阅读说明：本技术 一种含有clcn2纯合突变的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系 (C L CN2 homozygous mutation-containing white matter encephalopathy patient specific induced pluripotent stem cell line ) 是由 彭福华 钟秀风 陈灼林 于 2020-03-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。收集CLCN2基因突变患者的尿液,分离和培养尿液细胞,尿液细胞重编程为诱导多能干细胞,获得含有CLCN2纯合突变(C.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。该诱导多能干细胞的STR与CLCN2患者的相同,表达多潜能分子标签,体内具有形成畸胎瘤能力,可为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗研究提供新的生物材料和细胞模型工具。(The invention discloses a white matter encephalopathy patient specific induced pluripotent stem cell line containing C L CN2 homozygous mutation (c.2257C > T). collecting urine of C L CN2 gene mutation patient, separating and culturing urine cell, reprogramming the urine cell into induced pluripotent stem cell, obtaining white matter encephalopathy patient specific induced pluripotent stem cell line containing C L CN2 homozygous mutation (C.2257C > T). STR of the induced pluripotent stem cell is the same as that of C L CN2 patient, expressing pluripotent molecular label, having teratoma forming ability in vivo, and providing new biological material and cell model tool for pathogenesis and treatment research of C L CN2 mutation related diseases.)

一种含有CLCN2纯合突变的白质脑病患者特异诱导多能干细 胞系

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系极其构建方法。

背景技术

CLCN2基因是编码氯离子通道2(Chloride Channel 2,ClC-2)蛋白的基因。ClC-2在人体中分布广泛，尤其在大脑中表达较高，其在调节水电解质平衡中发挥重要作用[1]。ClC-2在多个器官和组织中发挥功能[2]，其中CLCN2相关白质脑病(CLCN2-relatedleukoencephalopathy,CC2L)是由CLCN2基因突变进而导致ClC-2功能障碍而引起的常染色体隐性遗传病。CC2L患者常表现有视网膜脉络膜病变或视神经萎缩、男性不育、小脑性共济失调、认知障碍、学习障碍等，颅脑MRI通常提示髓鞘空泡变性[3-5]。

在中枢神经系统中，ClC-2主要分布在少突胶质细胞周围的缝隙连接处、海马的锥体神经元中以及血管周围基底的星形胶质细胞末端[1]。有学者认为，ClC-2在神经活动后会通过星形胶质细胞合胞体重吸收Cl-以维持神经元的兴奋性[6]。关于CC2L，目前仅有少量的病例报道，且由于尚无合适的疾病模型，其致病机制尚不明确，目前也无有效的治疗手段。因此，创建用于研究CLCN2基因相关疾病的体外细胞模型是很有必要的。

随着体细胞重编程技术的发展，获取患者特异的诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)成为现实[7]。研究表明，iPSCs具有向机体几乎所有细胞分化的能力，不仅可构建多种体外细胞模型进行疾病机制的研究以及药物筛查[8]，还由于其具有患者特异性，可减少免疫排斥的优势，可用于替代移植治疗[9,10]。

因此，构建含有CLCN2突变的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系，可以为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗研究提供新的生物材料。

参考文献：

1、Depienne C,Bugiani M,Dupuits Cetal.Brain white matter oedema due toClC-2chloride channel deficiency:an observational analytical study[J].LancetNeurol,2013,12(7):659-668.

2、Brennan S C,Wilkinson W J,Tseng Hetal.The extracellular calcium-sensing receptor regulates human fetal lung development via CFTR[J].Scientific Reports,2016,6(1).

3、van der Knaap M S,Depienne C,Sedel Fetal.CLCN2-RelatedLeukoencephalopathy[J].2015.

4、Blanz J,Schweizer M,Auberson Metal.Leukoencephalopathy uponDisruption of the Chloride Channel ClC-2[J].Journal of Neuroscience,2007,27(24):6581-6589.

5、Edwards M M,Marín De Evsikova C,Collin G Betal.Photoreceptordegeneration,azoospermia,leukoencephalopathy,and abnormal RPE cell functionin mice expressing an early stop mutation in CLCN2[J].Investigativeophthalmology&visual science,2010,51(6):3264.

6、Bellot-Saez A,Kekesi O,Morley J Wetal.Astrocytic modulation ofneuronal excitability through K(+)spatial buffering[J].Neurosci Biobehav Rev,2017,77:87-97.

7、Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki Metal.Induction of pluripotent stemcells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

8、邢红艳，张艺哲，王美婷，赵琪，汪溪洁，等.人诱导多能干细胞分化的心肌细胞在疾病模型和药物筛选中的应用[J].中国医药工业杂志,2019,50(08):834-841.

9、Aoi T.10th anniversary of iPS cells:the challenges that lie ahead[J].J Biochem,2016,160(3):121-129.

10、Ortuno-Costela M,Cerrada V,Garcia-Lopez Metal.The Challenge ofBringing iPSCs to the Patient[J].Int J Mol Sci,2019,20(24).

发明内容

本发明的目的是提供一种含有纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系及其构建方法，构建含有纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系，可以为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗研究提供新型生物材料。

本发明的含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系是通过以下方法构建的：

收集CLCN2基因突变患者的尿液，分离和培养尿液细胞，尿液细胞重编程为诱导多能干细胞，获得含有纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系；

所述的CLCN2基因突变是CLCN2基因的第2257位碱基由C突变为T(氨基酸第753位由Arg突变为Ter)，为纯合突变。

所述的尿液细胞重编程为诱导多能干细胞是在尿液细胞中电转入包含有OCT4,SOX2,SV40LT和KLF4基因的非整合质粒和包含有miR-302b,c,a,d and miR-367的质粒，再经培养获得含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。

所述的包含有OCT4,SOX2,SV40LT和KLF4基因的非整合质粒是OriP/EBNA1非整合质粒pEP4EO2SET2K。

所述的包含有miR-302b,c,a,d and miR-367的质粒是pCEP4-miR-302-367质粒。

优选，所述的分离和培养尿液细胞是尿液收集后进行离心，细胞沉淀用含有抗生素的PBS洗涤，重悬于原代培养基中，重悬的细胞接种到L-gelatin包被的六孔板中，细胞密度长到80-90％，进行消化传代，获得尿液细胞，所述的原代培养基为DMEM/Ham’s F-12nutrient mix(1:1)+10％FBS(血清)+Renal epithelial cell growth medium(REGM)补剂+双抗。

所述的进行消化传代是用0.25％TrypLE express进行消化传代。

所述的尿液细胞重编程为诱导多能干细胞是将尿液细胞单层培养，进行非整合质粒电转过程，电转质粒为OriP/EBNA1非整合质粒pEP4EO2SET2K和pCEP4-miR-302-367质粒，电转后的细胞接种在Matrigel包被的板上，培养在原代培养基中，从第2到第6天，开始加入mTeSR1培养基，隔天换液，电转染后7-10天左右，出现克隆样细胞，随着诱导克隆逐渐增大，16-21天挑取克隆，接种在Matrigel包被的板上，用mTeSR1培养基进行培养扩增，再经消化后，进行传代、扩增获得含有CLCN2纯合突变(C.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系。

所述的再经消化后，进行传代、扩增是当细胞密度达到约80％，用0.5mM的EDTA消化，传代，扩增。

获得含有CLCN2基因纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞表达干性标志物(OCT4，NANOG，SSEA4，TRA1-60等)，具有三胚层分化能力，核型正常(46，XX)，Sanger测序证实其含有CLCN2纯合点突变(c.2257C>T)。STR鉴定结果显示其与患者尿液细胞具有相同的短重复序列位点。

本发明获得了含有CLCN2纯合突变(c.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系，与CLCN2患者具有相同的遗传背景，且可以分化为多种器官和组织，可以为CLCN2突变相关疾病的发病机制及治疗研究提供新的生物材料或细胞模型工具。

附图说明：

图1是CC2L患者临床结果，其中图1A是CC2L患者头颅磁共振，可见大脑内囊和大脑脚的白质出现异常信号；图1B是CC2L患者眼底彩照，提示眼底黄斑萎缩；

图2是CC2L患者电转前后的尿液细胞图。电转前，尿液细胞在光镜下呈圆形或梭形。电转后，部分尿液细胞逐渐发生形态改变，呈不规则扁平状、集落样生长；

图3是CC2L-iPSCs扩增传代培养的光镜图，可见细胞呈克隆样生长，边界清晰，细胞体积小、核质比高，细胞之间边界不清楚；

图4是CC2L-iPSCs的CLCN2基因sanger测序图，显示CLCN2基因的纯合突变位点(c.2257C>T)；

图5是CLCN2基因编码的氯离子通道蛋白ClC-2突变前后3D结构预测模型，表明ClC-2为同源二聚体，c.2257C>T突变导致蛋白C端截短；

图6是CC2L-iPSCs的核型分析图，显示具有正常核型，为46,XX；

图7是免疫荧光染色鉴定图。CC2L-iPSCs表达多能性蛋白标记物SSEA4、NANOG、OCT4和TRA-1-60；

图8是小鼠畸胎瘤实验结果图。CC2L-iPSCs在小鼠体内分化出了外胚层(神经组织)，中胚层(软骨)和内胚层(肠上皮)。

具体实施方式

：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.尿液细胞分离培养及重编程

①患者为38岁女性，表现为双手的意向性震颤、记忆减退、耳鸣及视力减退；体格检查提示小脑性共济失调；大脑MRI提示内囊、大脑脚和小脑中脚的白质出现异常的T1加权像低信号、T2加权像高信号，随后的Sanger测序证实其CLCN2基因有一个纯合致病突变(Exon20:c.2257C>T；p.Arg753Ter)。该病例符合CC2L的诊断标准。

细胞：CC2L患者尿液细胞

②试剂及耗材：

1)DMEM/Ham’s F-12nutrient mix(1:1)：STEMCELL Technologies，#05851

2)FBS：Natocor，#SFBE

3)Renal epithelial cell growth medium(REGM)补剂：Lonza，#CC-4127

4)TrypLE express：Life technologies，#12604013

5)双抗：Gibco，#15140122

6)0.1％明胶：STEMCELL Technologies，#07903

7)PBS:吉诺生物医药技术有限公司，#14111202

8)pEP4-EO2S-ET2K质粒：Addgene，#20927

9)pCEP4-miR-302-367质粒：中国科学院生物医药与健康研究所馈赠，也可以从商业化的试剂公司购买到，其是一个公知的质粒。

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C

2)倒置显微镜：Nikon，TS100

3)离心机：上海安亭，TDL-40B

4)电转移：Lonza，Nucleofector 2b Device

④步骤：

1)用酒精清洁后，收集约500ml的CC2L患者(其CLCN2基因的2257位碱基由C变成T，即2257C>T，纯合突变)的中段尿，置于无菌容器中。

2)尿液样本离心，400g，10min。

3)细胞沉淀用加有1X双抗的PBS清洗2次。

4)细胞沉淀接种在0.1％明胶包被的培养板中，加入原代培养基[DMEM/Ham’s F-12 nutrient mix(1:1)+10％FBS(血清)+1X Renal epithelial cell growth medium(REGM)补剂+1X双抗]。

5)细胞生长一周出现成簇贴壁细胞，密度长至80-90％，用TrypLE express(Lifetechnologies,Inc.,Grand Island,NY,USA)进行消化传代，获得尿液细胞(图2)。

6)1.5×10⁶个的尿液细胞单层培养进行电转，转质粒为6μg的OriP/EBNA1非整合质粒pEP4-EO2S-ET2K(包含OCT4,SOX2,SV40LT和KLF4)和4μg的pCEP4-miR-302-367质粒(miR-302b,c,a,d and miR-367)。

7)电转后的细胞接种在Matrigel包被的板上，加入原代培养基。

8)从第2到第6天，开始加入诱导培养基(mTeSR1+0.5μM A-83-01+3μM CHIR99021+0.5μM Tzv+0.5μM PD0325901，隔天换液。

9)诱导后7-10天左右，出现克隆样集落生长的细胞团，克隆随时间逐渐增大，边界清楚，类似于人胚胎干细胞的生长形态(图2)。由此获得白质脑病患者特异诱导多能干细胞的原代克隆(命名为CC2L-iPSCs)。

所述的CC2L患者，其头颅磁共振如图1A所示，可见大脑内囊和大脑脚的白质出现异常信号(图1A)；眼底彩照如图1B所示，眼底黄斑萎缩。测序表明该患者的CLCN2基因的2257位碱基由C变成T，即2257C>T(p.Arg753Ter)，如图4所示。对突变前后的CLCN2基因编码的蛋白(ClC-2通道蛋白)的结构预测模型如图5所示，其中CLCN2-WT代表突变前的蛋白，Arg753Ter代表突变后的蛋白。预测模型表明ClC-2为同源二聚体，c.2257C>T突变导致蛋白C端截短。

2.CC2L-iPSCs的克隆挑取与扩增传代

①细胞：CC2L-iPSCs原代克隆和传代细胞

②试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL,#05851

2)EDTA：Invitrogen，#15575-038

3)PBS(1X)：吉诺生物医药技术有限公司，#14111202

4)Matrigel：Corning，#354277

5)六孔板：FALCON，#353046

6)离心管：BD FALCON，#352096

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C

2)倒置显微镜：Nikon，TS100

3)离心机：上海安亭，TDL-40B

④步骤：

1)CC2L-iPSCs原代克隆生长至D16-D22，克隆变大呈扁平状，克隆细胞较密集。

2)用tip头将克隆边缘划开，轻轻刮起，呈小片状，接种到Matrigel包被的六孔板中，用mTeSR1进行培养扩增。

3)克隆小片贴壁生长，逐渐增大呈扁平状，细胞密集核质比较大，连续培养约5-7天。

4)选取生长良好的克隆(细胞密度达到约80％)，吸去培养液，用无菌PBS润洗1遍，加入已复温至37℃的0.5mM EDTA 1ml，放入37℃CO₂培养箱中消化5-6min，吸去EDTA，取1mlmTeSR1轻轻吹落细胞。

5)消化的细胞重新接种到Matrigel包被的六孔板中，用mTeSR1进行扩增培养，即为含有CLCN2纯合突变(C.2257C>T)的白质脑病患者特异诱导多能干细胞系(CC2L-iPSCs)。

CC2L-iPSCs维持培养于mTeSR1培养基中，约4-5天克隆可生长至占满约80％底面积，可以进一步传代扩增，方法同前。

CC2L-iPSCs的光学显微镜的图如图3所示，可见细胞克隆边缘清晰，细胞形态均一、核质比高，目前细胞扩增传代20代以上。

3.CC2L-iPSCs的干细胞特性鉴定

1、免疫荧光染色实验

1)细胞:CC2L-iPSCs

2)试剂及耗材：

a:PBS：吉诺生物，#GNM20012

b:4％多聚甲醛(PFA)：Leagene，#DF0135

c:驴血清：Solarbio，#SL050

d:Triton 100：普利莱，#B1014

e:一抗：见表1

f:二抗：见表1

表1抗体信息

g:DAPI:Thermo Fish，D21490

h:抗猝灭封片剂：碧云天，P0126

i：cover slip：锂阁，LG18-501E-5

j:载玻片：CITOTEST，10127105P-G

3)仪器：

a:荧光显微镜：奥林巴斯

4)步骤：

a:培养的CC2L-iPSCs消化后接种在加有cover slips(细胞爬片)的24孔板中，培养2-3天。

b:用4％PFA的固定，5min，室温。

c:加入PBS清洗一编，加入封闭穿透液(0.2％的Triton 100溶液：驴血清＝1：9v/v)，封闭穿透40min。

d:加入目标一抗，4℃孵育过夜。

e:PBS洗，3次，每次5min。

f:加入相应的二抗，室温孵育1h。

g:PBS洗，3次，每次5min。

h：加入DAPI溶液，5min。

i：PBS洗，1次，每次5min。

j:用镊子夹出cover slips，加封片剂，倒置封片于玻片上

k：荧光显微镜观察和拍照，结果如图7所示，细胞核DAPI染色正常(蓝色)，在细胞核中表达干性标志物NANOG、OCT4，在细胞质中表达干性标志物SSEA4、TRA-1-60。

2、核型分析

1)细胞:CC2L-iPSCs

2)试剂及耗材：

a:秋水仙碱：Sigma，#C3915

b:0.5mM EDTA：Invitrogen，#15575-038

c:0.075M氯化钾溶液：Sigma，#60142

d:固定液：碧云天，#P0098

e:吉姆萨染色：solarbio，#G1015

3)仪器：

a:显微镜：Olympus BX51 microscope

b:核型分析软件：Ikaros Karyotyping System(MetaSystems)

4)步骤：

a:CC2L-iPSCs生长在Matrigel包被的板上，密度生长至约70％。

b:加入终浓度为0.2μg/ml的秋水仙碱，孵育2h。

c:CC2L-iPSCs用0.5mM EDTA进行消化，5min，细胞液离心1000rpm，5min，收集细胞沉淀。

d:细胞沉淀加入8ml的0.075M的氯化钾溶液，37℃孵育20min。

e:用固定液(甲醇:乙酸＝3:1)固定细胞,37℃孵育10min,离心。

f:加入10ml预冷的定影液，重悬细胞。

g:用固定液(甲醇:乙酸＝3:1)固定细胞,37℃孵育10min,离心。

h:加入10ml预冷的定影液，重悬细胞。

i:细胞悬滴冰冻涂片，80℃，2h。

j:脱酶和吉姆萨染色。

k:拍照，核型分析，结果如图6所示，从图6可以看出，该iPSC系细胞具有正常核型，为46,XX。

3、畸胎瘤实验

1)细胞:CC2L-iPSCs；

2)动物：NOD-SCID小鼠

2)试剂及耗材：

a:50X Matrigel：Corning，354277

b:福尔马林：Fisher Scientific，50-00-0

c:苏木素伊红(HE)染色液：Leagene，DH0006

3)仪器：

a:显微镜：尼康

b:石蜡切片机：Leica

4)步骤：

a:含1-2×10⁶的CC2L-iPSCs的mTeSR1混悬液，1:1混合于50X Matrigel中。

b:细胞团通过肌肉注射到NOD-SCID的后肢。

c:移植后8-10周，处死小鼠，分离畸胎瘤。

d:畸胎瘤组织用福尔马林固定，组织脱水，石蜡包埋，常规切片。

e:石蜡切片进行苏木素伊红染色(HE染色)。

f:显微镜观察，拍照，结果如图8所示，从图8可以看出，该细胞系在小鼠体内可发育为含有外胚层(神经组织，左图)、中胚层(软骨组织，中图)，内胚层(肠腔上皮组织，右图)等三胚层结构的畸胎瘤。

4、CC2L-iPSCs的STR鉴定

收集约1x10^6个iPSCs和1x10^6个患者尿液细胞(Urine Cells)，送科佰生物科技(南京)有限公司进行SRT检测，鉴定结果见表2。结果显示获得的CC2L-iPSCs与患者尿液细胞具有相同的短重复序列位点，说明CC2L-iPSCs与患者尿液细胞同源,无交叉污染。

表2. STR鉴定结果