、地骨皮250-350克、莲翘400-600 克，青蒿400-500克、何首乌500-800克、青皮220-300克、罗汉果5-10克、 水50～55升，置于非金属容器升温至85-95℃，然后放置20分钟，再控制容器 内液体温度80-85℃煎煮12小时，冷却后过滤得中药提取液；
2)按重量份，取1500-2500克灵芝、800-1000克桦褐孔菌，加入上述中药 提取液30升混合，55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
3)将浸出液进行过滤，得滤液灵芝口服液。
本发明灵芝口服液的制备方法，与传统中药制作的不同之处是，传统中药制 取是经过将中药煎煮后直接使用或再经过低温浓缩，最后变成粉末状进行使用。
中药活性是中药治疗疾病的关键。本发明灵芝口服液的制备方法，主要根据 各种中药里面含有有效成分的物理和化学特性来进行控温提取，再将灵芝、桦褐 孔菌和中药提取液一起混合再提取，既保证中药有效成分充分分解出来，而且经 过浸泡温度控制来保持中药抗癌主要活性成分的活性。
本发明制备的灵芝口服液，中药有效成分95％以上被释放到液体中，经过温 度的控制来保持有效成分的活性，可充分提高中药的药性。本发明制备的灵芝口 服液，比传统中药煎煮方法消耗的原材料药量要少75％，而疗效比传统中药煎煮 方法的药效更好、见效更快。本发明的灵芝口服液，有效成分可7分钟进入血液， 15-20分钟到达病灶部位，所以，临床上本发明的灵芝口服液可达到见效快，疗 效好的目的。
此外，癌症是由于人体免疫力下降、经络微循环瘀堵、细胞变异而导致。本 发明的灵芝口服液，首先，可对癌症病人扶正，增强其免疫力，第二，能够疏通 经络血脉和微循环，使药物能够到达病灶部位。第三，灵芝口服液中含有三萜类 物质(口服液中含量达到4％)、多糖和微量元素等，都以小分子形态存在口服液 中，能够灭杀癌细胞。
上述灵芝口服液在抗胃癌、食道癌药中的应用。
上述灵芝口服液在缺血性心脏病药中的应用。
上述灵芝口服液在抗血瘀药中的应用。
上述灵芝口服液在低自发性高血压药中的应用。
上述灵芝口服液在抗缺氧药中的应用。
附图说明
图1为灵芝口服液对裸鼠胃癌荷瘤影响的显微观测图(200×)。
图2为灵芝口服液BALB/c小鼠胃癌荷瘤影响的显微观测图(200×)。
图3为灵芝口服液对裸鼠食道癌荷瘤影响的显微观测图(200×)。
图4为灵芝口服液BALB/c小鼠食道癌荷瘤影响的显微观测图(200×)。
图5为心脏TTC染色结果图。
图6为心肌梗死比例结果图。
图7为心电图ST段变化图。
图8为各组大鼠血浆中SOD含量变化图。
图9为各组大鼠血浆中LDH含量变化图。
图10为各组大鼠血浆中CK含量变化图。
图11为各组大鼠体重变化图。
图12为各组大鼠收缩压的变化图。
图13为各组大鼠舒张压的变化图。
图14为各组大鼠心率的变化图。
图15为各组大鼠血清中AngII含量变化图。
图16为各组大鼠血清中ET-1含量变化图。
图17为各组大鼠血清中ALD含量变化图。
图18为各组大鼠血清中NO含量变化图。
图19为各组大鼠体重变化图。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方 案进一步介绍和说明。
实施例1
将黄芪0.45-0.8份、党参0.2-0.4份、地骨皮0.25-0.35份、莲翘0.4-0.6 份，青蒿0.4-0.5份、何首乌0.5-0.8份、青皮0.22-0.3份、罗汉果0.005-0.01 份、水50～55份，置于非金属容器升温至85-95℃，然后放置15-25分钟，再 控制容器内液体温度80-85℃煎煮1.5-3小时，冷却后过滤得中药提取液；
按重量份，取1.5-2.5份灵芝、0.8-1份桦褐孔菌，加入上述中药提取液20-40 份混合，55-65℃浸泡36-50小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，得滤液灵芝口服液。
实施例2
将黄芪0.45-0.8份、党参0.2-0.4份、地骨皮0.25-0.35份、莲翘0.4-0.6 份，青蒿0.4-0.5份、何首乌0.5-0.8份、青皮0.22-0.3份、罗汉果0.005-0.01 份、水50～55份，置于玻璃容器升温至85-95℃，然后放置15-25分钟，再控 制容器内液体温度80-85℃煎煮1.5-3小时，冷却后过滤得中药提取液；
按重量份，取灵芝、桦褐孔菌、中药提取液，按重量比为1.5-2.5：0.8-1： 30混合，55-65℃浸泡36-50小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液105-125℃灭菌20-30分钟，得灵芝口服液。
实施例3
将黄芪0.45份、党参0.2份、地骨皮0.25份、莲翘0.4份，青蒿0.4份、 何首乌0.5份、青皮0.22份、罗汉果0.005份、水55份，置于陶容器升温至 85-95℃，然后放置15分钟，再控制容器内液体温度80℃煎煮1.5小时，冷却 后过滤得中药提取液；
按重量份，取1.5份灵芝、0.8份桦褐孔菌，加入上述中药提取液40份混 合，55-65℃浸泡50小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得灵芝口服液。
实施例4
将黄芪0.8份、党参0.4份、地骨皮0.35份、莲翘0.6份，青蒿0.5份、 何首乌0.8份、青皮0.3份、罗汉果0.01份、水50份，置于瓷容器升温至85-95℃， 然后放置25分钟，再控制容器内液体温度80-85℃煎煮3小时，冷却后过滤得 中药提取液；
按重量份，取2.5份灵芝、1份桦褐孔菌，加入上述中药提取液20份混合， 55-65℃浸泡36小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液125℃灭菌30分钟，得灵芝口服液。
实施例5
将黄芪0.6份、党参0.3份、地骨皮0.3份、莲翘0.5份，青蒿0.45份、 何首乌0.6份、青皮0.25份、罗汉果0.008份、水53份，置于陶容器升温至 85-95℃，然后放置20分钟，再控制容器内液体温度80-85℃煎煮2小时，冷却 后过滤得中药提取液；
按重量份，取2份灵芝、0.9份桦褐孔菌，加入上述中药提取液30份混合， 55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得灵芝口服液。
实施例6
将黄芪450-800克、党参200-400克、地骨皮250-350克、莲翘400-600克， 青蒿400-500克、何首乌500-800克、青皮220-300克、罗汉果5-10克、水50～ 55升，置于非金属容器升温至85-95℃，然后放置15-25分钟，再控制容器内液 体温度80-85℃煎煮1.5-3小时，冷却后过滤得中药提取液；
按重量份，取1500-2500克灵芝、800-1000克桦褐孔菌，加入上述中药提 取液30升混合，55-65℃浸泡36-50小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得灵芝口服液。
实施例7
将黄芪450-800克、党参200-400克、地骨皮250-350克、莲翘400-600克， 青蒿400-500克、何首乌500-800克、青皮220-300克、罗汉果5-10克、水50～55升，置于非金属容器升温至85-95℃，然后放置20分钟，再控制容器内液体 温度80-85℃煎煮2小时，冷却后过滤得中药提取液；
按重量份，取1500-2500克灵芝、800-1000克桦褐孔菌，加入上述中药提 取液30升混合，55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得灵芝口服液。
实施例8
将黄芪450克、党参200克、地骨皮250克、莲翘400克，青蒿400克、何 首乌500克、青皮220克、罗汉果5克、水55升，置于砂锅内升温至85-95℃， 然后放置20分钟，再控制容器内液体温度80-85℃煎煮2小时，冷却后过滤得 中药提取液；
按重量份，取1500克灵芝、800克桦褐孔菌，加入上述中药提取液30升混 合，55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得灵芝口服液。
实施例9
将黄芪800克、党参400克、地骨皮350克、莲翘600克，青蒿500克、 何首乌800克、青皮300克、罗汉果10克、水50升，置于砂锅内升温至85-95℃， 然后放置20分钟，再控制容器内液体温度80-85℃煎煮2小时，冷却后过滤得 中药提取液；
按重量份，取2500克灵芝、1000克桦褐孔菌，加入上述中药提取液30升 混合，55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得灵芝口服液。
实施例10
将黄芪600克、党参300克、地骨皮300克、莲翘500克，青蒿450克、 何首乌650克、青皮260克、罗汉果8克、水52升，置于砂锅内容器升温至85-95℃， 然后放置20分钟，再控制容器内液体温度80-85℃煎煮2小时，冷却后过滤得 中药提取液；
按重量份，取2000克灵芝、900克桦褐孔菌，加入上述中药提取液30升混 合，55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得灵芝口服液。
实验1：测试灵芝口服液对癌肿瘤细胞的抑制活性
一、实验目的
测试灵芝口服液对肝癌、肺癌、胃癌、肠癌及食管癌肿瘤细胞的抑制活性。
二、实验设备与材料
肝癌细胞株(HepG2,HUH7)；肺癌细胞株(549,H1975)；胃癌细胞株 (AGS,MgC803)；肠癌细胞株(HCT116,HT29)；食管癌细胞株(ECA109,KYSE30) 从ATCC获取。
表1主要实验仪器及材料
三、实验方法
以下实验的灵芝口服液为实施例10制备的灵芝口服液。
3.1灵芝口服液固体量测定
分别取三个已干燥至恒重的表面皿，分别精密量取10mL灵芝口服液至表面 皿中，至水浴锅蒸干，然后放置烘箱中105℃干燥6小时，然后取出放入干燥器 中冷却，称重；再放入烘箱中105℃干燥2小时；再取出放入干燥器中冷却，称 重。如前后两次的重量相差在误差范围内，表明已恒重，记录重量，计算灵芝口 服液每mL口服液的固体重量。
3.2肿瘤抑制活性测试
1)细胞复苏：提前打开水浴锅升温至37℃，超净台紫外照射30min。取细胞冻 存管放入水浴锅中，使其速溶。将冻存管中的细胞转移至DMEM(1640)细胞培养 基中，800rpm离心5min，弃去上清液，重悬，转移至有培养基的10cm2培养皿中， 标记日期、细胞名、操作者名字后放入37℃、5％CO2细胞培养箱培养。
2)细胞传代：待细胞密度达到80％-90％左右时，弃去上清液，用PBS溶液2mL， 左右摇晃，冲洗1-2遍，弃去PBS溶液，加入2-3mL胰酶，于培养箱孵育至原贴 壁的细胞逐渐趋于圆形，加入5mL培养基终止消化，并将细胞吹打下来，800rpm 离心5min，弃去上清液，用培养基重悬，以1:3-1:6比例传代，培养皿放入细 胞培养箱培养。
3)细胞种板：待细胞密度达到80％-90％左右时，将消化并重悬的细胞混合均匀后， 取10uL稀释的细胞悬液于血球计数板上，在显微镜下计数。根据计数结果算出 原细胞悬液的细胞密度，接种于96孔板中，每孔100uL，最终使每孔细胞密度 为20000/孔，并于96孔板周围加PBS溶液，以防边缘效应。
4)加药处理：细胞贴壁后，取出96孔板，弃去上清液，设置空白组，灵芝口服 液不同浓度组，及阳性药(顺铂或紫杉醇)不同浓度组，每孔100uL，每个浓度 设置5个复孔，对照组加入100uL培养基。
5)加MTT处理：加药处理24小时后，除去培养基，加入含有100uL 10％M11的 PBS缓冲液，包上锡箔纸，放入培养箱继续孵育。3-4小时后，小心吸去上清液， 每孔加入100uLDMSO溶液，在摇床上避光摇晃约10min，使结晶甲瓚充分溶于 DMSO中，在酶标仪490nm波长下检测吸光度值；计算灵芝口服液对不同肿瘤细 胞株的抑制活性及IC50值。
四、实验结果
表2灵芝口服液对不同肿瘤细胞株的抑制活性IC50(ug/ml)
五、实验结论
实验结果表明灵芝口服液对肝癌、肺癌、胃癌、肠癌及食管癌肿瘤细胞具有 不同程度的肿瘤抑制活性，其中对胃癌AGS、MgC803细胞株比较敏感，其IC50略低于阳性药紫杉醇。
实验2：对灵芝口服液质量检验
对实施例10制备的灵芝口服液送深圳市计量质量检测研究院检验(报告编 号：WT10103200052842WT1)，检验结果如下表3：
表3
实验3：中药提取液对灵芝口服液(总三萜)的影响
按表4中实验例3及对比例1-5所示的组分，分别置于玻璃瓶中升温至 85-95℃，然后放置20分钟，再控制玻璃瓶内液体温度80-85℃煎煮2小时，冷 却后过滤，分别得实验例3及对比例1-5中药提取液；
将上述各组所得中药提取液各取300mL，分别加入20克灵芝、9克桦褐孔菌 混合，55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
将各组浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得对应各组的灵芝口 服液。检测各组灵芝口服液的总三萜含量，结果如下表4所示。
表4
实验4：中药提取容器对灵芝口服液(总三萜)的影响
采用实验例3的中药组分和配比，加入金属容器(生铁锅)升温至85-95℃， 然后放置20分钟，再控制温度80-85℃煎煮2小时，冷却后过滤。
将上述所得中药提取液各取300mL，加入20克灵芝、9克桦褐孔菌混合， 55-65℃浸泡48小时，得浸出液；
将浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得对应的灵芝口服液。检 测灵芝口服液的总三萜含量2.76(g/100g)。
可见，使用金属容器提取的中药提取液，会降低灵芝口服液的总三萜含量。
实验5：灵芝、桦褐孔菌在中药提取液中浸泡温度对灵芝口服液(总三萜)的影 响
分三组分别为实验例5，对比例6和对比例7，各取实施例10的中药提取液 300mL，各组均加入20克灵芝、9克桦褐孔菌混合，分别置于如表5所示的温度 下浸泡48小时，得浸出液；
将各组浸出液进行过滤，将滤液121℃灭菌25分钟，得对应的灵芝口服液。 检测各组灵芝口服液的总三萜含量，结果如下表5所示。
表5
单位
实验例5
对比例6
对比例7
浸泡温度
℃
60±2
45±2
75±2
总三萜
g/100g
3.80
2.32
1.04
可见，灵芝、桦褐孔菌在中药提取液中不同的浸泡温度对灵芝口服液中总三 萜的含量影响很大，当温度过低，不利于三萜的浸出；当温度过高时，三萜化合 物易被高温分解。
以下实验6-10的灵芝口服液为按实施例10的方法制备的灵芝口服液。
实验6：灵芝口服液抗胃癌、食道癌药效实验
灵芝口服液能提高免疫力，消肿化结，清除自由基。对食道糜烂、食道癌、 胃溃疡、胃癌等具有治疗作用。
1.实验材料
灵芝口服液；HGC-27人胃癌细胞和TE-1人食管癌细胞购自上海细胞库； RPMI-1640培养基购自美国GIBCO公司，批号31800022；10099141C澳洲源胎牛 血清购自美国GIBCO公司，批号1861242；；Matrigel基质胶购自美国BD公司， 批号356234；T25培养瓶购自美国Corning公司，批号18990203；小鼠IL-1β、 IL-6、TNF-ɑELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E08054m、 CSB-E04741m、CSB-E04639m。
2.实验动物
裸鼠和BALB/c小鼠购自重庆隆鑫比尔动物销售有限公司，许可证号 SCXK(京)2019-0010。动物自有饮水饮食，饲料由上述公司提供。
3.实验方法
3.1体内抗胃癌细胞HGC-27试验
体外常规培养HGC-27人胃癌细胞，将其注入裸鼠和BALB/c小鼠右侧腹股沟 皮下处，待肿瘤长致一定程度预示荷瘤裸鼠和BALB/c小鼠造模成功后，将动物 分成空白对照组、模型组、顺铂组、灵芝口服液高剂量组、灵芝口服液中剂量组、 灵芝口服液低剂量组，每组15只裸鼠和BALB/c小鼠。空白组和模型组灌胃给予 生理盐水，顺铂对照组给予腹腔注射顺铂水溶液，灵芝口服液各组灌胃给予相应 剂量药物，每天早晚各1次，连续给药60天(根据外观目测裸鼠和BALB/c小鼠 的瘤体生长情况和状态决定)。给药结束后检测动物体重、瘤体重量、脾脏系数、 血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ，取瘤体进行HE染色病理分析。
3.2体内抗食道癌细胞TE-1试验
体外常规培养TE-1人食道癌细胞，将其注射入裸鼠和BALB/c小鼠右侧腹股沟 皮下处，待肿瘤长致一定程度预示荷瘤裸鼠和BALB/c小鼠造模成功后，将动物分 成空白对照组、模型组、顺铂组、灵芝口服液高剂量组、灵芝口服液中剂量组、 灵芝口服液低剂量组，每组15只裸鼠和BALB/c小鼠。空白组和模型组灌胃给予生 理盐水，顺铂对照组给予腹腔注射顺铂水溶液，灵芝口服液各组灌胃给予相应剂 量药物，每天早晚各1次，连续给药60天(根据外观目测裸鼠和BALB/c小鼠的瘤 体生长情况和状态决定)。给药结束后检测动物体重、瘤体重量、脾脏系数、血 浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ，取瘤体进行HE染色病理分析。
4.统计方法
通过SPSS20.0软件进行处理，数据采用表示，单因素方差分析LSD检验 用于多组间比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。
5.实验结果
5.1动物一般情况
空白组裸鼠和BALB/c小鼠状态良好，模型组裸鼠和BALB/c小鼠萎靡不振，活 动减少，BALB/c小鼠毛发稀疏，裸鼠出现死亡几只的情况，而灵芝口服液各剂量 动物状态较好，无死亡且表现出动物与肿瘤共生状态。
5.2灵芝口服液对裸鼠胃癌荷瘤的影响
与空白组相比，模型组荷瘤瘤体明显增大，免疫器官脾脏明显缩小，血浆内 IL-1β，IL-6，TNF-ɑ表达明显升高，具有显著性差异。与模型组相比，灵芝口 服液各组瘤体未见缩小，但灵芝口服液高剂量能明显增加小鼠免疫器官脾脏的脏 器系数，余剂量可不同程度降低血浆中IL-1β，IL-6，TNF-ɑ的表达，顺铂对照 组能够明显减小瘤体，增加脾脏脏器系数，降低血浆内IL-1β，IL-6，TNF-ɑ的 表达，顺铂对照组总体表现优于灵芝口服液各剂量组。见表6
表6灵芝口服液对裸鼠胃癌荷瘤的影响(n＝10)
注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
灵芝口服液对裸鼠胃癌荷瘤影响的显微观测如图1所示。
5.3灵芝口服液对BALB/c小鼠胃癌荷瘤的影响
与空白组相比，模型组荷瘤瘤体明显增大，免疫器官脾脏明显缩小，血浆内IL-1β，IL-6，TNF-ɑ表达明显升高，具有显著性差异。与模型组相比，灵芝口服液各组瘤体未见 缩小，但灵芝口服液中、低剂量能明显增加小鼠免疫器官脾脏的脏器系数，余剂量可不 同程度降低血浆中IL-1β，IL-6，TNF-ɑ的表达，顺铂对照组能够明显减小瘤体，增加脾 脏脏器系数，降低血浆内IL-1β，IL-6，TNF-ɑ的表达，顺铂对照组总体表现优于灵芝口 服液各剂量组。见表7
表7灵芝口服液对BALB/c小鼠胃癌荷瘤的影响(n＝10)
注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
灵芝口服液对BALB/c小鼠胃癌荷瘤影响的显微观测如图2所示。
5.4灵芝口服液对裸鼠食道癌荷瘤的影响
与空白组相比，模型组荷瘤瘤体明显增大，免疫器官脾脏明显缩小，血浆内IL-1β，IL-6，TNF-ɑ表达明显升高，具有显著性差异。与模型组相比，灵芝口服液各组瘤体未见 缩小，但灵芝口服液高剂量能明显增加小鼠免疫器官脾脏的脏器系数。顺铂对照组能够 明显减小瘤体，增加脾脏脏器系数，降低血浆内IL-1β，IL-6，TNF-ɑ的表达，顺铂对照 组总体表现优于灵芝口服液各剂量组。见表8
表8灵芝口服液对裸鼠食道癌荷瘤的影响(n＝10)
注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
灵芝口服液对裸鼠食道癌荷瘤影响的显微观测如图3所示。
5.5灵芝口服液对BALB/c小鼠食道癌荷瘤的影响
与空白组相比，模型组荷瘤瘤体明显增大，免疫器官脾脏明显缩小，血浆内IL-1β，IL-6，TNF-ɑ表达明显升高，具有显著性差异。与模型组相比，灵芝口服液各组瘤体未见 缩小，但灵芝口服液中剂量能明显增加小鼠免疫器官脾脏的脏器系数，余剂量可不同程 度降低血浆中IL-1β，IL-6，TNF-ɑ的表达，顺铂对照组能够明显减小瘤体，降低血浆内 IL-1β，IL-6，TNF-ɑ的表达。见表9
表9灵芝口服液对BALB/c小鼠食道癌荷瘤的影响(n＝10)
注：与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
灵芝口服液对BALB/c小鼠食道癌荷瘤影响的显微观测如图4所示。
讨论
与模型组比较，灵芝口服液对荷瘤小鼠肿瘤生长未表现显著抑制作用，但动物生存 状态较好，表现出动物与肿瘤共生状态。免疫器官脾脏脏器系数优于模型组，可能具有潜在调节免疫器官功能降低炎症因子表达的作用。
实验7：灵芝口服液对实验性心肌缺血动物的保护作用研究
本研究采用冠脉结扎再灌注诱导大鼠心肌缺血实验性损伤，观察灵芝口服液干预对急性心肌缺血的保护作用。实验研究表明，灵芝口服液可以明显缩小由心肌缺血再 灌注损伤造成的心肌梗死区，明显升高由心肌缺血再灌注损伤造成的SOD含量下降， 降低由心肌缺血再灌注损伤造成的LDH升高。
一、实验材料
1实验动物
健康SD大鼠，雄性，体重300g±20g，由北京华阜康生物科技有限公司提供，动 物许可证号：SCXK(京)2020-0004，SPF级。饲养温度20～25℃，相对湿度40～70％。
2实验器材
HX-300呼吸机(成都泰盟科技公司)；BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科 技公司)；EL204万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；X-30R低温 高速离心机(美国BeckmanCoulter公司)；移液枪(德国Eppendorf股份公司)；恒 温水浴锅(上海双捷有限公司)；THZ-82水浴恒温振器；PCD-D8000电热恒温培养箱 (上海捷呈实创仪器有限公司)；Model680型酶标仪(上海伯乐生命医学产品有限公 司)；超低温冰箱(ThermoFisher公司)；非吸收性缝合线(宁波医用缝针有限公司)； 手术器械；小动物电热毯。
3试药
灵芝口服液；硝酸异山梨酯(云鹏医药集团有限公司，批号：G200405)；SOD、 LDH试剂盒(南京建成生物技术有限公司，批号：20210111、20210107))、CK试剂盒 (上海茁彩生物科技有限公司，批号：202102)；TTC染料(美国Sigma公司，批号： #BCCC3620)；PBS缓冲溶液(北京酷来搏科技有限公司，批号：SL301638200)，0.9％ 氯化钠注射液(山东齐都药业有限公司)。
二、实验方法
1动物分组及给药方案
随机选取健康SD大鼠36只，平均分为6组，每组6只。分别为假手术组，模型 组，硝酸异山梨酯组(9.45mg/kg)灵芝口服液低、中、高剂量组(6mL/kg、12mL/kg、 24mL/kg，分别相当于人体推荐剂量的6倍、12倍、24倍，人体每日推荐量为 60mL/60kg)。假手术组：等体积生理盐水灌胃2周后，开胸，但不结扎冠状动脉；模 型组：等体积生理盐水灌胃2周后，手术开胸，结扎冠状动脉，缺血1h，再灌注24h； 灵芝口服液高、中、低剂量组：灵芝口服液灌胃2周，3次/天。手术开胸，结扎冠状 动脉，缺血1h，再灌注24h；阳性药硝酸异山梨酯组：灌胃2周，3次/天。手术开胸， 结扎冠状动脉，缺血1h，再灌注24h。除假手术组外，其余五个组再灌注24h后再次 按相同剂量给药一次，再给药1h后股动脉取血装于有肝素钠的1.5mL塑料离心管中， 离心血浆，然后立即处死开胸腔取心脏。
2大鼠心肌缺血再灌注损伤模型(MIRI)的复制及血浆样品的制备
雄性SD大鼠术前禁食12h，腹腔注射10％水合氯醛(0.4ml/100g)，在麻醉起效后把大鼠仰卧位固定于专用的恒温动物手术台上。将针状电极插入左下肢、左上肢、右 上肢、右下肢监测标准Ⅱ导联心电图，分别记录缺血再灌注后的心电图。手术区用75％ 酒精消毒。连接动物呼吸机，待大鼠呼吸正常后，于胸骨左侧处做一开口，围切口做 一荷包缝，钝性分离皮下组织、肌肉及3-4肋间隙，暴露心脏， 挑开心包膜，于左心耳根部下方2mm处以6-0规格的丝线穿过冠状动脉左前降支(室 前降支)，迅速打活接结扎并将心脏送回胸腔，挤出胸腔的空气，拉紧荷包缝口打结缝 合肌肉和皮肤，撒适量头孢呋辛于伤口预防感染。术后将大鼠小心移至小动物电热毯 上，维持大鼠体温在37.0±0.5℃。缺血1h后进行再灌注操作，缓慢外拉打活结结扎 线头，恢复冠状动脉左前降支的供血。以结扎时ST段抬高，再灌注后抬高的ST段回 落大于50％视为造模成功。假手术组只开胸，但不结扎冠脉。于末次给药后经股动脉取 血约5mL置涂有肝素的塑料离心管中，6000rpm/min离心8min，分离血浆于-80℃冰箱 中保存待用，直至分析。
3心肌梗死比例测定
造模成功的MIRI大鼠，再灌注24h后按相同剂量给药一次，给药1h后经股动脉取全血 6000rpm，离心8min，取上清液血浆-80℃冷冻保存，然后开胸腔取心脏，并将标本放于 -20℃冷冻保存，沿心脏长轴方向以约2mm间隔切成5片的心肌横断向切片，除靠近主动脉 的第1片外其余4片放入1％TTC溶液，于水浴恒温振荡器37℃水浴10min，每隔5min钟翻动 一次，使其染色均匀。染色后红色区域为正常组织，苍白区域为梗塞组织。将心脏切片 有序排列，用相机采集图谱，将图片导入ImageJ软件分析计算每只动物所有切片梗死面 积与心肌切片总面积，计算梗死比例＝(梗死面积/心肌总面积)×100％。
4大鼠心肌缺血再灌注损伤生化指标的测定
血浆中SOD、LDH、CK的测定按照试剂盒说明书进行操作。
三、实验结果
1大鼠心肌缺血再灌注模型评价结果
1.1TTC染色
心脏TTC染色结果见图5(A：假手术组；B：模型组；C：硝酸异山梨酯组；D：高剂 量组；E：中剂量组；F：低剂量组)
TTC染色后，与假手术组相比，模型组大鼠心脏左心室出现梗死灶(TTC染色后呈苍白色)。通过ImageJ软件计算分析，假手术组未观测到心肌梗死，模型组心肌梗死比例 占51.87±5.17％，高于假手术组(P﹤0.001)，具有明显的梗死灶。口服液高、中、低和 阳性药组的心肌梗死比例分别为22.70±15.13％、27.58±14.83％、32.83±11.72％、17.93 ±6.04％，四组的心肌梗死比例均小于模型组(P﹤0.01)。实验结果表明，口服液可以明 显缩小由心肌缺血再灌注损伤造成的心肌梗死区。见图5、图6及表10。
表10对心肌缺血大鼠心肌梗死的影响(n＝6)
与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比，***P<0.001，**P<0.01
1.2心电图
与假手术组相比，模型组MIRI大鼠ST段变化在心肌缺血再灌注24小时后均明显升高(P<0.01)表明造模成功。与模型组比较，阳性药和口服液高、中、低三个剂量 组则无显著性差异。见图7和表11。
表11对心肌缺血大鼠ST段变化的影响(n＝6)
与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，ns无显著性差异
1.3对心肌缺血再灌注大鼠血浆中SOD的影响
与假手术组相比，模型组MIRI大鼠血浆中SOD在心肌缺血再灌注24小时后均明 显降低(P<0.01)表明造模成功。与模型组比较，口服液高、中、低三个剂量组MIRI 大鼠血浆中SOD在心肌缺血再灌注24小时候后均明显升高(P<0.01或P<0.05，P<0.001)。见图8及表12。
表12对大鼠血浆中SOD含量的影响(n＝6)
与假手术组相比，##P<0.01；与模型组相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05
1.4对心肌缺血再灌注大鼠血浆中LDH的影响
与假手术组相比，血浆中LDH在心肌缺血再灌注24小时候后均明显升高 (P<0.001)表明造模成功。与模型组比较，口服液高、中、低三个剂量组MIRI大鼠 血浆中LDH在心肌缺血再灌注24小时候后均明显降低(P<0.01)。见图9和表13。
表13灵芝口服液对大鼠血浆中LDH含量的影响(n＝6)
与假手术组相比，###P<0.001；与模型组相比，**P<0.01
1.5对心肌缺血再灌注大鼠血浆中CK的影响
与假手术组相比，血浆中CK在心肌缺血再灌注24小时后均明显升高 (P<0.001)说明造模成功。与模型组比较，阳性药和口服液高、中、低三个剂量组MIRI 大鼠血浆中CK在心肌缺血再灌注24小时后均无显著性变化，CK是由心肌分泌的，实 验又需要进行心肌染色，所以采用股动脉采全血方式进行实验，局部到整体的过程可 能造成CK量变得更少，造成其余几组没有显著性的变化。见图10和表14。
表14灵芝口服液对大鼠血浆中CK含量的影响(n＝6)
与假手术组相比，###P<0.01；与模型组相比，ns无显著性差异
四、总结及讨论
冠状动脉缺血性心脏病是指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭 窄或阻塞，冠状动脉供血减少而心肌耗氧量不断增加，血液以及氧气的供需失衡造成心肌缺血、缺氧甚至坏死而导致的心脏病。心血管疾病尤其是缺血性心脏病，治疗则 主要是以恢复冠状动脉的血液灌注为主，然而研究发现心脏组织在恢复血液灌注后损 伤比灌注前更加严重，即出现心肌缺血再灌注损伤现象。
心肌缺血再灌注使自由基的产生和清除失去平衡，氧自由基积聚使细胞膜发生脂质过氧化反应，破坏心肌超微结构及细胞膜的完整性，进一步加剧缺血心肌组织损伤。 SOD是抗氧化自由基的重要催化剂，其在体内的含量是反映氧化应激损伤程度的指标。 LDH、CK则主要存在于心肌细胞中，当心肌细胞受到损伤或坏死时能大量释放到血液中， 所以测定血中LDH、CK的含量可以有效地作为反映心肌坏死程度的指标。
本实验采用冠脉结扎法诱导SD大鼠心肌缺血，研究灵芝口服液对缺血性心脏治疗作用。通过实验研究表明灵芝口服液可以明显缩小由心肌缺血再灌注损伤造成的心肌 梗死区，明显改善由心肌缺血再灌注损伤造成的SOD下降，还能明显降低由心肌缺血 再灌注损伤造成的LDH含量升高，对CK和心电图ST段的改变无显著影响。
实验8：灵芝口服液对血瘀证动物血液流变学研究
本研究采用大鼠皮下注射盐酸肾上腺素、冰水游泳建立血瘀模型，通过观察各组大鼠在血瘀状态下的凝血酶时间(TT)、血液凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶 时间(APTT)和血液流变性等主要指标，探讨灵芝口服液抗血瘀作用。实验结果显示， 灵芝口服液对血瘀模型大鼠的TT、PT、APTT和血液流变学变化具有改善作用，提示灵 芝口服液在抗血瘀方面具有一定作用。
一、材料及方法
1实验动物
实验动物为SD大鼠60只，雌雄各半，体重180～220g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供生产许可证号为SCXK(渝)2017-0010，SPF级。饲养温度20～25℃，相对湿度 40～70％。
2主要仪器和试剂
凝血分析仪、全自动血液流变仪、低温高速离心机、微量移液器、超纯水机、制 冰机、电子天平、1mL注射器、1.5mL离心管、采血管、0.1％盐酸肾上腺素、生理盐水、 肝素钠、枸橼酸钠、水合氯醛、阿司匹林肠溶片、凝血酶时间(TT)试剂盒、血液凝 血酶原时间(PT)试剂盒、活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂盒。
3实验方法
3.1动物分组及给药：取SD大鼠60只，随机分成6组，每组10只。分别为正常对照组，模型组，口服液低、中、高剂量组(12mL/kg、24mL/kg、36mL/kg，分别相当于大鼠等 效量的2、4、6倍，人体每日推荐量为60mL/60kg)和阿司匹林肠溶片阳性药组(30mg/kg， 相当于人推荐量，人的推荐剂量为300mg/60kg，实验前称取适量阿司匹林肠溶片加生理 盐水混匀得浓度为2.5mg/mL的药液)。正常对照组大鼠灌胃生理盐水(12mL/kg)，其余 各给药组大鼠灌胃相应药物，每天给药2次，连续给药15d。
3.2建立血瘀证模型：于末次给药45min后，模型组和各给药组大鼠皮下注射0.1％盐酸 肾上腺素注射液(0.8mL/kg)2h后，将大鼠置于冰水中游泳5min，2h后，再一次皮下 注射盐酸肾上腺素注射液(0.8mL/kg)。以大鼠出现寒战，蜷缩少动，喜扎堆，反应迟 钝，耳色暗红，被毛竖立无光泽，爪尾部紫暗等症状来评价模型是否成功。
3.3指标检测：造模后禁食、自由饮水24h，再次给药15min后，大鼠使用10％水合氯醛麻醉，颈动脉取血800uL，全血与抗凝剂(枸橼酸钠)体积之比9∶1，根据试剂盒说 明书检测TT、PT和APTT水平。另颈动脉取血5mL，全血与抗凝剂(肝素钠)体积之比 9∶1，进行血液流变学检测。
二、实验结果
1对大鼠TT、PT和APTT的影响
结果见表15。与正常对照组比较，模型组的TT、PT和APTT均显著降低(P<0.05， P<0.01或P<0.01)。与模型组比较，各剂量组大鼠的TT、PT和APTT均不同程度增加， 其中低剂量口服液的TT、APTT，中、高剂量口服液组和阿司匹林组的TT、PT和APTT 具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
表15对大鼠TT、PT和APTT的影响(x±s，n＝10)
与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.01；与模型组比较，*P<0.05， **P<0.01；“-”代表无数据
2对大鼠全血黏度的影响
与正常对照组比较，模型组血液的低、中、高切黏度均显著增加(P<0.01或P<0.001)。 与模型组比较，低剂量口服液的中切黏度，中、高剂量口服液和阿司匹林的低、中、高 切黏度均显著降低(P<0.05，P<0.01或P<0.001)，见表16。
表16对大鼠血液黏度的影响(x±s，n＝10)
与正常对照组比较，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；“-”代表 无数据
3对大鼠全血还原黏度的影响
与正常对照组比较，模型组血液的低、中、高切还原黏度均显著增加P<0.05)。与模型组比较，高剂量口服液和阿司匹林的低、中、高切还原黏度均显著降低(P<0.05)。见 表17。
表17对大鼠全血还原黏度的影响(x±s，n＝10)
与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；“-”代表无数据
4对大鼠血浆黏度、红细胞比积和血沉方程K值的影响
与正常对照组比较，模型组血浆黏度、红细胞比积均显著增加(P<0.05)。与模型组比较，中、高剂量灵芝口服液的红细胞比积均显著降低(P<0.05)。见表18。
表18对大鼠血浆黏度、红细胞比积和血沉方程K值的影响(x±s，n＝10)
与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；“-”代表无数据 5对大鼠红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、红细胞变形指数和红细胞电泳指数的影响
与正常对照组比较，模型组红细胞电泳指数显著降低(P<0.05)。与模型组比较，中剂量口服液红细胞电泳指数显著增加(P<0.05)。见表19。
表19对大鼠红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、红细胞变形指数和红细胞 电泳指数的影响(x±s，n＝10)
与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；“-”代表无数据
三、总结及讨论
血瘀证是中医临床常见的一种证候，是许多心脑血管疾病发展的共同的病理生理过 程，如心肌梗死、冠心病、脑卒中等。中医辨证认为血瘀证患者的血液流变性具有黏、浓、凝、聚之共性，影响微循环中血液的正常灌流，甚至引起微循环障碍。采用大鼠皮 下注射盐酸肾上腺素、在冰水中游泳建立黏、浓、凝、聚状态的血瘀模型被广泛用于血 瘀证研究。本研究采用该血瘀模型，通过观察各组大鼠在血瘀状态下的TT、PT、APTT和 血液流变性等主要指标，探讨灵芝口服液的抗血瘀作用。实验结果显示，灵芝口服液对 血瘀模型大鼠的TT、PT、APTT和血液流变学的异常变化具有改善作用，可见灵芝口服液 在抗血瘀方面具有一定作用。
实验9：灵芝口服液对自发性高血压动物的保护作用研究
本研究以自发性高血压模型大鼠(SHR)为研究对象，观察灵芝口服液干预下对 模型动物的保护作用。实验研究表明，灵芝口服液明显降低模型动物收缩压，可降低 血清中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)，升高血清中一氧化氮(NO)等指标。 提示灵芝口服液对高血压模型动物有一定的保护作用。
一、材料及方法
1.实验动物
采用6～7周龄自发性高血压大鼠(SHR)，体重160～190g，♂，SPF级。6～7周龄Wistar-kyoto(WKY)大鼠，体质量170-200g，♂，SPF级，均由北京维通利华实验动 物技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006。动物合格证号分别为No.110011200109192931、No.110011200109193116。饲养 温度20～25℃，相对湿度40～70％。
2.主要仪器和试剂
大鼠无创血压测量分析系统(MRBP-RMC1，美国)、ALLEGRAX-30R型离心机(BECFMANCOULTER)、EL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、Model680 酶标仪(伯乐生命医学产品有限公司)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、内皮 素(ET-1)、NO试剂盒(南京建成生物技术有限公司)。
3.药物
灵芝口服液，阳性药：厄贝沙坦片(扬子江药业集团北京海燕药业有限公司)，批号：19031152；规格：每片75mg，成人临床日用量为150mg·d 1、0.9％氯化钠注射液 (山东齐都药业有限公司)。
二、实验方法
6～7周龄大鼠适应性饲养1周后测量血压及体重，将收缩压按照收缩压值随机分为 模型组、厄贝沙坦(阳性药)组和灵芝口服液低、中、高剂量组，每组8只，另设8只 WKY大鼠为空白对照组。厄贝沙坦片组按15.75mg·kg-1给药，每天给药1次；灵芝口服 液低、中、高剂量组大鼠分别按6，12，24mL·kg-1给药，分别相当于人体推荐剂量的 6倍、12倍、24倍，人体每日推荐量为1mL·kg-1，每天给药2次；模型组和空白对照组 分别给予等量生理盐水，每天灌胃2次；各组连续灌胃给药6周，每周测量1次血压及 心率。血压测量时，先将大鼠32℃预预适应15-30min后，将无创尾动脉血压测量仪的 加压感应器放在大鼠尾根部，并通过配套软件获取数据。每只大鼠在清醒安静状态下 测量3次，每次测量间隔5min，计算均值作为SHR大鼠血压值。于末次给药8h后，10％ 水合氯醛麻醉(0.3mL·kg-1)，股主动脉取血处死动物，取4ml以上全血，6000r·min-1低温离心机离心10min，分离血清，血清检测前-20℃冻存。检测生化指标，按酶联免 疫试剂盒所述方法分别测定并计算血清中醛固酮(ALD)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、内 皮素(ET-1)、NO水平。取心、肾、胸主动脉等脏器组织于中性福尔马林中保存。
三、实验结果
3.1口服液对SHR大鼠体重的影响
治疗前各组大鼠体重差异无统计学意义(P＞0.05)，表明各组大鼠体重均衡。由表1可知，在实验过程中大鼠体重正常增长，治疗前和给药6周口服液低、中、高剂量 组与对照组体重差异无统计学意义(P＞0.05)，表明口服液给予后大鼠体重整体增长 正常。结果见图11和表20。
表20连续给药6周大鼠体重的变化(mmHg，n＝8，)
与正常对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，**P<0.01；1)n＝7,2)代表n＝5,3)单位mg·kg-1；
“-”代表无数据
3.2灵芝口服液对SHR大鼠血压的影响
与模型组比较，给药1～6周口服液中、高剂量组大鼠收缩压明显下降(P<0.01或 P<0.05，P<0.001)；给药3～6周口服液低剂量组大鼠收缩压明显下降(P<0.01或P<0.05，P<0.001)。结果见图12和表21。口服液低、高剂量组给药后1～6周舒张压无明显下降，差 异无统计学意义(P＞0.05)；口服液中剂量组给药第1周和第5周舒张压明显下降(P<0.01 或P<0.05)。结果见图13和表22。
表21连续给药6周收缩压的变化(mmHg，n＝8，)
与正常对照组比较，###P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；1)
n＝7,2)n＝5,3)单位mg·kg-1；“-”代表无数据
表22连续给药6周舒张压的变化(mmHg，n＝8，)
与正常对照组比较，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
1)表示n＝7，2)表示n＝5，3)单位mg·kg-1；“-”代表无数据
3.3口服液对SHR大鼠心率的影响
与模型组比较，给药1～6周口服液中剂量组大鼠心率无明显变化，差异均没有统计学 意义(P＞0.05)；给药第2周口服液高剂量组大鼠心率显著降低P<0.01)；给药第3周和第6 周口服液低剂量组大鼠心率显著性升高(P<0.01)。结果见图14和表23。
表23连续给药6周心率的变化(次/min，n＝8，)
与正常对照组比较，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；1)n＝7，2)n＝5，3)单位mg·kg-1；“-” 代表无数据
3.4对血清AngⅡ、ET-1、ALD、NO含量的影响
与空白对照组相比，模型组AngⅡ、ET-1、ALD水平明显升高(P<0.01或P<0.05， P<0.001)；NO水平明显降低(P<0.001)。与模型组相比，口服液低、中剂量组AngⅡ的水 平显著降低(P<0.05)，口服液低剂量组ALD的水平显著降低(P<0.05)，口服液低、中剂 量组显著升高NO的水平(P<0.001)。结果见图15-18和表24。
表24对SHR大鼠血清分泌AngⅡ、ET-1、ALD、NO的影响(x±s，n＝8)
与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001；1)n＝7，2)n＝5，3)单位mg·kg-1；“-”代表无数据
四、总结及讨论
血管紧张素亦称血管收缩素、血管张力素、是一种寡肽类激素，是肾素-血管紧张素 系统(RAS)的重要组成部分。血管紧张素能引起血管收缩，升高血压；促进肾上腺皮质释放ALD。血管紧张素分为血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、血管紧张素Ⅲ。其中AngⅡ是 一种强烈的血管收缩剂，能使全身小动脉收缩而升高血压。同时使血管舒张剂缓激肽失 活，导致周围血管收缩与硬化，局部血管力增高，在高血压的发病过程中起重要作用。 本研究发现口服液低、中、高剂量组均可以降低自发性高血压大鼠血清中AngⅡ含量，且 只有口服液低、中剂量组的AngⅡ相对于模型组有统计学差异(p<0.05)。口服液低剂量 组可使ALD的水平显著降低，相对于模型组有统计学差异(p<0.05)。ET-1是一种强缩血 管物，NO能够扩张血管平滑肌调节血压，NO、ET-1两者具有拮抗效应，对维持血管的舒 缩功能有重要意义。本研究发现灵芝口服液低、中、高剂量组均可以升高NO的水平，其 中低、中剂量组的NO含量相对于模型组有统计学差异(p<0.001)。
研究结果显示，口服液能够有效降低自发性高血压大鼠血压(收缩压降压效果显著)，明显降低大鼠血清中AngⅡ、ALD的含量，升高血清中NO含量的作用，其降压作 用可能与AngII、ALD的降低和NO水平增加有关。
实验10：灵芝口服液对缺氧动物模型的保护作用研究
本研究选用四种缺氧小鼠模型进行研究，通过观察各组小鼠在缺氧、缺血状态 下的存活时间，探讨灵芝口服液的抗缺氧保护作用。实验结果显示，灵芝口服液能 使缺氧及急性脑缺血小鼠的存活时间显著延长，表明灵芝口服液能提高小鼠的耐缺 氧能力。
一、材料及方法
1实验动物
实验动物为昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由北京华阜康生物科技有限公司 提供生产许可证号为SCXK(京)2020-0004，SPF级。饲养温度20～25℃，相对湿度40～70％。
2主要仪器、试剂及药物
250ml磨口瓶、秒表、凡士林、钠石灰、滤纸、亚硝酸钠、1mL注射器、剪刀、电子 天平、灵芝口服液。
3实验方法
3.1常压耐缺氧实验：取昆明种小鼠100只，随机分成5组，每组20只。分别为空白对照 组，灵芝口服液低、中、高剂量组(10mL/kg、20mL/kg、40mL/kg，分别相当于人体推 荐量的10、20、40倍，人体每日推荐量为60mL/60kg)和普萘洛尔阳性药组(40mg/kg， 相当于人推荐量的10倍，人的推荐剂量为240mg/60kg，实验前称取适量普萘洛尔加生理 盐水混匀得浓度为22.22mg/mL的药液)。空白对照组小鼠灌胃生理盐水(10mL/kg)，其 余各给药组小鼠灌胃相应药物，每天给药2次，连续给药15d。于末次给药1h后，分别将 小鼠放入盛有5g钠石灰的250mL磨口瓶内(瓶内放碱石灰5g以吸收CO2和H2O，垫滤纸以吸 收尿液，广口瓶用前均盛水校正容量，每瓶放一只小鼠)，用凡士林封瓶口防止漏气， 以最后一次呼吸为死亡指标，观察并记录每只小鼠从封口到呼吸停止的时间，即存活时 间。
3.2亚硝酸钠中毒存活实验：给药及分组同上，于末次给药1h后每只小鼠按200mg/kg剂 量腹腔注射亚硝酸钠(注射量为0.1mL/10g)，立即计时，记录动物存活时间。
3.3急性脑缺血性缺氧实验：给药及分组同上，于末次给药1h后用剪刀从双耳连线处快 速断，立即按秒表逐只记录小鼠断头后张口喘气持续时间。
3.4异丙肾上腺素增加心肌耗氧量实验：取昆明种小鼠120只，随机分成6组，每组20只。 第一、二组为空白对照组，第三、四、五组为灵芝口服液低、中、高剂量组(10mL/kg、20mL/kg、40mL/kg)，第六组为普萘洛尔阳性药组(40mg/kg)。空白对照组小鼠灌胃生 理盐水(10mL/kg)，其余各给药组小鼠灌胃相应药物，每天给药2次，连续给药15d。于 末次给药1h后，除第一组外均腹腔注射异丙肾上腺素15mg/kg。分别放入放入盛有5g钠 石灰的250mL磨口瓶内，密封，每瓶放一只小鼠，记录小鼠存活时间。
二、结果
1.1一般状态观察
在实验过程中，小鼠活动正常、呼吸平稳、皮毛光滑、少数口鼻处见分泌物，实验中无小鼠死亡。图19所示为各组小鼠实验中体重情况，实验初期各组小鼠体重无统计学 差异，各组动物初始体重均衡。实验过程中小鼠体重增长正常，中期体重和结束时体重 与对照组比较无统计学差异，体重变化见表25～28，表明灵芝口服液灌胃后，实验期间 动物发育正常，未见毒性及异常生长情况。
表25常压耐缺氧组小鼠体重
与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。下同。
表26亚硝酸钠中毒组小鼠体重
表27急性脑缺血组小鼠体重
表28对抗异丙肾上腺素组小鼠体重
1.2口服液对小鼠常压耐缺氧能力的影响
小鼠放入磨口玻璃瓶并密封后，活动由正常逐渐减少，呼吸逐渐变得急促、最后抑制，口唇逐渐变得甘紫，临终前反跳，最后死亡。表29可见，结果显示，灵芝口 服液和普萘洛尔可以明显延长小鼠常压密闭缺氧条件下的存活时间，其中中、高剂量 组口服液能显著延长小鼠常压耐缺氧时间，与溶剂对照组(生理盐水)比较差异有统 计学意义(P<0.05或P<0.01)。
表29对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响(x±s，n＝20)
1.3口服液对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响
腹腔注射亚硝酸钠后，起初活动正常、呼吸平稳，随着时间延长，小鼠活动逐渐减少、呼吸先急促后抑制、最后停止呼吸，尾部颜色逐渐变暗。表30可见，各剂量组小鼠 亚硝酸钠中毒后存活时间均不同程度延长，与对照组比较，中、高剂量组小鼠亚硝酸钠 中毒后存活时间延长有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
表30对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响(x±s，n＝20)
1.4口服液对急性脑缺血小鼠耐缺氧时间的影响
高剂量的口服液能显著延长小鼠快速断头喘息时间，与空白对照组比较差异有统计 学意义(P<0.01)(表31)。
表31对急性脑缺血小鼠耐缺氧时间的影响(x±s，n＝20)
1.5口服液对小鼠注射异丙肾上腺素增加心肌耗氧量的影响
结果见表32，中、高剂量的口服液能显著延长小鼠对异丙肾上腺素增加心肌 耗氧量时间，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
表32对小鼠注射异丙肾上腺素增加心肌耗氧量的影响(x±s，n＝20)
三、总结及讨论
缺氧、缺血可引起机体产生多种应激反应。缺氧时机体能量代谢会发生障碍，从而导致重要器官正常生理功能受损(尤其是心、脑等耗氧耗能较大的器官)。本研究选用 几种经典常用，且较为稳定的缺氧、缺血动物模型，通过观察小鼠在缺氧、缺血状态下 的存活时间，探讨药物保护作用。实验结果显示，该口服液能使缺氧及急性脑缺血小鼠 的存活时间显著延长，具有一定的对抗实验性缺氧、缺血效果。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但 不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
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