阅读说明：本技术 一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法 (Exosome hydrogel wound dressing and preparation method thereof ) 是由 王立生 聂文博 赵丽晶 吴祖泽 于 2020-03-26 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学技术领域,具体涉及一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法。本发明外泌体水凝胶伤口敷料,包括间充质干细胞外泌体和水凝胶,其中水凝胶由普朗尼克F127和普朗尼克F68组成。分别配制普朗尼克F127和普朗尼克F68的生理盐水溶液,及间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液,在4℃条件下将上述溶液混合,即可得到外泌体水凝胶伤口敷料。实验结果表明,相对于单独采用间充质干细胞外泌体和水凝胶,本发明制备得到的伤口敷料更能促进皮肤创面细胞再生,缩短伤口愈合时间。(The invention belongs to the technical field of biomedicine, and particularly relates to an exosome hydrogel wound dressing and a preparation method thereof. The exosome hydrogel wound dressing comprises mesenchymal stem cell exosomes and hydrogel, wherein the hydrogel is composed of pluronic F127 and pluronic F68. Respectively preparing physiological saline solution of pluronic F127 and pluronic F68 and mesenchymal stem cell exosome physiological saline resuspension, and mixing the solutions at 4 ℃ to obtain the exosome hydrogel wound dressing. The experimental result shows that compared with the method of singly adopting the mesenchymal stem cell exosome and the hydrogel, the wound dressing prepared by the invention can better promote the regeneration of skin wound cells and shorten the wound healing time.)

一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法。

背景技术

据统计，我国超过2％的人经历着慢性创伤愈合的痛苦，全球每年用于伤口护理产品的费用高达150亿美元。传统伤口敷料如壳聚糖、透明质酸、藻酸盐和明胶等对慢性创面有一定的辅助治疗作用，但伤口的愈合程度仍主要依赖患者的自身修复能力，造成大量慢性难治性伤口因患者营养状态差、高龄、免疫力低下等原因而长期迁延不愈甚至导致死亡。因此，迫切需要研制出基于临床伤口护理需求的具有组织再生功能的新型敷料。

间充质干细胞外泌体(MSC-exosome)具有与来源细胞相似的功能，而且对靶细胞的作用效率高、利于长期稳定保存和运输、使用浓度和剂量易于控制，同时可以克服间充质干细胞在体内存活率低及长期使用易突变致瘤的隐患。伤口敷料常常以水凝胶作为支架，承载有效成分，来达到治愈伤口的效果。但是传统水凝胶如壳聚糖、银离子敷料虽然其都具有较好的灭菌和抑菌的效果，但是都具有一定的毒性，对皮肤软组织具有一定伤害，影响伤口愈合的效果。另外，伤口敷料水凝胶普遍为胶状固态物质，采用复杂的高成本的生物分子通过复杂的反应制备而成，一般需要进行交联，配置方法复杂，很容易出现水凝胶与有效成分混合不均、达不到缓释作用、影响有效成分效果的弊端，因此现有的水凝胶与内泌体制备得到的敷料仍然存在愈合时间短的缺点。

发明内容

本发明提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料及其制备方法，能够显著促进创面细胞再生，缩短伤口愈合时间。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料，包括间充质干细胞细胞外泌体和水凝胶，其中水凝胶包括普朗尼克F127和普朗尼克F68。

优选的，普朗尼克F127在伤口敷料中的浓度为200-220mg/mL，普朗尼克F68在伤口敷料中的浓度为25-100mg/mL。

优选的，间充质干细胞外泌体在伤口敷料中的浓度为100-200μg/mL。

优选的，间充质干细胞外泌体与水凝胶的体积比为1:1。

本发明还提供了一种上述技术方案所述外泌体水凝胶伤口敷料的制备方法：配制普朗尼克F127和普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；配制间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将所述A液与所述B液混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。

优选的，在A液中，普朗尼克F127的浓度为400-440mg/mL，普朗尼克F68的浓度为50-200mg/mL。

优选的，在B液中，间充质干细胞外泌体的浓度为200-400μg/mL。

优选的，A液与B液按体积比1:1混合。

优选的，间充质干细胞外泌体为从间充质干细胞培养基的上清液中提取得到。

优选的，上清液用PEG 60004℃静置过夜，离心后得到的沉淀用PBS重悬，得到间充质干细胞外泌体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的外泌体水凝胶伤口敷料包括间充质干细胞外泌体和水凝胶，所述水凝胶由普朗尼克F127和普朗尼克F68组成。其中间充质干细胞外泌体能促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌，诱导上皮细胞增殖和血管形成，促进皮肤创伤的再上皮化，防止肌纤维形成；由普朗尼克F127和普朗尼克F68制备得到的水凝胶可以为皮肤创伤提供湿润的微环境，吸收伤口渗出物，保护伤口不被感染，从而有加速创伤愈合的作用。本发明以水凝胶作为载药体系，搭载间充质干细胞外泌体，能够延长间充质干细胞外泌体的局部作用时间，加强了水凝胶的促进创伤愈合的作用。实验结果表明，相对于单独采用间充质干细胞外泌体和水凝胶，本发明的伤口敷料更能促进皮肤创面细胞再生，缩短伤口愈合时间。

本发明所采用的水凝胶作为复合组织工程支架材料，承载间充质干细胞外泌体。制备得到的外泌体水凝胶伤口敷料在低温下呈液态，使用时外敷于皮肤上呈凝胶状态，能提高敷料与伤口的接触面积，促进皮肤创伤愈合，是一种新型的伤口护理新材料。本发明的水凝胶无需复杂的高成本的生物分子，制备方法简单，并通过简单的化学官能团来引起复杂的细胞反应，是一种节约成本、无毒性的支架材料。

附图说明

图1是不同浓度普朗尼克F127对C2C12细胞存活的影响；

图2是不同浓度普朗尼克F68对C2C12细胞存活的影响；

图3是各时间点各组小鼠皮肤创面情况；

图4是各组皮肤创伤处理后不同时间点的创面面积。

具体实施方式

本发明提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料，包括间充质干细胞外泌体和水凝胶，所述水凝胶由普朗尼克F127和普朗尼克F68组成。

在本发明中，间充质干细胞外泌体在伤口敷料组合物中的浓度为100-200μg/mL。间充质干细胞外泌体具有与来源细胞相似促进损伤的组织细胞再生的功能，更有利于促进皮肤创面的修复。

在本发明中，普朗尼克F127在伤口敷料组合物中的浓度为200-220mg/mL，普朗尼克F68在伤口敷料组合物中的浓度为25-100mg/mL。

普朗尼克为温敏性水凝胶，在低温状态下时为液态，在较高温度下时为固态，不同浓度的普朗尼克具有不同的相变温度。如果温敏性水凝胶的相变温度过高，则使水凝胶提前凝固，后期无法与外泌体充分混合，也无法与伤口创面充分接触，影响治疗效果；若相变温度过低，则涂抹伤口后也不能成胶，呈液体状态易流失，起不到缓释治疗作用。通过测定，普朗尼克F127与普朗尼克F68不同浓度混合物的相变温度，如下表1所示：

表1普朗尼克F127与普朗尼克F68不同浓度混合物与相变温度

可以从表1中看出，凝胶B3的相变温度为35.1℃、凝胶C1的相变温度为36.1℃，最接近伤口的温度，以保证外泌体水凝胶伤口敷料在制备过程中能与外泌体充分混合，在使用过程中能在伤口上凝固，起到缓释治疗的作用。

本发明还提供了一种外泌体水凝胶伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：配制浓度为400-440mg/mL普朗尼克F127和浓度为50-200mg/mL普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；配制浓度为200-400μg/mL的间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将A液与所述B液混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。

目前，伤口敷料水凝胶普遍为固态物质，一般需要进行交联反应，配置方法复杂，并且很容易出现水凝胶与有效成分混合不均、达不到缓释作用、影响有效成分效果的弊端。而本发明中采用的水凝胶为温敏性水凝胶，在低温下呈液态，制备过程中容易与外泌体混合均匀，配置方法简单，配置过程在低温环境下进行，能有效避免外泌体的功效被破坏。在治疗伤口的过程中，本发明的敷料不仅不需要经常更换，还能达到缓释、促进伤口愈合的效果。另外，本发明的敷料与伤口的接触面积更大，更容易吸收软组织渗出液，缩短伤口愈合时间。

本发明中，B液中间充质干细胞外泌体的浓度为200-400μg/mL。

本发明中，A液与B液按体积比1:1混合。

本发明对间充质干细胞外泌体的来源及制备方法没有特殊限定，已知间充质干细胞外泌体均能够用于本发明的伤口敷料。可选的，本领域技术人员也可根据已知间充质干细胞外泌体的制备方法进行制备。作为一种可实施的方式，本发明中，间充质干细胞外泌体为从间充质干细胞培养基的上清液中提取得到，将上清液转移至50mL离心管中，在4℃环境中离心，转数500xg、离心5min，收上清；再转移至新的50mL离心管中，在4℃环境中离心，转数2000xg，离心30min，收上清，与预冷的16％PEG 6000等体积混合，充分颠倒混匀，在4℃环境中静置过夜；在4℃环境中离心，转数10000xg、离心60min，倒出上清，加入50-100μL预冷的无菌PBS重悬，即为粗间充质干细胞外泌体，加入15-20mL预冷的无菌PBS，混匀，在4℃环境中离心，转数100000xg、离心70min，弃上清，加入200-400μL预冷的无菌PBS重悬，得到间充质干细胞外泌体。

本发明以水凝胶作为载药体系，搭载间充质干细胞外泌体，能够延长间充质干细胞外泌体的局部作用时间，加强了水凝胶促进创伤愈合的作用。相对于单独采用间充质干细胞外泌体和水凝胶，本发明的伤口敷料更能促进皮肤创面细胞再生，缩短伤口愈合时间。本发明制备得到的外泌体水凝胶伤口敷料在低温下呈液态，使用时外敷于皮肤上呈凝胶状态，能提高敷料与伤口的接触面积，促进皮肤创伤愈合，是一种新型的伤口护理新材料。本发明的水凝胶无需复杂的高成本的生物分子，制备方法简单，并通过简单的化学官能团来引起复杂的细胞反应，是一种节约成本、无毒性的支架材料。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例中普朗尼克F127购于Sigma life science公司，生产批号为P2443，普朗尼克F68购于Sigma life science公司，生产批号为P4894。

实施例中间充质干细胞培养基上清液的制备方法为：a.在产妇及其家属知情同意并通过医院伦理审查情况下，取足月剖腹产新生儿脐带，产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病和畸形。取自足月生产新生儿的脐带组织，用磷酸缓冲盐溶液将其冲洗至白色，机械剔除脐动脉及脐静脉，分离脐带组织中的华通胶成分；b.以1mg/mL I型胶原酶消化华通胶组织，胶原酶与组织的比例为1：1，放入细胞培养箱，其中CO₂浓度为5％，温度为37℃，培养3-7小时后获得细胞悬液，种植至10cm的细胞培养皿中，细胞培养至第三代；c.将间充质干细胞培养基添加物加入到间充质干细胞标准培养液中，得到细胞培养液，将培养至第三代的细胞在该培养液中进行培养，培养条件为CO₂浓度为5％，温度为37℃，收集得到间充质干细胞培养基上清液。

实施例中其它原料均可市购获得，本发明对其来源不做限定。

实施例1

配制浓度为440mg/mL的普朗尼克F127和浓度为100mg/mL的普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；将间充质干细胞培养基的上清液用PEG6000在4℃环境中静置过夜，离心，将得到的沉淀用PBS重悬，得到间充质干细胞外泌体。配制浓度为400μg/mL的间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将A液与所述B液按照体积比1:1混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。

实施例2

配制浓度为440mg/mL的普朗尼克F127和浓度为50mg/mL的普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；将间充质干细胞培养基的上清液用PEG6000在4℃环境中静置过夜，离心，将得到的沉淀用PBS重悬，得到间充质干细胞外泌体。配制浓度为200μg/mL的间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将A液与所述B液按照体积比1:1混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。

实施例3

配制浓度为420mg/mL的普朗尼克F127和质量浓度为80mg/mL的普朗尼克F68的生理盐水溶液，得到A液；将间充质干细胞培养基的上清液用PEG 6000在4℃环境中静置过夜，离心，将得到的沉淀用PBS重悬，得到间充质干细胞外泌体。配制浓度为300μg/mL的间充质干细胞外泌体生理盐水重悬液，得到B液；在4℃条件下将A液与所述B液按照体积比1:1混合，得到外泌体水凝胶伤口敷料。

实施例4

水凝胶毒性测试

取96孔板，每孔分别加入100μLC2C12细胞，分别配置含有1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1000μg/mL、10000μg/mL、100000μg/mL、1000000μg/mL普朗尼克F127和F68的DMEM培养基，每个浓度设置4个复孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。实验结果表明，普朗尼克F127和普朗尼克F68在1-1000000μg/mL范围内没有毒性。

实施例5

不同敷料对小鼠创口恢复的影响

本实验在吉林大学动物实验中心开展(SYXK(吉)2016-0001)，在吉林大学动物伦理福利委员会监督下(伦理审批号SY201906001)，遵守吉林大学及国家对于实验动物伦理福利的要求，饲养条件严格依照GB14925进行，实验动物自由饮水采食。具体实验步骤为：

(1)压疮模型

共24只小鼠，其种类、年龄、体格等各方面均相似，每个小鼠一个创口。取12*3mm，2200高斯的磁铁，夹起小鼠背部约5mm厚的组织，施加磁铁12小时后，释放12小时，共3个循环。造模期间小鼠单笼饲养，放置玩具陪伴，自由饮水、进食。造模结束后，每个小鼠创口无明显区别，受压皮肤轻度凹陷，中心苍白，外周发红，周围组织水肿明显。

(2)动物分组

将24个小鼠随机分为4组：

A组为外泌体水凝胶组(实施例1)，给药剂量为100μL/伤口，外敷；

B组为单纯外泌体组，外泌体浓度为100μg/mL，给药剂量为100μL/伤口，外敷；

C组为单纯水凝胶组由浓度为220mg/mL普朗尼克F127和浓度为100mg/mL普朗尼克F68组成，给药剂量为100μL/伤口，外敷；

D组为对照组，浓度为100μg/mL的盐水，给药剂量为100μL/伤口，外敷。

(3)在伤口造模后，分别将A组、B组、C组、D组所用的敷料涂抹到小鼠的创口上，并于造模后第3、5、7、9日观察每组创面情况。

经观察，造模后第3天，A组逐渐变硬且结痂，可见毛发生成；随着修复时间的延长，各组均逐渐呈现伤口缩小的趋势。

图3是各时间点各组小鼠皮肤创面情况，其中PWD指伤口造模后的天数。

实验结果表明，A组相对于其他组，能够显著促进创面细胞再生，减小创口面积，缩短伤口愈合时间。A组的外泌体能促进成纤维细胞活化的胶原蛋白和弹性蛋白的分泌，诱导上皮细胞增殖和血管形成，促进皮肤创伤的再上皮化，防止肌纤维形成；由普朗尼克F127和普朗尼克F68制备得到的温敏水凝胶，在体表能够迅速形成凝胶状态，形成创伤敷料，贴合创伤表面，增加了外泌体与伤口的接触面积，并且为皮肤创伤提供湿润的微环境，吸收伤口渗出物，保护伤口不被感染，从而有加速创伤愈合的作用。A组将外泌体与温敏水凝胶相结合，更能突出彼此的优点，具有协同功效，进而促进创面细胞再生，缩短伤口愈合时间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。