阅读说明：本技术 δ样配体1用于诊断严重感染 (Ligand 1 for diagnosing severe infection ) 是由 达格玛·希尔德勃兰特 克劳斯·黑格 弗洛里安·乌勒 马库斯·韦根 于 2018-10-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于体外诊断严重感染的方法,该方法包括确定生物样品中的δ样配体1蛋白或编码δ样配体1蛋白的核苷酸序列,其中δ样配体1蛋白的表达水平升高或编码δ样配体1蛋白的核苷酸序列的水平升高则表明严重感染；本发明还涉及δ样配体1蛋白作为用于体外诊断严重感染(如脓毒症)的生物标志物的应用。(The present invention relates to a method for in vitro diagnosis of a severe infection, the method comprising determining in a biological sample a ligand-1-like protein or a nucleotide sequence encoding a ligand-1-like protein, wherein an elevated level of expression of ligand-1-like protein or an elevated level of the nucleotide sequence encoding ligand-1-like protein is indicative of a severe infection; the invention also relates to the use of the ligand 1-like protein as a biomarker for the in vitro diagnosis of severe infections (such as sepsis).)

δ样配体1用于诊断严重感染

技术领域

本发明涉及δ样配体1作为生物标志物在严重感染的诊断中的应用，并且涉及通过控制生物样品中δ样配体1的水平在体外快速诊断严重感染(如脓毒症)的方法。

背景技术

生物标志物是生物体的可测量特征，其反映特定的生理状态。在医学中，生物标志物通常是从生物组织中分离出来的化合物，可以用作特定疾病状态的存在或严重程度的指标，或监测所用干预措施的有效性。

生物标志物在疾病的诊断和可能的预后中、以及在监测疾病的进展或对治疗的反应中特别有用。理想的生物标志物应易于获得和测量，并且在对疾病具有高的灵敏度和特异性方面应该是可靠的。

严重的感染(尤其是脓毒症)是应特别避免的医学病症，但对其没有高度可靠的生物标志物。严重感染(包括脓毒症)的特点是由失调的针对感染的免疫反应而诱发的威胁生命的器官衰竭，并且/或者会引起由失调的针对感染的免疫反应而诱发的威胁生命的器官衰竭。在脓毒症中，由微生物病原体引发的宿主反应在病理综合征中达到高峰，该综合征的特征是炎症过度和随后的免疫抑制。

尽管重症监护医学和抗微生物治疗取得了稳步改进，但这种感染仍然是全世界所有年龄段重症监护病房死亡的主要原因。为了改善结局并且同时避免不必要的抗生素治疗，用于诊断严重感染的快速、可靠的检测是必不可少的。

脓毒症是一种严重的威胁生命的感染。到目前为止，血液培养仍是诊断脓毒症的金标准，但是血液培养需要时间，而且许多具有脓毒症征兆和症状的患者的血液培养为阴性。因此，迫切需要一种用于诊断严重感染、特别是用于诊断脓毒症的补充方法。

文献“C.Pierrakos and J.-L.Vincent(2010)Critical Care,14:R15”描述了本领域已知的生物标志物可用于鉴定或排除脓毒症。这些生物标志物包括针对细胞因子/趋化因子、细胞、受体、凝聚物、血管内皮损伤、血管舒张、器官功能障碍和急性期蛋白的各种生物标志物。该文献没有提及Notch配体，特别是δ样配体1。

文献“Van Engelen等人，(2018)“Biomarkers in Sepsis”,Critical CareClinics,34(1):129-152”描述了用于诊断脓毒症的各种生物标志物，并且特别指出系统生物学的生物组学领域(即基因组学、表观遗传学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学)是具有前景的用于发现新型生物标志物的工具。

WO 2016/145426 A1描述了一种使用CEACAM1、ZDHHC19、C9orf95、GNA15、BATF、C3AR1、KIAA1370、TGFBI、MTCH1、RPGRIP1和HLA-DPB1的表达水平作为生物标志物来诊断脓毒症的方法。

US 2005/059093 A1描述了一种用于检测Notch信号通路的调节剂的方法，其包括以下步骤：在存在和不存在候选调节剂的情况下，监测免疫系统的细胞中的Notch信号通路，以及确定候选调节剂是否调节Notch信号通路。

WO 2017/004159 A1描述了与可溶性生物分子结合并抑制该可溶性生物分子的生物学活性以抑制靶标或病原体与其他分子或细胞相互作用的组合物。其中提到Notch配体(包括δ样配体1(DLL1))对治疗或预防动脉粥样硬化、钙化主动脉瓣狭窄、心力衰竭、中风和癌症特别有用。为了治疗或预防与由病原体引起的感染相关的脓毒症，WO 2017/004159A1提出选择性结合TNFα、白介素1、白介素6、白介素8、白介素12、干扰素γ、巨噬细胞游走抑制因子、GM-CSF和/或凝血因子。

US 2006/140943 A1描述了Notch信号通路调节剂在制备药物中的用途，该药物用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)以及由移植物(例如器官、组织和/或细胞的移植物(例如骨髓移植物))引起或与之相关的疾病和病症，其中所述调节剂用于降低免疫系统细胞的反应性。

WO 2012/092539 A2描述了针对DLL4的抗体和用于治疗与DLL4相关的疾病的方法，所述疾病例如为细胞增生性疾病或与血管生成有关的病理学病症。WO 2012/092539 A2描述了血管生成失调可导致赘生性和非赘生性疾病，并将脓毒症指定为许多此类非赘生性疾病之一。

US 9,731,024 B2和US 2017/0240590 A1描述了将水溶性聚合物与治疗性蛋白质的经氧化的碳水化合物部分缀合的材料和方法。许多蛋白质被列为治疗性蛋白质，其中之一是δ样蛋白1。

目前，一些生物标志物被用来诊断严重感染，例如脓毒症。急性期蛋白前降钙素(PCT)和C反应蛋白(CRP)以及白细胞计数已被最广泛地使用。

但是，PCT和CRP的有效性受到其对于脓毒症缺乏特异性和灵敏度的限制。特别地，仍然难以将脓毒症与其他非感染性原因的炎症进行区分。因此，需要新的具有更高可靠性的脓毒症生物标志物。

发明内容

本发明所基于的问题是提供一种可用于以高可靠性水平诊断严重感染的生物标志物。

该问题通过使用δ样配体1蛋白(DLL1)或编码δ样配体1蛋白的核苷酸序列作为用于体外(离体)诊断严重感染的生物标志物来解决。因此，患者的生物样品中δ样配体1蛋白或编码δ样配体1蛋白的核苷酸序列的水平升高则表明存在严重感染。

此外，本发明涉及一种用于体外诊断严重感染的方法，该方法包括确定生物样品中的δ样配体1蛋白或编码δ样配体1蛋白的核苷酸序列，其中δ样配体1蛋白的表达水平升高或编码δ样配体1蛋白的核苷酸序列的水平升高则表示感染。

令人惊讶的是，发现δ样配体1作为严重感染(特别是脓毒症)的生物标志物具有高可靠性水平。本发明的所述诊断性生物标志物的优点是更早的感染诊断、及时的治疗和改善的疾病结果。还会减少与检测其他生物标志物相关的不必要成本，而这些其他生物标志物显示出比δ样配体1更低的灵敏度和选择性。

具体实施方式

δ样蛋白是单次跨膜蛋白，其在Notch信号通路中的作用是已知的，其是首次在果蝇中描述的Notchδ配体的同系物。DLL-1的别名是δ样配体1、δ样蛋白、H-δ,1、果蝇δ同系物1、δ样经典Notch配体1、DL1、Notch配体δ样1。在哺乳动物中存在三种δ样基因，其编码δ样配体1(DLL1编码DLL1)、δ样配体3(DLL3编码DLL3)和δ样配体4(DLL4编码DLL4)，所有配体均包含一个被称为DSL(δ，锯齿状，Lag2)结构域的保守的富含半胱氨酸的区域、几个表皮生长因子(EGF)样重复和一个跨膜结构域。δ样配体1蛋白的氨基酸序列和编码δ样配体1蛋白的核苷酸序列是已知的。例如，DLL1的氨基酸序列在文献“American Journal of Pathology,Vol.154,No.3,March 1999,785-794”或在国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_005609.3)有所描述。人类直系同源物(orthologue)的染色体定位是6q27。

本发明中使用的δ样配体1蛋白可以是由核苷酸序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少80％、优选85％或90％同一性的核苷酸序列编码的蛋白。

此外，δ样配体1蛋白可以是与氨基酸序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％同一性、特别是95％同一性的蛋白。

如本文中用于本发明目的的术语δ-配体1蛋白还包括DLL1的天然存在的切割产物。根据本发明的天然存在的切割产物包括细胞外切割产物、跨膜切割产物和细胞内切割产物。在优选的实施方案中，天然存在的切割产物是细胞外切割产物。因此，术语δ-配体1蛋白还包括基本上由SEQ ID NO:2蛋白的N-或C-末端片段组成的多肽，其在严重感染、特别是脓毒症时升高。因此，术语DLL1蛋白包括翻译后修饰的、天然蛋白水解的和加工的DLL1蛋白，其还包括可溶性的、不溶性的DLL1蛋白和SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的DLL1蛋白的天然同工型(UniProtKB–O00548(DLL1_HUMAN)。DLL1的这种合适的天然切割产物由(例如)氨基酸SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:7表示。SEQ ID NO:4代表可溶性DLL1蛋白。SEQ ID NO:5代表与DLL1蛋白胞内结构域连接的DLL1蛋白的跨膜结构域。SEQ ID NO:6代表DLL1蛋白的胞内结构域。SEQ ID NO:7代表DLL1蛋白的跨膜结构域。

术语DLL1蛋白还包括通过例如磷酸化、甲基化、乙酰化和糖基化修饰的蛋白。

在本发明中，确定了DLL1蛋白的水平和/或DLL1核苷酸序列的水平。如本文所用，术语核苷酸序列可以指DNA、cDNA、RNA或mRNA。编码DLL1蛋白或DLL1蛋白同工型的核苷酸序列也可以是RNA水平的剪接变体。这样的剪接变体例如为缺乏所述序列的N-末端或C-末端的核苷酸序列。

根据本发明的一个实施方案，当使用DLL1核苷酸序列作为用于诊断感染的生物标志物或将其用于体外诊断感染的方法中时，DLL1的表达水平升高则指示严重感染。用于确定表达水平的DLL1的示例性核苷酸序列是SEQ ID NO:1。

标记为SEQ ID NO:1的核苷酸序列DLL1的参照是人(Homo sapiens)的DNA序列。然而，显然本发明不限于人，而是扩展到所有哺乳动物。

如本文所用，术语“升高”是指与对照相比水平升高。对照可以是任何未感染的生物样品或系统。通常，对照与感染的生物样品或系统属于同一物种。手术之前的患者和/或脓毒症或其他严重感染发病之前的患者可以(例如)作为对照。医学和医学生物学领域的技术人员能够容易地确定可将表达水平与之相比的合适的对照。通常，DLL1的升高量可以是DLL1的浓度明显超出了对照的标准偏差值。根据一个优选的实施方案，DLL1的升高量是对照样品的平均值的标准偏差值的两倍(特别是三倍)浓度。对照样品平均值的标准偏差值的三倍提供了特别好的结果。

或者，对于确定DLL1的升高量或对于诊断严重感染，当根据本发明检测患者样品时，确定一个临界值并考虑该临界值对于诊断脓毒症也是有益的。临界值使得可以区分具有严重感染或没有严重感染的患者组。对于严重感染为脓毒症的情况，合理的临界值为每毫升约36331pg DLL1蛋白。对于严重感染为脓毒症的情况，特别有利的诊断临界值可以为每毫升约29,538pg DLL1蛋白。

DLL1的表达水平可以在任何生物样品中进行测定。如本文所用，术语“生物样品”包括整个生物体或生物体的任何部分。通常，从生物体中取出生物样品用于离体分析。生物样品可以包括单细胞和/或细胞培养物和/或组织培养物。生物样品还包括但不限于组织，例如上皮组织、肌肉组织、结缔组织和神经组织。生物样品可以包括例如全血、血沉棕黄层、血浆、血清、外周血单个核细胞(PBMCS)、中性粒细胞、单核细胞、T细胞、尿、脊髓液、淋巴液、皮肤的外部分泌物、眼泪和/或唾液。

在本发明的一个实施方案中，由单个细胞或细胞培养物测定DLL1的表达水平。特别地，所述细胞或细胞培养物可以包含免疫系统的细胞。通常，所述细胞或细胞培养物包含免疫细胞。优选地，所述细胞是白细胞。更优选地，所述细胞是单核细胞。优选地，所述细胞培养物包含白细胞。更优选地，所述细胞培养物包含单核细胞。

在另一个实施方案中，由组织测定DLL1的表达水平。优选地，由血液样品测定DLL1的表达水平。如本文所用，术语“血液”包括全血、血浆和血清。优选地，由血浆样品测定DLL1的表达水平。

在一个优选的实施方案中，由取自患者的血浆样品测定并确定DLL1的表达水平。如本文所用，术语“患者”包括处于严重感染或脓毒症风险中的人和非人类哺乳动物。通常，患者是经过手术的人或动物。

可以使用任何合适的方式来测定蛋白质表达。通常，使用免疫测定法测定和确定蛋白质表达。优选地，使用针对特定蛋白或多肽序列的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定和确定蛋白质的表达。蛋白质表达水平也可以使用免疫印迹测定法(例如蛋白质印迹测定法)、质谱法、ELISpot或流式细胞术和免疫组织化学技术来测定和确定。

可以使用任何合适的测定核苷酸表达的方式来测定DLL1的表达水平。例如，可以通过进行微阵列分析、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、Northern印迹、Southern印迹或基因表达系列分析(SAGE)来测定表达。

严重感染是特别需要避免的医学病症，其可导致由失调的针对感染的免疫反应而引发的危及生命的器官衰竭。严重感染的例子为脓毒症、肺炎和脑膜炎。

附图说明

图1蛋白质印迹。从健康供体的血液中分离出CD14⁺单核细胞，并用1×10⁶个细菌/mL(大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis))进行体外感染，或用100ng/mL的脂多糖(LPS)进行刺激。两个小时后，用庆大霉素杀死细菌。对照细胞(-)未经处理。第二天制备细胞裂解物。对于蛋白质印迹分析，将等量的蛋白质裂解物进行印迹，并用针对DLL1或肌动蛋白(上样对照)的抗体进行探测。

图2示出了注射(i.p.)有LPS(n＝16)或NaCl(n＝15；对照组)的12周龄小鼠的ELISA结果。注射后二十四小时采集血液样品，并通过小鼠DLL-1ELISA对血浆浓度进行定量(p≤0.0001；曼-惠特尼U检验)。

图3示出了首次确认脓毒症症状后立即(t0)、第24小时(t24)、第48小时(t48)和第168小时(t168)从脓毒症患者(n＝50)中采集的血浆样品中的(A)DLL-1或(B)DLL-4表达水平的ELISA分析，以及来自健康供体(健康；n＝20)和腹部手术后对照患者(OP后48h(“OPt2”；n＝20)的血浆样品的ELISA结果。***p≤0.0001；曼-惠特尼U检验。

图4示出了(A)脓毒症患者在t0时相对于对照患者的白细胞的ROC分析；(B)脓毒症患者在t0时相对于对照患者的CRP水平的ROC分析；C)脓毒症患者在t0时相对于对照患者的DLL-1水平的ROC分析；D)脓毒症患者在t0时相对于健康志愿者的DLL-1水平的ROC分析；E)脓毒症患者在t0时相对于对照患者的DLL-4水平的ROC分析；F)脓毒症患者在t0时相对于健康志愿者的DLL-4水平的ROC分析。AUC＝曲线下面积。

图5示出在三个独立的临床研究中(群组1(A)，群组2(B)，群组3(C)；更多的研究细节请参见实施例4)对以下受试者血浆样品中的DLL-1蛋白水平的ELISA分析：脓毒症患者(“脓毒症”；群组1：n＝30，群组2：n＝50，群组3：n＝100)；广泛内脏手术后的对照患者(“OP后”；群组1：n＝30，群组2：n＝20)；和健康受试者(“健康”；群组1：n＝30，群组2：n＝20)。***p≤0.0001；曼-惠特尼U检验。

图6示出了严重创伤后(n＝38)，纳入研究后立即(“初始”)、纳入研究后24小时(“24h”)和纳入研究后48小时(“48h”)(最晚在临床症状出现后24h之内)采集的患者群组血浆样品中DLL-1蛋白水平的ELISA分析(A)。对在体外循环下接受心脏手术的患者群组(n＝25)进行同样的研究(B)。示出了术前(“OP前”)，体外循环后4小时(“ECC后4h”)和体外循环后24小时(“ECC后24h”)的蛋白水平。这些患者群组在任何时间点都没有显示出感染征兆。

图7示出了血浆样品中DLL-1蛋白水平的ROC分析(脓毒症患者：n＝327；对照：n＝377)。AUC＝曲线下面积。

图8示出了从健康供体血液中分离出的CD14⁺单核细胞，该单核细胞经100ng/mlLPS刺激或被10⁸个大肠杆菌/10⁶个单核细胞感染。两个小时后，用庆大霉素杀死细菌。对照细胞(-)未经处理。第二天制备细胞裂解物。对于蛋白质印迹分析，将等量的蛋白质裂解物进行印迹，并用针对DLL1或肌动蛋白(上样对照)的抗体探测。

以下实施例用于具体参考特定的实施方案和附图进一步解释本发明，然而，这些实施例并不旨在限制本公开。

实施例

实施例1–δ样配体1在体外检测细菌感染

本实施例的目的是核实在脓毒症患者中Notch配体DLL1是否会被上调，从而可以用作潜在的生物标志物。使用脓毒症相关细菌的体外感染模型。在实验设置中，我们用不同的革兰氏阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯式肺炎菌)和革兰氏阳性菌(粪肠球菌)感染健康供体的血液来源单核细胞两个小时，然后用抗生素杀死细菌。此外，用TLR4激动剂脂多糖(LPS)刺激细胞，TLR4激动剂脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的成分，其在血流中循环时会引起脓毒性休克。孵育过夜后，制备感染的和LPS刺激的细胞裂解物以进行蛋白质印迹分析，从而检测DLL1。实验细节说明如下。

细胞分离和培养-通过密度梯度离心法(Biocoll分离液，1.077g/ml，BiochromAG，柏林，德国)从健康供体的新鲜血液或血沉棕黄层中分离出外周血来源的单个核细胞。细胞用PBS洗涤3次，并通过autoMACS分离器(autoMACS，程序：possel，Miltenyi Biotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)阳性选择磁性标记的CD14+细胞，补充100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、含10％热灭活胎牛血清(FCS，Promocell，海德堡，德国)，置于37℃，5％CO₂存在的潮湿气氛中。

细菌培养-分别将大肠杆菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏肺炎菌和粪肠球菌在37℃、5％CO₂的潮湿气氛中培养过夜。第二天，将每种培养物中的一个克隆转移至胰蛋白酶大豆肉汤培养基中，在37℃下持续搅拌2小时，之后通过吸收测定将细菌悬液调至10⁸/mL RPMI的浓度。

体外感染-将1×10⁶个经分选的CD14⁺单核细胞以1mL RPMI/10％FCS铺于24孔板格式中。用1×10⁶细菌/mL感染细胞，或用toll样受体4(TLR4)激动剂脂多糖(100ng/ml LPS)刺激细胞。两个小时后，将100ng/mL庆大霉素(PAA Laboratories,Inc)添加到细菌培养物中以杀死细菌。

将感染细胞和LPS刺激的细胞孵育过夜后，制备细胞裂解物，并使用肌动蛋白作为对照进行蛋白质印迹分析。

蛋白质印迹分析-在含有蛋白酶抑制剂(cOmpleteTM，Roche，曼海姆，德国)和磷酸酶抑制剂(PhosSTOPTM，Roche)的RIPA裂解缓冲液中裂解2×10⁶细胞。然后通过10％SDS-PAGE将细胞裂解物分离并电转移至硝酸纤维素膜(Whatman Protran硝酸纤维素膜；neoLab，海德堡，德国)上。封闭(TBS/0.05％Tween-20/5％BSA)和洗涤(TBS/0.05％Tween)步骤后，用针对DLL-1和β-肌动蛋白的抗体(Cell Signaling Technology公司)进行免疫印迹。用化学发光法增强检测(ECL；Perkin Elmer，格罗宁根，荷兰)。

图1显示，在所有LPS刺激的单核细胞和细菌感染的单核细胞中都可以高度检测到δ样配体1蛋白，但在对照细胞中没有检测到δ样配体1蛋白。因此，δ样配体1蛋白适于检测革兰氏阳性致病源和革兰氏阴性致病源的细胞感染。

实施例2–在小鼠脓毒症模型中δ样配体1上调

正如我们已经看到的那样，活化的DLL1高度富含于体外细菌感染的单核细胞中，因此在小鼠内毒素脓毒症模型中检测了Notch配体的情况。LPS(准确地说是LPS的脂质部分)也称为内毒素，常用于脓毒症动物模型中。在重症患者中，浓度升高的血清内毒素与脓毒症的发展、疾病严重程度和死亡率相关。内毒素在人类脓毒症发病机理中起重要作用的理论得到了以下观察的支持：抗生素治疗可导致大量内毒素从死亡细菌中突然释放，并导致病情恶化。本实施例将12周龄的雄性小鼠用于实验目的。

对十二周龄的雄性小鼠腹膜内注射LPS的脂质部分(n＝16)或NaCl(n＝15；作为对照)。24小时后抽血。收集无细胞的上清液，利用商业ELISA检验(abcam)按照标准方案分析小鼠δ样配体1蛋白的水平。

图2显示，与对照小鼠相比，LPS感染小鼠的血液中δ样配体1蛋白升高。DLL1在小鼠脓毒症模型中上调。因此，δ样配体1蛋白适于检测脓毒症体内动物模型的血液中的与LPS相关的感染。

实施例3–脓毒症患者的δ样配体1上调

本研究纳入了50名患者，所有患者在腹部手术后均表现出严重的脓毒症征兆。脓毒症是根据脓毒症救治指南(Surviving Sepsis Campaign)的标准定义的。仅包括至少18岁的非怀孕患者。进一步的排除标准包括自身免疫性疾病。入选后，在确认脓毒症的最初征兆(“t0”)之后、24小时后(“t24”)，48小时后(“t48”)和168小时后(“t168”)，直接从脓毒症患者中抽取血液样品。

20名接受腹部手术但无脓毒症征兆的对照患者(“OP t2”)在手术后48小时抽血。招募了20名健康志愿者(“健康”)作为未进行手术的对照，并抽血一次。

使用商业ELISA试验(DLL1-DLL4-biocat)按照标准方案分析血浆中人δ样配体1蛋白和人δ样配体4蛋白的水平。使用曼-惠特尼U检验对蛋白质水平进行统计分析。

图3A显示，与健康对照和接受腹部手术但未表现出脓毒症征兆的患者相比，诊断为脓毒症的患者血液中的δ样配体1蛋白升高。

图3B显示，与健康对照和接受腹部手术但未感染的患者相比，诊断为脓毒症的患者血液中的δ样配体4蛋白没有升高或没有显著升高。

因此，δ样配体1蛋白(而不是密切相关的δ样配体4蛋白)适于检测腹部手术后患者血液中脓毒症的存在，并且适于将感染的患者与健康对照和非感染的患者区分开。

利用受试者工作特征(ROC)曲线分析针对δ样配体1蛋白和δ样配体4蛋白所收集的数据。计算ROC曲线下面积(AUC)，并将数据与已建立的白细胞计数临床相关标志物和CRP进行比较。具体而言，对于白细胞，ROC曲线t0相对于Op t2的曲线下面积(AUC)为0,511(临界值20.73/nl)(图4A)，对于CRP为0,795(临界值175.1mg/ml)(图4B)。DLL1脓毒症t0相对于OPt2的AUC为0.991(临界值36331pg/ml)，脓毒症t0相对于健康组的AUC为1.0(临界值25269pg/ml)。因此，与常规使用的生物标志物CRP和白细胞计数相比，用DLL-1进行感染预测要可靠得多。与OP t2相比，DLL4ROC分析的AUC为0,696(临界值1084pg/ml)(图4E)，而与健康对照相比，则为0,655(临界值639.3pg/ml)(图4F)。

实施例4–脓毒症患者的δ样配体1上调

其次，通过ELISA对各研究中收集的血浆样品进行了δ样配体1(DLL1)浓度的二次分析。总体上，对来自按照以下方案列出的三个独立群组的180名成年脓毒症患者(参见图5中的“脓毒症”)进行分析：“[德国临床试验注册参考编号]/[伦理投票参考编号](责任委员会)”：

-群组1：[DRKS00012446]/[S-200/2017](德国海德堡)，n＝30(请参见图5A)

-群组2：[DRKS00005463]/[S-097/2013](德国海德堡)，n＝50(请参见图5B)。

-群组3：[DRKS00008090]/[S-247/2014](德国海德堡)，n＝100(请参见图5C)。

对于所有三个群组，在研究入选时(“初始”)采集样品，并且对于群组1和2，在研究入选后的24h(“24h”)和48h(“48h”)采集样品。所有患者均根据脓毒症-2共识标准(2≥SIRS标准，结合临床疑似或已证明感染；群组1和2)或脓毒症-3共识标准(SOFA评分变化2≥分，结合临床疑似或已证明感染；群组3)进行招募。

另外，群组1和2招入了在广泛内脏手术后在此研究期间的任何时间点都未显示出感染征兆的患者(参见图5中的“OP后”；群组1：n＝30，群组2：n＝20)以及健康志愿者(“健康”；群组1：n＝30，群组2：n＝20)。

群组2对应于实施例3中描述的相同群组。因此，图5B中的数据值与图3A中的数据值相同。

进一步的对照包括38例严重创伤后的患者群组([DRKS00010991]/[164/14](德国吉森)；见图6A)和25例在体外循环下进行心脏手术的患者群组([S-112]/2018](德国海德堡)；见图6B)。

使用GraphPad Prism(6.0版，GraphPad Software Inc.)进行数据分析。散点图用于可视化。对于组的比较，使用非参数曼-惠特尼U检验，并且p值<0.05被认为是显著的。****标记p值<0.0001。

为了评价DLL1的诊断价值，将脓毒症患者的所有样品(所有时间点，来自180位患者的n＝327个样品)合并，并利用ROC分析与对照组的所有样品(所有时间点，n＝377个样品；327个样品来自于113名对照患者，50个样品来自于50名健康志愿者)进行比较。利用约登指数程序((灵敏度+特异性)-100)计算最佳临界值。

上面给出并用于合并ROC分析的327(脓毒症)和377(对照)样品数是因为在观察期间患者出现流失(主要是由于脓毒症患者死亡以及手术或严重创伤后患者出院)。详细的样品编号如下：

群组1

脓毒症：30/30/27(初始/24h/48h)

OP后：30/29/28(初始/24h/48h)

健康：30

群组2

脓毒症：50/46/44(初始/24h/48h)

OP后：20/20/20(初始/24h/48h)

健康：20

群组3

脓毒症：100(初始)

严重创伤

38/36/31(初始/24h/48h)

心脏外科

25/25/25(OP前/ECC后6h/ECC后24h)

招募后一开始，群组1、2和3中脓毒症患者的平均血浆浓度分别为60,292pg/ml(95％CI：47,820-72,765；n＝30)，106,126pg/ml(95％CI：90,102-122,149；n＝50)和56,064pg/ml(95％CI：49,494-62,634；n＝100)(见图5A-C)。在t＝24h时，群组1和群组2脓毒症患者的平均血浆浓度分别为53,027pg/ml(95％CI：41,824-64,229；n＝30)和104,944pg/ml(95％CI：89,786-120,101；n＝46)。在t＝48h时，群组1和群组2脓毒症患者的平均血浆浓度分别为49,485pg/ml(95％CI：39,766-59,205；n＝27)和88,999pg/ml(95％CI：75,490-102,508；n＝44)。在手术后的相应时间点，脓毒症患者和对照(即对照患者和健康受试者)之间的水平高度显著不同。

在检测的所有时间点，对照创伤患者群组(见图5A和5B中的“OP后”以及图6A中的所有数据)和心脏手术前后的患者(见图6B)中的DLL1浓度显著低于脓毒症患者。

群组1中，对照手术患者(“OP后”)在t＝初始、t＝24h和t＝48h时的平均血浆浓度分别为14,193pg/ml(95％CI：12,385-16,001；n＝30)、19,550pg/ml(95％CI：14,536-24,565；n＝29)和17,721pg/ml(95％CI：15,498-19,944；n＝28)。

在群组2中，对照手术患者(“OP后”)在t＝初始、t＝24h和t＝48h时的平均血浆浓度分别为13,548pg/ml(95％CI：11,275-15,821；n＝20)、16,187pg/ml(95％CI：13,409-18,964；n＝20)和19,287pg/ml(95％CI：13,618-24,955；n＝20)。

在图6A中，对照严重创伤患者在t＝初始、t＝24h和t＝48h时的平均血浆浓度分别为19,119pg/ml(95％CI：16,892-21,345；n＝38)、19,224pg/ml(95％CI：17,184-21,263；n＝36)和20,409pg/ml(95％CI：16,351-24,468；n＝31)。

在图6B中，对照心脏手术患者在t＝初始、t＝24h和t＝48h时的平均血浆浓度分别为13,846pg/ml(95％CI：10,633-17,059；n＝25)，14,603pg/ml(95％CI：11,356-17,850；n＝25)和22,194pg/ml(95％CI：18,497-25,891；n＝25)。

在所有检测的时间点，健康对照(参见图5A和5B中的“健康”)的DLL1浓度明显低于脓毒症患者。健康对照和对照患者之间没有显著差异。在群组1和群组2中，所检测的健康对照的平均血浆浓度分别为11.928pg/ml(95％CI：10,645-13,211；n＝30)和16,737pg/ml(95％CI：14,542-18,932；n＝20)。

分组为脓毒症(n＝327)或对照(n＝377)的所有可用样品的受试者工作曲线(ROC)分析得出，曲线下面积(AUC)为0.9555(95％CI：0.9401-0.9710)；见图7)。发现最佳诊断临界值为29,538pg/ml，灵敏度为88.7％，特异性为93.4％。

实施例5–Delta样配体1切割产物在体外检测细菌感染

跨膜蛋白DLL1在结合到其受体后被切割。细胞外结构域释放到环境中。跨膜(TM)结构域和胞内(IC)结构域(TMIC-DLL1)在细胞内保持连接。进一步的切割事件可释放IC-DLL1，其将迁移到细胞核。为了研究TMIC-DLL1是否可以用来证实感染，通过蛋白质印记分析在体外检测了被感染的原代单核细胞中的切割产物。

用革兰氏阴性大肠杆菌(E.coli)感染或用LPS刺激从健康供体血液中分离出来的原代单核细胞，LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，其激活TLR4信号通路。感染后2小时用庆大霉素杀死细菌。第二天，裂解并分析感染细胞/经LPS处理的细胞。

分离人原代单核细胞-通过密度梯度离心(Biocoll分离溶液，1.077g/ml，Biochrom AG，柏林，德国)从健康供体的新鲜血液或血沉棕黄层中分离PBMC。将CD14⁺细胞用磁珠(MiltenyiBiotec)进行磁性标记，然后通过autoMACS分离器(autoMACS，程序：possel，Miltenyi Biotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)进行两次选择。在37℃、5％CO₂存在下的潮湿气氛中，在补充有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％热灭活的胎牛血清(Promocell，海德堡，德国)的RPMI 1640(Sigma-Aldrich，陶夫基兴，德国)中培养纯化的单核细胞(1×10⁶细胞/ml)。

细菌培养-在37℃、5％CO₂的湿润气氛中，将大肠杆菌(ATCC25922)在哥伦比亚血羊琼脂上培养过夜。第二天，将每种培养物的1个菌落转移到TSB(胰蛋白酶大豆肉汤)培养基中，并在200rpm/37℃的持续摇动下培养至对数中期。

体外感染-将1×10⁶个经分选的CD14⁺单核细胞以1ml RPMI/10％FCS铺于24孔板格式中。用10⁸个大肠杆菌/10⁶个单核细胞感染细胞。2小时后，加入庆大霉素至终浓度为100ng/ml以杀死细菌。第二天，裂解细胞并进行分析。

蛋白质印迹分析-收获2×10⁶个细胞并用PBS洗涤。对于全细胞裂解物，在50μlRIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4；1％Igepal；0.25％脱氧胆酸钠；150mM NaCl；1mMEDTA；1mM PMSF；抑肽酶、亮抑肽酶和胃酶抑素各1mg/ml；1mM Na₃VO₄；和1mM NaF)中裂解单核细胞。将样品涡旋并在冰上温育30分钟。然后以14,000×g离心20分钟以清除(cleared)裂解物。等量的裂解物用于SDS-PAGE分离(12.5％)。在用半干法转移到硝酸纤维素膜(Whatman Protran硝酸纤维素膜；neoLab，海德堡，德国)上后，将后者用含5％(w/v)BSA的TBS/0.1％(v/v)Tween-20在RT.下封闭2h。用抗体进行检测：抗-DLL1，抗-β肌动蛋白(CellSignaling Technology，丹佛斯，马塞诸塞州，美国)。检测基于增强的化学发光法(ECL；Perkin Elmer，格罗宁根，荷兰)。

图8显示，在LPS刺激的单核细胞和大肠杆菌感染的单核细胞中，可高度检测到δ样配体1蛋白的TMIC(连接胞内结构域的跨膜结构域)切割产物，但在对照细胞中未检测到TMIC切割产物。因此，跨膜结构域和胞内结构域DLL1切割产物适于检测感染，特别是革兰氏阴性致病源感染。