阅读说明：本技术 大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法 (Method for establishing rat fear stress and gaseous pollutant composite exposure model ) 是由 田蕾 刘晓华 袭著革 李康 杲修杰 刘焕亮 林本成 来文庆 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于动物模型建立技术领域,本发明公开了一种大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法。所述的方法包括如下步骤：(1)建立恐惧模型：选取180-220g健康雄性wistar大鼠,置于密闭环境中,给予75dB:1000Hz声音信号,在声音信号末尾3s同时给予1mA足底电流刺激,每日重复周期20次,其余时间正常饲养自由食水；持续六周；(2)建立恐惧应激与气态污染物复合暴露模型：将完成恐惧模型建立的大鼠进行气态污染物吸入,每天吸入时间为4小时,持续30天；(3)采样检测。本发明的方法复合了两种有害因素,对人体毒性危害进行评价。(The invention belongs to the technical field of animal model establishment, and discloses a method for establishing a rat fear stress and gaseous pollutant composite exposure model. The method comprises the following steps: (1) establishing a fear model: selecting 180-220g healthy male wistar rats, placing the rats in a closed environment, giving a 75dB 1000Hz sound signal, giving 1mA plantar current stimulation at the same time for 3s at the tail of the sound signal, repeating the cycle for 20 times every day, and normally feeding free edible water in the rest time; lasting for six weeks; (2) establishing a fear stress and gaseous pollutant composite exposure model: sucking gaseous pollutants into the rat which is built by the fear model, wherein the sucking time is 4 hours every day and lasts for 30 days; (3) and (5) sampling and detecting. The method of the invention combines two harmful factors and evaluates the toxicity hazard of human body.)

大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法

技术领域

本发明涉及动物模型建立技术领域，具体涉及一种大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法。

背景技术

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的

发明内容

，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。

潜艇舱室密闭空间中各种物理和化学等有害因素种类多，且同时存在。能够给艇员造成各方面不同程度的影响，产生生理指标的变化、心理问题出现，引起各种病症发生。

潜艇作业环境有害气体来源于潜艇大量使用的非金属材料以及烹调食物、艇员自身代谢产物、机器运行等产生，如一氧化碳、二甲苯、丙烯醛、硫化氢等。

潜艇艇员在执行任务、尤其是长时间深度潜航任务中，所面对的深海中密闭空间作业安危，以及各种训练和艇内外突发状况等，会存在恐惧应激状态的心理负荷，与其他有害因素并存产生身心影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法，本发明的方法复合了两种有害因素，对人体毒性危害进行评价。

一种大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)建立恐惧模型：选取180-220g健康雄性wistar大鼠，置于密闭环境中，给予75dB:1000Hz声音信号，在声音信号末尾3s同时给予1mA足底电流刺激，每日重复周期20次，其余时间正常饲养自由食水；持续六周；

(2)建立恐惧应激与气态污染物复合暴露模型：将完成恐惧模型建立的大鼠进行气态污染物吸入，每天吸入时间为4小时，持续30天；

(3)采样检测。

进一步的，所述的气态污染物为二甲苯。

进一步的，大鼠吸入的二甲苯的浓度为0.38ppm。

进一步的，大鼠吸入的二甲苯的浓度为3.8ppm。

进一步的，所述的采样检测包括一般行为，冻结时间百分比，中枢神经系统，免疫系统和内分泌系统。

本发明具有如下有益效果：

本发明方法建造了一个稳定长效的条件反应恐惧模型，染毒和恐惧通过特定的条件信号相关联，达到两种有害因素复合，将恐惧应激与潜艇密闭空间作业环境中主要存在的气态污染物这两种因素复合起来，研究恐惧应激状态下吸入有害气体对动物生理行为等健康状况的影响，进而探讨对人体毒性危害评价。

附图说明

图1为本发明中对照组C与模型组F冻结时间百分比(FT％)图；

图2为本发明中对照组C与模型组F体重增长趋势图；

图3为本发明中对照组C与模型组F运动轨迹显示探索行为对比图；

图4为本发明恐惧应激对机体影响检测结果图；

图5为本发明恐惧应激对机体影响检测结果图；

图6为本发明恐惧应激对机体影响检测结果图；

图7为本发明恐惧应激对机体影响检测结果图；

图8为本发明恐惧应激对花生四烯酸代谢影响检测结果图；

图9为本发明中海马区病理检测结果图；

图10为本发明中大脑皮层病理检测结果图；

图11为本发明中大脑杏仁核检测结果图；

图12为本发明中肠病理检测结果图；

图13为本发明中肝病理检测结果图；

图14为本发明中血液中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)检测结果图；

图15为本发明中血液中皮质酮(CORT)检测结果图；

图16为本发明中血液中促肾上腺皮质激素(ACTH)检测结果图；

图17为本发明中血液中去甲肾上腺素(NE)检测结果图；

图18为本发明中脑组织乙酰胆碱(ACH)检测结果图；

图19为本发明中脑组织多巴胺(DA)检测结果图；

图20为本发明中脑组织5-羟色胺(5-HT)检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

一种大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法，所述的方法包括如下步骤：

(1)建立恐惧模型：选取180-220g健康雄性wistar大鼠，置于密闭环境中，给予75dB:1000Hz声音信号，在声音信号末尾3s同时给予1mA足底电流刺激，每日重复周期20次，其余时间正常饲养自由食水；持续六周；

(2)建立恐惧应激与气态污染物复合暴露模型：将完成恐惧模型建立的大鼠进行气态污染物吸入，每天吸入时间为4小时，持续30天；

(3)采样检测。

第一阶段使用恐惧实验箱组造模，将实验动物处于相对封闭的环境中，给予特定频率的声音信号，音频末尾几秒同时给予足底电刺激，使动物产生恐惧状态。造模过程中动物产生条件反应恐惧，这种特定音频就是诱导动物出现恐惧状态的条件，即听到该音频就会产生恐惧状态。通过长时间的造模实验，加固这种条件反射，形成相对长时的记忆，以便下一步复合染毒实验的时间。

在本发明的一些实施例中，所述的气态污染物为二甲苯。

在本发明的一些实施例中，大鼠吸入的二甲苯的浓度为0.38ppm。

在本发明的一些实施例中，大鼠吸入的二甲苯的浓度为3.8ppm。

在本发明的一些实施例中，所述的采样检测包括一般行为，冻结时间百分比，中枢神经系统，免疫系统和内分泌系统。

实施例1

一种大鼠恐惧应激与气态污染物复合暴露模型的建立方法，所述的方法包括如下步骤：

购入SPF级130-150g健康雄性wistar大鼠60只(北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK-(京)2016-0006)，进行适应性饲养(清洁级动物房，25℃)，自由食水。

流程如下：

180-220g健康雄性wistar大鼠随机分为恐惧模型组(F)和对照组(C)两组，尾部标记编号，称重记录。依据试验条件，计划试验流程，设置仪器程序模板。F组给予75dB:1000Hz声音信号，在声音信号末尾3s同时给予1mA足底电流刺激，C组只有声音信号不给予电刺激，每日各组重复周期20次。其余时间正常饲养自由食水。验持续至F组动物恐惧状态稳定。仪器记录主要为运动轨迹和冻结时间等数据。达到预期的恐惧状态后，依照研讨所需复合气态污染物4h时长，继续进行恐惧记忆消退的实验(周期为20min的程序，循环12次，每组时程4h/d，只有声音信号无电刺激)。处理动物及采样。

具体过程如下：

将动物随机分组。将其中56只实验动物分为恐惧复合高浓度染毒组(FH)8只，高浓度染毒组(CH)8只，恐惧复合低浓度染毒组(FL)8只，低浓度染毒组(CL)8只，恐惧无染毒组(FC)8只，空白对照组(C)8只，恐惧模型组(F)8只，剩余4只备用空白对照。分笼饲养，每笼4只，笼编号分别为FH1/FH2/CH1/CH2/FL1/FL2/CL1/CL2/FC1/FC2/C1/C2/F1/F2/C，动物尾部标记分组与数字。

编号带有F实验动物的条件性恐惧模型的造模方法、实验设备、实验流程：给予75dB:1000Hz声音信号，在声音信号末尾3s同时给予1mA足底电流刺激，C组只有声音信号不给予电刺激，每日各组重复周期20次。其余时间正常饲养自由食水，持续至F组动物恐惧状态稳定。

在完成建模后，继续进行条件性恐惧状态复合二甲苯吸入的模型动物实验。二甲苯设置高、低两个浓度，分别为3.8ppm、0.38ppm，同浓度染毒分为恐惧染毒组、对照染毒组进行。

分别对应恐惧复合高浓度染毒组(FH)8只，高浓度染毒组(CH)8只，恐惧复合低浓度染毒组(FL)8只，低浓度染毒组(CL)8只。对应笼编号为FH1/FH2/CH1/CH2/FL1/FL2/CL1/CL2。

条件性恐惧实验系统(北京众实迪创科技有限公司ZS-KJ，含LabMaze动物行为学分析软件及视频与计算机)、二甲苯气体(武汉纽瑞德特种气体有限公司，10L罐内450ppm，0.7MPa)、动物气体染毒仪(北京慧荣和科技有限公司，HRH-CSED-K)、泵吸式二甲苯检测仪(郑州君达仪器仪表有限公司，JA908)、小音箱(播放制作的音频文件：每周期20min内的第19min40s末，开始持续20s的75dB:1000Hz的声音信号直至此周期结束，循环12次，总时程4h)、小风扇(用于染毒箱内空气流动改善环境)、充电池(用于给检测器、小音箱、小风扇的备用供电)。

染毒流程如下：

每批两组四笼共16只实验动物按照浓度和分组使用小动物染毒箱进行环境二甲苯吸入。

每批实验时间均为4h，高低浓度组每天分为上、下午各进行一批，持续30d。

每批的4h实验过程中，以二甲苯检测仪实时监测、并适时维持箱体内二甲苯气体浓度。

4h过程中同时以小音箱播放制作的音频信号，模型组动物间歇产生恐惧状态。

以小风扇产生空气流动改善箱体内环境，以充电池及时为风扇、音箱、检测器备电。

FC组(笼编号FC1/FC2)动物，每天4h仅听音频信号。

完成模型实验后处理动物采样及检测。

这里要说明的是：条件性恐惧实验系统(北京众实迪创科技有限公司ZS-KJ，含LabMaze动物行为学分析软件及视频与计算机)、二甲苯气体(武汉纽瑞德特种气体有限公司，10L罐内450ppm，0.7MPa)、动物气体染毒仪(北京慧荣和科技有限公司，HRH-CSED-K)、泵吸式二甲苯检测仪(郑州君达仪器仪表有限公司，JA908)、小音箱(播放制作的音频文件：每周期20min内的第19min40s末，开始持续20s的75dB:1000Hz的声音信号直至此周期结束，循环12次，总时程4h)、小风扇(用于染毒箱内空气流动改善环境)、充电池(用于给检测器、小音箱、小风扇的备用供电)。

恐惧应激模型的指标测定结果：

为保持后期复合二甲苯吸入模型动物的条件反应恐惧状态，进一步进行了恐惧记忆消退时间的实验，冻结时间百分比如图1所示，统计结果显示至10W后恐惧模型组F动物的冻结时间百分比仍显著高于对照组C。说明无电刺激仅通过声音信号产生的条件反应恐惧记忆可维持后续至少4W，可以保障复合染毒实验的恐惧状态。通过对分组动物体重的记录统计，结果显示长时间实验过程中恐惧模型组F和对照组C的动物体重增长趋势并无显著差异。

进展良好，随着建模时间的推进，动物行为变化明显。运动轨迹显示探索行为下降，恐惧状态产生。连续监测6W冻结时间显示恐惧模型组F显著高于对照组C，条件性恐惧动物模型成功建立。

两个实验中通过对分组动物体重的记录统计结果如图2所示，结果显示长时间实验过程中恐惧模型组F和对照组C的动物体重增长趋势并无显著差异。

参见图3，模型组与空白对照组的运动轨迹显示大鼠的探索行为下降。

图4-7说明了：恐惧应激可引起机体肠道菌群的显著改变，差异贡献度最大的物种依次为：厚壁菌门Firmicutes、拟杆菌门Bacteroidetes和变形菌门Proteobacteria。

由图8可以看出，恐惧应激可造成机体脂代谢方面的异常，影响了花生四烯酸的代谢过程。

海马区病理检测结果如图9所示，从图9可以看出，FC组部分神经元固缩深染，并可见神经纤维缠结。FL组部分神经元固缩深染，并可见神经纤维缠结。

大脑皮层的病理检测结果如图10所示，从图10可以看出，F组大脑皮层整体结构正常，神经元排列紊乱，可见大量神经元固缩深染，尼式小体模糊不清；未见间质疏松水肿及微血管充血扩张，组织未见明显炎症细胞浸润。FC组神经元排列整齐，未见间质疏松水肿，可见微血管轻微充血扩张。FL组神经元排列紊乱，可见大量神经元固缩深染，如图所示；未见间质疏松水肿及微血管充血扩张，组织未见明显炎症细胞浸润。CL组神经元排列紊乱，神经元数量较少，可见少量神经元固缩深染。

大脑杏仁核的病理检测结果见图11，从图11可以看出，CL组胶质细胞明显增生。

肠的病理检测结果见图12，FC、FL、FH组可见少量肠绒毛上皮脱落坏死，粘膜下层可见轻度水肿。

肝的病理检测结果见图13，FL组肝窦间隙明显增大，肝窦间隙可见明显瘀血

血液中下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴相关神经激素CRH、ACTH和CORT的检测结果参见图14-16，引起大鼠下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴相关神经激素CRH、ACTH和CORT含量的升高，说明机体产生了应激反应；神经递质中DA，NE，5-HT和ACH分泌水平的改变，可能会引起焦虑与失眠，检测结果参见图17-20。

本发明方法已成功建立并评估了条件反应恐惧应激动物模型，完成稳定可重复的造模方法，且对模型动物无明显躯体创伤。实验结果显示使用前期建模方法，预期后续每组4h/d染毒时程中，无电刺激仅通过声音信号产生的条件反应恐惧记忆可维持至少4W。进展良好，完成了恐惧造模。

本发明建立的动物模型，可以反应封闭环境下人在恐惧应激和有害气体的条件对人体的影响，为潜艇艇员在所面对的深海中密闭空间作业安危，以及各种训练和艇内外突发状况等作出真实的模拟，从而对今后改善潜艇员的工作环境提供理论基础，同时，本发明方案给出了双重因素对人体影响的详细方案，为将来做多个因素对人体的影响的研究奠定了基础。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。