一种无载体mRNA递送方法
阅读说明：本技术 一种无载体mRNA递送方法 (Carrier-free mRNA delivery method ) 是由 喻国灿 戚少龙 于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种无载体mRNA递送方法。本发明方法包括：通过金属阳离子和mRNA分子的配位驱动自组装效应合成无载体Metal-mRNA纳米微粒,进而实现所述mRNA分子的递送。本发明涉及一种普适性无载体的mRNA递送技术,该技术无需负载材料对mRNA进行包裹,而是借助金属离子与mRNA间的超分子配位效应完成自组装,具有敏感的微环境响应,良好的分散稳定性,高效的mRNA递送效率及低生物毒性和良好的生物安全性。另外,本技术简单易行,具有普适性,适合广泛的金属离子与不同核酸分子量长度,不同核酸序列的mRNA配位组装及递送,易于临床推广,在mRNA治疗领域具备广阔的应用前景。(The invention discloses a carrier-free mRNA delivery method. The method comprises the following steps: synthesizing carrier-free Metal-mRNA nano particles by coordination-driven self-assembly effect of Metal cations and mRNA molecules, and further realizing delivery of the mRNA molecules. The invention relates to a universal carrier-free mRNA delivery technology, which does not need a loading material to wrap mRNA, but completes self-assembly by virtue of a supermolecule coordination effect between metal ions and the mRNA, and has sensitive micro-environment response, good dispersion stability, high-efficiency mRNA delivery efficiency, low biotoxicity and good biological safety. In addition, the technology is simple and feasible, has universality, is suitable for wide metal ion and mRNA coordination assembly and delivery of different nucleic acid molecular weight lengths and different nucleic acid sequences, is easy for clinical popularization, and has wide application prospect in the field of mRNA treatment.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术、纳米医药、超分子化学及mRNA递送
技术领域
，具体涉及一种无载体mRNA递送方法，具体是一种通过金属离子和mRNA分子的配位驱动自组装合成无载体Metal-mRNA纳米材料的制备方法及应用。背景技术
与DNA基因疗法类似，基于RNA的疗法是全球医学创新的最新举措，并且有很大潜力。RNA疗法从自1978年首次提出反义治疗(antisense therapy)概念到1998 年首款反义寡核苷酸(ASO)药物fomivirsen获批上市，再到2006年RNA干扰(RNA interference，RNAi)机制研究获得了诺贝尔生理学或医学奖，以及2020年，以ASO 药物Milasen为代表的超个体化药物技术入选MIT Technology Review十大突破技术， RNA疗法的发展之路曲折且漫长。RNA疗法指利用具有治疗疾病功能的核酸从根源上调控致病基因表达的疗法。RNA疗法又可进一步细分为以下三大方向：1、编码治疗性蛋白或抗原的信使RNA疗法(Messenger RNA，mRNA)；2、以核酸为靶向，抑制致病性RNA活性或激活基因活性的小核酸疗法，包括反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)、小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)、微小RNA(micro RNA，mi RNA)等疗法；3、以蛋白质为靶向，调控蛋白质活性的RNA适配体(aptamer) 疗法。
mRNA疗法的原理是向靶细胞导入外源mRNA，使靶细胞自行合成目标蛋白。 mRNA疗法设计制备简便、安全性较高，与传统基因疗法相比，mRNA的表达由于无插入基因组的风险而较为安全，与以蛋白质为靶点的传统靶向药物相比，mRNA疗法研发周期短、候选靶点丰富。更重要的是，mRNA药物不局限于分裂细胞，没有整合宿主基因组的风险，且会在体内自动降解。目前mRNA疗法凭借其高效、安全、丰富的治疗特点已广泛应用于罕见病、肿瘤、感染性疾病等多种疾病的治疗。
mRNA疗法的研发生产一般包括测序、靶点确定、序列设计和优化、递送技术研究、核酸合成、纯化、制剂及生产等过程，目前核酸设计和制备工艺相对成熟，而向人体各组织细胞中高效递送mRNA是发挥其治疗功能的关键，也是mRNA疗法的主要技术难点。目前，递送技术难点包括：①核酸不稳定，易被血浆和组织中的核糖核酸酶(RNase)降解，被肝脏和肾脏快速清除；②核酸自身及载体材料的免疫原性问题，从而引发一系列副作用；③核酸带负电荷使其不易跨过同样为负电的细胞膜进入细胞质；④被“卡”在体内无法释放。此外，如何实现靶向递送也是当下研究的重点。而上述几点的解决方案又集中在mRNA药物制备的三个环节中，分别涉及体外转录、化学修饰和递送载体，而这其中最难的，或者说最能构建技术壁垒的是药物的递送系统。因此，合理设计纳米递送技术，对提高治疗基因的运载和治疗效率具有重要意义。
目前，用于递送mRNA载体的技术主要包括脂质体纳米颗粒载体技术和多聚体载体技术，其中脂质体是应用最为广泛的主流载体材料，其主要包括阳离子脂质体复合物、脂质体聚合物、脂质体纳米粒(lipid nanoparticle，LNP)、阳离子纳米乳等。阳离子聚合物已广泛用于核酸递送，例如poly(L-lysine)，PEI，DEAE-dextran，PBAE和壳聚糖。在最简单的形式中，阳离子聚合物与核酸过量混合形成静电结合的阳离子聚合物。虽然已经开发出许多聚合物，但是它们在核酸递送方面不如脂质纳米粒先进。LNP 递送技术在临床上已经获得了不错的成绩，但LNP载体技术仍有巨大的提升空间，比如LNP存在过敏反应、易氧化降解、制备重现率差等问题。另外，以LNP为载体制备的mRNA制剂会在肝脏及脾脏聚集，难以靶向其他部位，在临床使用上存在潜在的毒副作用。近年来研究表明，脂质体纳米材料中的PEG成分虽能有效延长半衰期，改善水溶性，但越来越多的证据证实，大量应用PEG有可能引发PEG“窘境”，加快PEG 修饰纳米药物的体内清除速率，严重影响PEG化纳米药物的疗效。因此，开发简便、通用、高效的方法来合成具有特定形貌和功能的纳米尺度的mRNA纳米递送体系对于各种应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种无载体mRNA递送方法。
第一方面，本发明要求保护一种无载体mRNA递送方法。
本发明要求保护的无载体mRNA递送方法，可包括如下步骤：
(A1)通过金属阳离子和mRNA分子的配位驱动自组装效应合成无载体金属 -RNA纳米微粒(以下简称Metal-mRNA)；
(A2)以所述无载体Metal-mRNA纳米微粒的方式实现所述RNA分子的递送。
其中，步骤(A1)中所述无载体金属-mRNA纳米微粒具体可按照如下第二方面所述方法进行制备。
第二方面，本发明要求保护一种制备无载体Metal-mRNA纳米微粒的方法。
本发明要求保护的制备无载体Metal-mRNA纳米微粒的方法，可包括如下步骤：
(B1)将目的mRNA和金属阳离子按照电荷比为500/1至1/500的比例混合；
(B2)将所述(B1)处理后的体系于37-60℃(如55℃)静置后自然冷却；
(B3)将所述(B2)处理后的体系进行离心，收集沉淀物即为所述无载体 Metal-mRNA纳米微粒。
进一步地，步骤(B1)中，所述目的mRNA和所述金属阳离子的电荷比可为100/1 至1/10。
更进一步地，所述目的mRNA和所述金属阳离子的电荷比可为1：2。
进一步地，步骤(B1)中，将所述目的mRNA和所述金属阳离子混合可通过如下实现：将含有所述金属阳离子的水溶液滴加到所述目的mRNA水溶液中，搅拌 1-10min(如1min)。
进一步地，步骤(B2)中，所述静置的时间可为1.5-4h(如3h)。
进一步地，步骤(B2)中，所述自然冷却后的温度为室温。
进一步地，步骤(B3)中，进行所述离心前还可包括用去离子水对所述(B2)处理后的体系进行洗涤的步骤。
进一步地，步骤(B3)中，所述离心为10000-15000转/分(如12000转/分)，离心5-10min(如5min)。所述离心可在室温进行。
进一步地，步骤(B3)中，进行所述离心后还可包括将所述沉淀物分散在去离子水中保存的步骤。
在上述第一方面和第二方面中，所述金属阳离子的价位可为+2至+8(如+2，+4)；所述金属阳离子为能够参与RNA的磷酸根配位反应且可被生物利用的任何金属阳离子。
进一步地，所述金属阳离子可选自如下：Ca2+、Zr4+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、 Cu2+、Al3+或/和Hf4+等。所述金属阳离子可为单一金属阳离子，也可以不同金属阳离子混合使用。
进一步地，所述mRNA可为裸mRNA或经过修饰的mRNA。其中，所述修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化。
在本发明的
具体实施方式
中，所述目的mRNA具体为如下mRNA：Mouse IL-10，Human EPO，SV40 NLS-Cas9，NLS-Cre，Mouse ECD，EGFP，Luciferase。
在本发明的具体实施方式中，当所述金属阳离子为Ca2+时，所述“含有所述金属阳离子的水溶液”具体为CaCl2水溶液。更加具体的，所述CaCl2水溶液中CaCl2的浓度为798mM。相应地，所述目的mRNA为EGFP mRNA。更加具体的，所述EGFP mRNA 水溶液的浓度为1mM。步骤(B1)中，所述EGFP mRNA水溶液和所述CaCl2水溶液的用量配比为1000μL：1000μL，电荷比为1:2。
在本发明的具体实施方式中，当所述金属阳离子为Al3+时，所述“含有所述金属阳离子的水溶液”具体为AlCl3水溶液。更加具体的，所述AlCl3水溶液中AlCl3的浓度为798mM。相应地，所述目的mRNA为EGFP mRNA。更加具体的，所述EGFP mRNA 水溶液浓度为1.5mM。步骤(B1)中，所述EGFP mRNA水溶液和所述AlCl3水溶液的用量配比为1000μL：1000μL，电荷比为1:2。
在本发明的具体实施方式中，当所述金属阳离子为Zr4+时，所述“含有所述金属阳离子的水溶液”具体为ZrF4水溶液。更加具体的，所述ZrF4水溶液中ZrF4的浓度为798mM。相应地，所述目的mRNA为EGFP mRNA。更加具体地，所述EGFP mRNA 水溶液的浓度为2mM。步骤(B1)中，所述EGFP mRNA水溶液和所述ZrF4水溶液的用量配比为1000μL：1000μL，电荷比为1:2。
在本发明的具体实施方式中，按照所述目的mRNA和所述金属阳离子的最优电荷比1:2，体积比为1:1来计算。所述目的mRNA为EGFP mRNA。其余价态金属离子投料比与以上三种类似：即2价金属：mRNA(摩尔浓度比)＝798:1；3价金属： mRNA＝798:1.5；4价金属：mRNA＝798:2；其他案例可根据具体RNA序列及金属离子种类以此类推即可。
第三方面，本发明要求保护采用前文第二方面所述方法制备得到的无载体Metal-mRNA纳米微粒。
本发明所得无载体Metal-mRNA纳米微粒粒径为20-300nm，zeta电位为-100至 40。
第四方面，本发明要求保护前文第一方面或第二方面所述方法或第三方面所述无载体Metal-mRNA纳米微粒在以无载体方式向细胞或组织或生物体递送目的mRNA中的应用。
所述应用可为非疾病诊断治疗性应用。
本发明除了适用mRNA，还可适用于siRNA或/和microRNA等。
本发明技术通过金属离子和mRNA分子的配位驱动自组装效应合成无载体 Metal-mRNA纳米微粒，具备以下优势：1、能够轻易透过细胞膜，快速进入细胞内部。 2、Metal-mRNA纳米微粒生物相容性好，更加稳定。3、mRNA更易在细胞质内解离，增强其内涵体逃逸性能，提高细胞递送效率，增加目的蛋白表达。4、Metal-mRNA纳米粒子可实现无载体递送，无载体材料免疫困扰。5、“一锅出”超分子自组装策略极其简单易行，节约成本，适合大规模转化应用。6、这种技术具有普适性，适合于不同核酸分子量长度，不同核酸序列的mRNA递送。
总之，本发明涉及一种普适性无载体的mRNA递送技术，该技术无需负载材料对mRNA进行包裹，而是借助金属离子与mRNA间的超分子配位效应完成自组装，具有敏感的微环境响应，良好的分散稳定性，高效的mRNA递送效率及低生物毒性和良好的生物安全性。另外，本技术简单易行，具有普适性，适合广泛的金属离子与不同核酸分子量长度，不同核酸序列的mRNA配位组装及递送，易于临床推广，在mRNA 治疗领域具备广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明金属阳离子与mRNA分子的配位驱动自组装合成Metal-mRNA纳米微粒的合成示意图。
图2为Ca-mRNA(不同序列)纳米粒子电镜图
图3为MTT法测得各组细胞存活率。
图4为不同分组小鼠体内肝功能变化情况。
图5为不同分组小鼠体内炎症因子表达情况。
图6为不同Metal-EGFP mRNA的EGFP mRNA递送及定量GFP蛋白表达情况。
图7为荧光显微镜下Ca-EGFP mRNA与Lipo2000-mRNA蛋白表达效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种金属阳离子与mRNA分子的配位驱动自组装合成 Metal-mRNA纳米微粒的普适性技术，它是一种无载体mRNA递送技术，其合成示意图如图1所示。
其中，n＝2-8之间的整数，代表所选的金属离子价电位数(即金属阳离子的价位可为+2至+8)；
M代表的金属离子种类，包括Mn2+，Cu2+，Zn2+，Fe2+，Ca2+，Zr2+，Fe3+，Zr3+， Zr4+，Hf4+等自然界所有可参与RNA的磷酸根配位反应的生物可用金属离子，不同的金属离子也可以混合使用，达到类似的组装效果。
mRNA Chain为目的递送mRNA，包括不同核酸分子量长度，不同核酸序列的 mRNA链(包括mRNA后修饰，如磷酸化和糖基化等)。同时，本发现也适用于其他RNA体系，如siRNA，microRNA等。
本发明中，Metal-mRNA纳米粒子由金属离子及mRNA片段组成，粒径均一，性质稳定，能够简单、高效的用于生物体内mRNA递送。
实施例1、Metal-mRNA纳米粒子的合成(Ca2+为例)
本实施例中选定金属离子为Ca2+，mRNA为EGFP mRNA(SEQ ID No.6)。具体的，将1000μL体积的CaCl2水溶液(798mM)逐滴加入到1000μL的EGFP mRNA (1mM)水溶液的中，使得EGFP mRNA与Ca2+的电荷比为1:2。充分搅拌1min，使其混合均匀，将以上混合物在55℃静置3小时后自然冷却至室温。所得产物用去离子水洗涤，随后室温下以12000转/分的速度离心5min，所得沉淀即为Ca-EGFP mRNA 纳米粒子，并重新分散在去离子水中保存。
反应中所采用金属阳离子及mRNA序列投料比依据mRNA与金属阳离子电荷配比关系而定：mRNA-/M+＝500/1～1/500(M+表示金属阳离子所带正电荷，如表1中所述： Zn(ZnCl2)，Fe(FeCl2)，Mn(MnCl2)，Cu(CuSO4)，Ca(CaCl2)，Fe(FeCl3)，Al(AlCl3)， Zr(ZrF4)，Hf(Hf Cl4)等，mRNA-代表不同碱基序列所带负电荷。mRNA具体为Mouse IL-10(末端携带6×His)，Human EPO，Mouse ECD(末端携带6×His)，NLS-Cre， SV40 NLS-Cas9，EGFP和Luciferase(上述各mRNA的具体序列依次如SEQ ID No.1 至SEQ ID No.7所示)。其他金属离子与mRNA的配位自组装实施方法与上述相类似，按照目的mRNA和金属阳离子最优电荷比1:2，mRNA选定为EGFP mRNA，所加入两种物质体积比为1:1为例，金属离子与mRNA投料比为：2价金属/mRNA(摩尔浓度比，下同)＝798/1；3价金属/mRNA＝798/1.5；4价金属/mRNA＝798/2；具体实施中，根据所用金属离子价电位与所选用不同序列及长度的mRNA碱基数量按照以上原则进行调整即可。
实验结果证明，本发明递送技术具有普适性，适用于不同的金属离子及不同序列和长度的mRNA(详见表1和图2)。
表1、不同金属离子与不同长度及序列的mRNA配位组装的部分纳米粒子粒径
图2所示为Ca2+-mRNA(不同序列)纳米粒子电镜图。a为Ca-EGFP mRNA；b 为Ca-Luciferase mRNA。
由表1和图2可见，不同价态的金属离子与不同长度、序列的RNA均能够通过配位作用很好的完成组装，形成粒径均一、形貌可控、均匀分散且稳定的Metal-mRNA 纳米粒子。
实施例2、Metal-mRNA纳米粒子分散稳定性评估
根据实施例1中所述方法，金属离子以Ca2+为例，mRNA为EGFP mRNA。选择金属离子水溶液浓度为798mM，EGFP mRNA水溶液浓度为1mM，根据EGFP mRNA 与金属阳离子电荷比例：100/1-1/10，分别计算所加两种物质体积。具体的，当电荷比为100/1时，mRNA/金属的体积比＝200/1；当电荷比选择50/1时，mRNA/金属的体积比＝100/1；当电荷比选择30/1时，mRNA/金属的体积比＝60/1；当电荷比选择20/1 时，mRNA/金属的体积比＝40/1；当电荷比选择10/1时，mRNA/金属的体积比＝20/1；当电荷比选择5/1时，mRNA/金属的体积比＝10/1；当电荷比选择2/1时，mRNA/金属的体积比＝4/1；当电荷比选择1/1时，mRNA/金属的体积比＝2/1；当电荷比选择1/2 时，mRNA/金属的体积比＝1/1；当电荷比选择1/5时，mRNA/金属的体积比＝1/2.5；当电荷比选择1/10时，mRNA/金属的体积比＝1/5。其他价态金属按照实施例1中给出的关系换算即可。具体的，按照实施例1中所述合成所需Metal-mRNA纳米粒子。利用zeta电位法、透光率法(分光光度计)等方法评估不同电荷比例下Metal-mRNA纳米粒子的分散稳定性。(详见表2和表3)。
表2、不同金属粒子及比例下Metal-EGFP mRNA纳米粒子的zeta电位变化
表3、不同金属粒子及比例下Metal-EGFP mRNA纳米粒子分散稳定性变化情况
由表2可见，：随着mRNA/金属离子的电荷比的增加，Metal-EGFP mRNA纳米体系逐渐成电中性及弱电正性。相应的，纳米体系更容易穿透细胞膜，更加高效的进入细胞内部完成mRNA递送。
由表3可见，随着mRNA/金属离子的电荷比的增加，在此范围内Metal-mRNA纳米体系越稳定，在到达靶环境前，越能保持体系的完整。
实施例3、体外细胞毒性测试
将HEK293细胞(CRL-1573-293)接种在96孔板的DMEM培养基(10％胎牛血清和1％青霉素)中。将细胞在37℃下在含有5％CO2的气氛中孵育。细胞孵育24小时后更换新鲜培养基。加入不同金属离子和mRNA的组装体(实施例1制备， Metal-EGFP mRNA，15μg)，Lipofectamin 2000-EGFP mRNA(15μg)和PEI-EGFP mRNA (15μg)作为商业化mRNA递送模式对照(具体制备方法见下文)。将细胞孵育48 小时后，用含有0.5mg/mL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)的100μL 培养基替换原培养基。孵育4小时后，除去含有MTT的培养基，用PBS小心洗涤3 次。然后，加入DMSO(100μL)，在BioTek Synergy H4读数器中测量在570nm的波长下吸光度，计算得到细胞存活率，验证本发明得到的组装体的细胞毒性。
附：PEI-EGFR mRNA和Lipofectamin 2000-EGFP mRNA合成方法
将适量PEI/Lipofectamin 2000(均为商业获得)，与EGFP mRNA溶于15ml PBS 中，质量比为PEI或Lipofectamin 2000/EGFP mRNA＝3/1。室温搅拌过夜，所得沉淀离心既得PEI-EGFR mRNA和Lipofectamin 2000-EGFP mRNA。
图3所示为MTT法测得各组细胞存活率，a:Zr-EGFP mRNA；b:Zn-EGFP mRNA； c:Fe(II)-EGFP mRNA；d:Fe(III)-EGFP mRNA；e:Mn-EGFP mRNA；f:Cu-EGFP mRNA； g:Ca-EGFPmRNA；h:Al-EGFP mRNA；i:Hf-EGFP mRNA；j:lipofectamine2000-EGFP mRNA；k:PEI-EGFPmRNA。
由图3可见，Metal-EGFP mRNA纳米粒子相比较于Lipofectamine 2000-EGFP mRNA和PEI-EGFP mRNA，细胞毒性显著降低，展现出了良好的生物安全性。
实施例4、Metal-mRNA纳米粒子生物安全性分析
将Balb/c小鼠分为5组，每组5只，Balb/c小鼠(4-6周龄，雌性，体重约18-20g) 在正常条件下喂食，每天进行12小时的光暗循环。分别尾静脉注射PBS、PEI-EGFP mRNA(50μg)、PEI-EGFP mRNA(10μg)、Ca-EGFP mRNA(50μg)和Ca-EGFP mRNA (10μg)。其中，Ca-EGFPmRNA制备方法参见实施例1；PEI-EGFP mRNA制备方法参见实施例3。注射后在5-7天取小鼠静脉血，离心取上清液，测定肝功能各项指标。
另取以上相同条件分组小鼠，分别尾静脉注射I：LPS(15μg)；II：R848(15μg)；III：PBS(15μg)；IV：PEI-EGFP mRNA(15μg)；V：Ca-EGFP mRNA(15μg)。其中，Ca-EGFP mRNA制备方法参见实施例1；PEI-EGFP mRNA制备方法参照实施例3进行。注射后在5-7天取小鼠静脉血，离心取上清液，酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定组织内炎症因子水平。
图4所示为不同分组小鼠体内肝功能变化情况。其中a为ALT(谷丙转氨酶)；b 为AST(谷草转氨酶)；c为LDH(乳酸脱氢酶)；d为Total bilirubin(总胆红素)。 I：PBS；II：PEI-EGFP mRNA(50μg)；III：PEI-EGFP mRNA(10μg)；IV：Ca-EGFP mRNA (50μg)；V：Ca-EGFPmRNA(10μg)。由图4可见，Ca-EGFP mRNA纳米粒子对肝功能基本没有影响，明显小于PEI-EGFP mRNA，基本与PBS组相持平。说明Metal-mRNA 几乎无肝脏代谢毒性，生物安全性良好。
图5所示为不同分组小鼠体内不同炎症因子表达情况。其中a为IL-1β；b为IL-10；c为IL-6；d为IL-8。I：LPS(阳性对照)；II：R848(阳性对照)；III：PBS；IV： PEI-EGFP mRNA；V：Ca-EGFP mRNA。由图5可见，Ca-EGFP mRNA纳米粒子注射后引起的体内炎症因子表达维持在较低水平，基本与PBS相持平。说明Metal-mRNA 免疫原性小，具有良好的生物安全性。
实施例5、Metal-mRNA纳米粒子细胞内蛋白表达
本实施例中选择Luciferase mRNA为目的mRNA进行胞内蛋白表达实验。具体的，根据实施例1中所述方法，调节Luciferase mRNA与金属阳离子电荷比例：100/1-1/10。具体的，以Ca2+为例，摩尔浓度比：1/1818，电荷比例：1/2。所述Luciferase mRNA 与CaCl2水溶液体积比为1/1(其他电荷比例时，体积比可参照实施例2中方法计算所得)。具体的，以Al3+为例，浓度比：1.5/1818，电荷比例：1/2。所述Luciferase mRNA 与AlCl3水溶液体积比为1/1(其他电荷比例时，体积比可参照实施例2中方法计算所得)。具体的，以Hf4+为例，浓度比为1/909，电荷比例：1/2。所述Luciferase mRNA 与HfCl4水溶液体积比为1/1(其他电荷比例时，体积比可参照实施例2中方法计算所得)。得到的纳米颗粒用于验证Metal-mRNA细胞内递送效率及蛋白表达效率。通过检测胞内所荧光素酶的生物荧光信号来证明这一方法的可行性及普适性(详见表4)。
表4、不同金属粒子及比例下Metal-mRNA(Luciferase mRNA)细胞内荧光素酶的表达量
由表4可见，随着金属离子比例的增加，荧光素酶蛋白表达呈递增的趋势。这是由两方面原因引起的：第一，金属离子比例提高，有利于mRNA组装体的稳定，利于 mRNA向胞内表达；第二，金属离子比例提高，组装体的Zeta电位值接近中性或者电正性，更加有利于细胞内吞，提高转运效率。二者协同，共同提高了目标mRNA的递送及蛋白表达。
实施例6、Metal-EGFP mRNA胞内表达实验
本实施例中，选择EGFP mRNA作为递送mRNA，选择Ca2+作为金属离子，按照实施例1方法合成Ca-EGFP mRNA纳米颗粒，随后将Ca-EGFP mRNA(0.2μg/ml) 纳米颗粒与HEK293细胞共孵育24h，使其表达绿色荧光蛋白，去除细胞培养皿中的培养基，PBS冲洗3次。通过荧光显微镜及流式细胞术定性及定量检测Ca-EGFP mRNA 递送系统的绿色荧光蛋白的表达效率。对照组为Lipo2000-EGFP mRNA纳米粒子及单独EGFP mRNA。其它Metal-EGFP mRNA胞内表达实验方法类似。
图6所示为不同Metal-EGFP mRNA的EGFP mRNA递送及GFP蛋白表达情况，其中a：Zr-EGFP mRNA，b：Zn-EGFP mRNA，c：Fe(II)-EGFP mRNA，d：Fe(III)-EGFP mRNA，e：Mn-EGFPmRNA，f：Cu-EGFP mRNA，g：Ca-EGFP mRNA，h：Al-EGFP mRNA，i：Hf-EGFP mRNA，j：Lipo2000-EGFP mRNA，k：EGFP mRNA，l：PBS。由图6可见，Metal-EGFP mRNA与Lipo2000-EGFP mRNA相比具有相近的高效mRNA 递送能力及蛋白表达效率。
图7所示为荧光显微镜下Ca-EGFP mRNA与Lipo2000-EGFP mRNA蛋白表达效果图。由图7可见，二者在细胞内均能够表达出明亮的GFP荧光，GFP均得到很好表达。总结来说，Metal-mRNA具有高效的mRNA递送能力及蛋白表达效率，具备优异的转化应用前景。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 清华大学
<120> 一种无载体mRNA递送方法
<130> CGGNQALN216079
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 564
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
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ggccaguaca gccgggaaga caauaacugc acccacuucc cagucggcca gagccacaug 120
cuccuagagc ugcggacugc cuucagccag gugaagacuu ucuuucaaac aaaggaccag 180
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auuaucauaa cuuaaagu 1818
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