一种高产生物多糖的真菌培养方法
阅读说明：本技术 一种高产生物多糖的真菌培养方法 (Fungus culture method for high-yield biological polysaccharide ) 是由 郭宏亮 林檬 庄秀园 王轩 朱勤健 叶榛 于 2019-01-17 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高产生物多糖的真菌培养方法。具体地,本发明方法采用改良PDA固体培养基活化裂褶菌,通过改进PDA培养基的配方及制备方法,裂褶菌在该改良PDA平板上的生长状态和活性发生显著改变,不仅便于平板件传代、缩短了传代时间,而且显著提高了发酵培养的β-葡聚糖产量。本发明的方法操作简单、成本低,β-葡聚糖产量非常高,并且不含有纤维素类杂质,后期分离纯化简单、纯度高。(The invention provides a fungus culture method for high-yield biological polysaccharide, and particularly relates to a method for activating schizophyllum commune by adopting an improved PDA solid culture medium, wherein the growth state and activity of the schizophyllum commune on an improved PDA flat plate are obviously changed by improving the formula and the preparation method of the PDA culture medium, so that the passage of the flat plate piece is facilitated, the passage time is shortened, and the yield of β -glucan cultured by fermentation is obviously improved.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种高产生物多糖的真菌培养方法。
背景技术
多糖是指一类由10个以上单糖分子聚合而成的天然高分子化合物，广泛分布于动物、植物、微生物(细菌和真菌)和藻类地衣中。多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等功效，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的应用前景。β-葡聚糖是一种天然多糖。其中以β-1,3-糖苷键为骨架的蘑菇葡聚糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能，在保湿、抗皱、抗氧化、抗紫外、促进伤口愈合等方面也具有显著效果，此外，与传统的酵母或谷物葡聚糖相比，蘑菇葡聚糖具有更均一稳定的结构、更高的分子质量及更为优良的水溶性。因此高粘度、高透光率的蘑菇β-葡聚糖溶液广泛应用于食品、化妆品及制药领域，制备高粘度、高透光率的蘑菇β-葡聚糖溶液具有重要的意义。
目前，β-葡聚糖的提取方法主要有两种，其一是从燕麦等谷物或蘑菇等子实体真菌中直接提取；其二是通过真菌或细菌的液体发酵，经由对发酵液进行提取加工，以获得β-葡聚糖。发酵法制备β-葡聚糖的前提在于获得高β-葡聚糖含量的发酵液，传统的发酵方法β-葡聚糖产量通常较低，或者在培养基使用纤维素或其衍生物，导致最终产品中混入难以分离的纤维素类杂质。
因此，本领域迫切需要一种高产β-葡聚糖的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过液体发酵获得高含量β-葡聚糖发酵液的方法。
本发明的第一方面，提供了一种生产β-葡聚糖的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供改良PDA固体培养基，并在所述改良PDA固体培养基上培养裂褶菌；
(2)将上一步骤培养获得的裂褶菌接种于种子培养基中并进行培养，得到菌悬液；和
(3)将上一步骤培养获得的菌悬液转接于发酵培养基中并进行培养，得到β-葡聚糖；
其中，在步骤(1)中，所述改良PDA固体培养基为含有固体颗粒的PDA固体培养基，其中所述固体颗粒包括：土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述土豆为未浸煮或浸煮后的土豆。
在另一优选例中，所述玉米粗粉为玉米(粒)经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述豆粕粗粉为豆粕经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述玉米芯粗粉为玉米芯经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基中含有5-10wt％固体颗粒，以改良PDA固体培养基的总重量计。
在另一优选例中，所述固体颗粒的平均粒径d为0.15mm-5mm(100目-4目)，较佳地0.18mm-3mm(80目-6目)，更佳地0.18mm-1mm(80目-16目)。
在另一优选例中，所述玉米粗粉、豆粕粗粉或玉米芯粗粉的粒径为0.15mm-0.85mm，较佳地为0.18mm-0.425mm。
在另一优选例中，所述土豆粗粉的平均粒径d为0.15mm-5mm，较佳地0.18mm-3mm，更佳地0.18mm-1mm。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为浸煮后的土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述浸煮为在80℃以上的水中浸煮，较佳地90-100℃的水中浸煮。
在另一优选例中，所述浸煮的时间为0.5-2.5小时，较佳地为0.5-1.5小时。
在另一优选例中，所述PDA固体培养基配方包括：950-1000mL/L马铃薯汁、18-22g/L葡萄糖和15-20g/L琼脂，按PDA培养基的总体积计；较佳地，所述PDA固体培养基的PH为5.5-6.5。
在另一优选例中，所述的马铃薯汁采用以下方法制备：去皮土豆，加水煮烂，(八层纱布)过滤取汁，其中去皮土豆的质量体积比为180-220g/L，按马铃薯汁的总体积计。
在另一优选例中，所述种子培养基和/或发酵培养基中含有固型不溶物。
在另一优选例中，所述固型不溶物选自下组：珍珠岩、黄豆粉、玉米粉、豆粕粉、玉米糁粉碎物、玉米芯粉碎物、或其组合。
在另一优选例中，所述固型不溶物的含量为0.1-5wt％，按培养基的总质量计。
在另一优选例中，所述种子培养基和/或发酵培养基中不含纤维素或其衍生物。
在另一优选例中，所述种子培养基含有：20-90g/L葡萄糖、0.5-5g/L酵母膏、0.5-5g/L酪蛋白胨、0.5-5g/L NH4Cl、0.2-2g/L KH2PO4、0.2-2g/L MgSO4·7H2O、0.2-2g/LMnSO4·H2O、0.5-5g/L玉米粉、0.1-2g/L CaCO3，按种子培养基的总体积计。
在另一优选例中，所述发酵培养基选自下组：MRS培养基或改良MRS培养基。
在另一优选例中，所述发酵培养基选自下组中一种或多种培养基：
培养基A：20-150g/L葡萄糖、1-3g/L酵母膏、1-3g/L KH2PO4、0.5-1.5g/L MgSO4·7H2O；
培养基B：10-40g/L胰蛋白胨、2-10g/L Ca(NO3)2·4H2O、0.5-3g/L KH2PO4、0.5-1.5g/L MgSO4·7H2O、0.5-3mL/L微量元素I(1.6g/L MnSO4·H2O、2.4g/L ZnSO4·7H2O、2g/LCaCl2·6H2O)、0.5-3mL/L微量元素II(5g/L FeSO4·7H2O)；
培养基C：25-30g/L葡萄糖、10-15g/L山梨醇、0.2-0.8g/L KH2PO4、3-5g/L MgSO4·7H2O、0.5-1g/L(NH4)2SO4、0.1-0.5g/L三乙胺盐酸盐、0.5-3mL/L微量元素(16-20g/LNa2EDTA、2.5-3.0g/L ZnSO4·7H2O、2.2-2.6g/L FeSO4·7H2O、0.06-0.12g/L CoSO4·7H2O、0.1-0.3g/L CuCl2·7H2O、12-16g/L NaBO2·4H2O、0.06-0.12g/L Na2MoO4·2H2O、0.22-0.26g/L NiCl2·2H2O)；
培养基D：10-200g/L葡萄糖、1-50g/L酵母膏、1-50g/L牛肉膏、1-10g/L(NH4)2SO4、1-10g/L KH2PO4、0.1-5g/L MgSO4·7H2O、1-100g/L吸附树脂HS1。
在另一优选例中，所述发酵培养基为改良MRS培养基。
在另一优选例中，所述改良MRS培养基为由MRS培养基改良得到的培养基。
在另一优选例中，所述改良MRS培养基含有：60-200g/L葡萄糖、1-10g/L酵母膏、1-10g/L酪蛋白胨、1-20g/L NH4Cl、0.5-5g/L KH2PO4、0.2-2g/L MgSO4·7H2O、0.2-2g/LMnSO4·H2O、1-20g/L珍珠岩、1-20g/L玉米粉、1-20g/L黄豆粉、0.1-3g/L CaCO3，按培养基的总体积计。
在另一优选例中，步骤(1)中，在所述改良PDA固体培养基中培养裂褶菌，并传代n次，其中n为1-6的正整数，例如1、2、3、4、5或6次。
在另一优选例中，所述传代是在改良PDA固体培养基或普通PDA固体培养基上进行传代的。
在另一优选例中，所述传代包括至少在改良PDA固体培养基上传代1次。
在另一优选例中，所述方法中，所述培养的温度为25-30℃。
在另一优选例中，步骤(1)和/或步骤(2)中，所述培养的时间为4-8天，较佳地5-7天。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述培养的转速为120-180rpm，较佳地140-160rpm。
在另一优选例中，所述种子培养基的体积为100-300mL，较佳地为150-250mL，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为4-8天，较佳地5-7天；培养的摇床转速为120-180rpm，较佳地140-160rpm。
在另一优选例中，所述种子培养基的体积为2-4L，较佳地为2.5-3.5L，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为3-6天，较佳地3-4天；培养的搅拌转速为100-400rpm，较佳地200-300rpm；通气为0.2-0.6m3/h，较佳地0.3-0.4m3/h。
在另一优选例中，所述种子培养基的体积为20-40L，较佳地为25-35L，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为3-7天，较佳地3-5天；培养的搅拌转速为120-300rpm，较佳地200-240rpm；通气为2-5m3/h，较佳地2-3m3/h。
在另一优选例中，所述种子培养基的体积为200-400L，较佳地为250-350L，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为3-7天，较佳地3-5天；培养的搅拌转速为50-150rpm，较佳地80-120rpm；通气为15-30m3/h，较佳地20-25m3/h。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述培养的时间为5-12天，较佳地6-10天。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述菌悬液以0.5-20％的接种量转接到种子或发酵培养基中。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述发酵培养基的体积为200-4000L，较佳地200-3500L。
在另一优选例中，所述发酵培养基的体积为100-300mL，较佳地为150-250mL，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为5-9天，较佳地6-8天；培养的摇床转速为120-180rpm，较佳地140-160rpm。
在另一优选例中，所述发酵培养基的体积为2-4L，较佳地为2.5-3.5L，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为6-12天，较佳地8-10天；培养的搅拌转速为100-400rpm，较佳地200-300rpm；通气为0.2-0.6m3/h，较佳地0.3-0.4m3/h。
在另一优选例中，所述发酵培养基的体积为20-40L，较佳地为25-35L，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为6-12天，较佳地8-10天；培养的搅拌转速为120-300rpm，较佳地200-240rpm；通气为2-5m3/h，较佳地3-4m3/h。
在另一优选例中，所述发酵培养基的体积为200-400L，较佳地为250-350L，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为8-14天，较佳地10-12天；培养的搅拌转速为50-150rpm，较佳地80-120rpm；通气为15-30m3/h，较佳地20-25m3/h。
在另一优选例中，所述发酵培养基的体积为2000-4000L，较佳地为2500-3500L，且所述培养的温度为25-30℃；所述培养的时间为6-12天，较佳地8-10天；培养的搅拌转速为20-120rpm，较佳地40-80rpm；通气为60-200m3/h，较佳地100-140m3/h。
在另一优选例中，在步骤(2)之后，步骤(3)之前，还包括对所述的菌悬液进行种子扩大培养。所述种子扩大培养指将种子培养基中培养的菌体转接到下一级种子培养基中扩大培养，以获得更多数量或更优质量的菌体。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(4)从步骤(3)培养获得的发酵液中提取β-葡聚糖。
在另一优选例中，所述提取包括：
(i)将步骤(3)培养获得的发酵液与水混合，水的体积V2与发酵液体积V1的比值V2/V1为1-3；
(ii)加热至60-80℃保持1-10h，分离得到上清液；
(iii)将步骤(ii)中的上清液与醇类(包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、聚醇等，优选为乙醇)混合，析出β-葡聚糖；以及
任选地(iv)干燥所述的β-葡聚糖。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(5)纯化所述的β-葡聚糖。
在另一优选例中，所述方法生产得到的β-葡聚糖的产量为7-100g/L。
在另一优选例中，所述方法生产得到的β-葡聚糖的分子量≥2kD，较佳地2kD-40000kD，更佳地20kD-20000kD。
在另一优选例中，所述方法生产得到的β-葡聚糖的分子量为5kD-35000kD；10kD-30000kD；50kD-25000kD；100kD-20000kD；200kD-18000kD；400kD-16000kD；500kD-14000kD；1000kD-12000kD；2000kD-4000kD；3000kD-5000kD；4000kD-6000kD；5000kD-7000kD；6000kD-8000kD；7000kD-9000kD；或者8000kD-10000kD。
在另一优选例中，所述方法生产得到的β-葡聚糖的0.5％溶液(25℃)的黏度≥40mPa·s，较佳地100-10000mPa·s，较佳地500-2000mPa·s，较佳地800-1500mPa·s，更佳地1000-1200mPa·s。
在另一优选例中，所述方法生产得到的β-葡聚糖的0.5％溶液的透光率88％-100％，较佳地92％-100％。
本发明的第二方面，提供了一种β-葡聚糖，所述β-葡聚糖是用本发明第一方面所述的生产β-葡聚糖的方法制备的。
本发明的第三方面，提供了一种制剂，所述制剂含有(a)本发明第二方面所述的β-葡聚糖；和(b)药学上、化妆品学上或食品学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的第四方面，提供了一种改良PDA固体培养基，所述改良PDA固体培养基为含有固体颗粒的PDA固体培养基，其中所述固体颗粒包括：土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述土豆为未浸煮或浸煮后的土豆。
在另一优选例中，所述玉米粗粉为玉米(粒)经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述豆粕粗粉为豆粕经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述玉米芯粗粉为玉米芯经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基中含有5-10wt％固体颗粒，以改良PDA固体培养基的总重量计。
在另一优选例中，所述固体颗粒的平均粒径d为0.15mm-5mm，较佳地0.18mm-3mm，更佳地0.18mm-1mm。
在另一优选例中，所述玉米粗粉、豆粕粗粉或玉米芯粗粉的粒径为0.15mm-0.85mm，较佳地为0.18mm-0.425mm。
在另一优选例中，所述土豆粗粉的平均粒径d为0.15mm-5mm，较佳地0.18mm-3mm，更佳地0.18mm-1mm。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为浸煮后的土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述浸煮为在80℃以上的水中浸煮，较佳地90-100℃的水中浸煮。
在另一优选例中，所述浸煮的时间为0.5-2.5小时，较佳地为0.5-1.5小时。
在另一优选例中，所述PDA固体培养基配方包括：950-1000mL/L马铃薯汁、18-22g/L葡萄糖和15-20g/L琼脂，按PDA培养基的总体积计；较佳地，所述PDA固体培养基的PH为5.5-6.5。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基通过在所述PDA固体培养基中添加固体颗粒制备得到，所述固体颗粒包括：土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基通过以下方法制备：
(1)提供土豆(较佳地为每升培养基180-220g土豆块)，将所述土豆与水(较佳地每升培养基400-600mL水)混合并沸煮(较佳地沸煮0.5-5小时)，得到含有浸煮后的土豆的浸煮液；
(2)将所述含有浸煮后的土豆的浸煮液粉碎，并使用8层纱布过滤，得到滤液，并在所述滤液中加入固体颗粒，所述固体颗粒包括土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合，较佳地所述土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉为对应固形物粉碎后得到的固体颗粒；
(3)在所述含有固体颗粒的滤液中加入18-22g/L葡萄糖、15-20g/L琼脂和水，按PDA培养基的总体积计，得到所述改良PDA固体培养基；以及任选地
(4)对所述改良PDA固体培养基进行灭菌。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基通过以下方法制备：
(1)提供土豆(较佳地为每升培养基180-220g土豆块)，将所述土豆与水(较佳地每升培养基400-600mL水)混合并沸煮(较佳地沸煮0.5-5小时)，得到含有浸煮后的土豆的浸煮液；
(2)将所述含有浸煮后的土豆的浸煮液粉碎，并使用2-4层纱布过滤，得到含有土豆粗粉的滤液；
(3)在所述含有土豆粗粉的滤液中加入18-22g/L葡萄糖、15-20g/L琼脂和水，按PDA培养基的总体积计，得到所述改良PDA固体培养基；以及任选地
(4)对所述改良PDA固体培养基进行灭菌。
本发明还提供了一种制备培养基的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供土豆(较佳地为每升培养基180-220g土豆块)，将所述土豆与水(较佳地每升培养基400-600mL水)混合并沸煮(较佳地沸煮0.5-5小时)，得到含有浸煮后的土豆的浸煮液；
(2)将所述含有浸煮后的土豆的浸煮液粉碎，并使用2-4层纱布过滤，得到含有土豆粗粉的滤液；或者，将所述含有浸煮后的土豆的浸煮液粉碎，并使用8层纱布过滤，得到滤液，并在滤液中加入固体颗粒，所述固体颗粒包括土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合，其中所述土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉为对应固形物粉碎后得到的固体颗粒；
(3)在所述含有固体颗粒的滤液中加入18-22g/L葡萄糖、15-20g/L琼脂和水，按PDA培养基的总体积计，得到所述改良PDA固体培养基；以及任选地
(4)对所述改良PDA固体培养基进行灭菌。
本发明还提供了一种土豆粗粉的用途，用于制备培养基，所述土豆粗粉为浸煮后或未浸煮的土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了高产β-葡聚糖的发酵方法。该方法采用改良PDA固体培养基活化裂褶菌，并意外地发现，通过改进PDA培养基的配方及制备方法，裂褶菌在该改良PDA平板上的生长状态、生长速度和活性发生显著改变(例如显著提高裂褶菌菌丝的生长速度和生长密度)，不仅便于平板传代、缩短了传代时间，而且显著提高了发酵培养的β-葡聚糖产量。本发明还发现在种子培养基和/或发酵培养基中添加固形不溶物可以显著提高β-葡聚糖产量。实验表明，本发明的方法操作简单、成本低，β-葡聚糖产量非常高，并且不含有纤维素类杂质，后期分离纯化简单、纯度高。此外，本发明的方法非常适合大规模生产β-葡聚糖。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
裂褶菌
裂褶菌，学名Schizophyllum commune Fr.别名：白参、树花、白花等，是一种担子菌纲伞菌目裂褶菌科的可食用菇菌，在我国分布于我国山西、陕西、黑龙江、四川、贵州、云南等地区。裂褶菌子实体含有除色氨酸外的7种必需氨基酸与锌、铁、钾、钙、磷、硒、锗等矿物质元素、以及烟酸、黄酮等活性物，同时β-葡聚糖的含量高达30-60％，具有清肝明目，滋补强身的功效，是一种药食兼用的珍稀菇菌。
β-葡聚糖
β-葡聚糖是一种天然多糖。在自然环境中可以找到相当多种类的β-葡聚糖，通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌、真菌(灵芝)的细胞壁中，也可存在于高等植物种子的包被中。其中以β-1,3-糖苷键为骨架的蘑菇葡聚糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能，在保湿、抗皱、抗氧化、抗紫外、促进伤口愈合等方面也具有显著效果，此外，与传统的酵母或谷物葡聚糖相比，蘑菇葡聚糖具有更均一稳定的结构、更高的分子质量及更为优良的水溶性。因此高粘度、高透光率的蘑菇β-葡聚糖溶液广泛应用于食品、化妆品及制药领域，制备高粘度、高透光率的蘑菇β-葡聚糖溶液具有重要的意义。
目前，β-葡聚糖的提取方法主要有两种，其一是从燕麦等谷物或蘑菇等子实体真菌中直接提取；其二是通过真菌或细菌的液体发酵，经由对发酵液进行提取加工，以获得β-葡聚糖。发酵法制备β-葡聚糖的前提在于获得高β-葡聚糖含量的发酵液，传统的发酵方法β-葡聚糖产量通常较低，或者在培养基中使用纤维素或其衍生物，导致最终产品中混入难以分离的纤维素类杂质。
本发明方法制得的裂褶菌发酵液中β-葡聚糖(裂褶菌多糖)分子质量高，精制成的β-葡聚糖溶液粘度大，透光率高，具有更好的生物活性，适于各种应用。并且本发明裂褶菌发酵液中不含纤维素或其衍生物，而纤维素及其衍生物的结构与β-葡聚糖相似，不仅影响β-葡聚糖含量的测定，并且不利于β-葡聚糖的分离和纯化。
改良PDA固体培养基
本发明还提供了一种改良PDA固体培养基，所述改良PDA固体培养基为含有固体颗粒的PDA固体培养基，其中所述固体颗粒包括：土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述土豆为未浸煮或浸煮后的土豆。
在另一优选例中，所述玉米粗粉为玉米(粒)经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述豆粕粗粉为豆粕经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述玉米芯粗粉为玉米芯经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基中含有5-10wt％固体颗粒，以改良PDA固体培养基的总重量计。
在另一优选例中，所述固体颗粒的平均粒径d为0.15mm-5mm，较佳地0.18mm-3mm，更佳地0.18mm-1mm。
在另一优选例中，所述玉米粗粉、豆粕粗粉或玉米芯粗粉的粒径为0.15-0.85mm，较佳地为0.18-0.425mm。
在另一优选例中，所述土豆粗粉的平均粒径d为0.15mm-5mm，较佳地0.18mm-3mm，更佳地0.18mm-1mm。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为浸煮后的土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述PDA固体培养基配方包括：950-1000mL/L马铃薯汁、18-22g/L葡萄糖和15-20g/L琼脂，按PDA培养基的总体积计；较佳地，所述PDA固体培养基的PH为5.5-6.5。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基通过在所述PDA固体培养基中添加固体颗粒制备得到，所述固体颗粒包括：土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合。
在另一优选例中，所述玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉为对应固形物粉碎过筛后的保留物。
本发明的方法采用改良PDA固体培养基活化裂褶菌。改良PDA平板上裂褶菌的生长形态、生长速度、活性和普通PDA平板上有显著差异，有利于平板传代、与平板到种子培养基的接种，并通过种子培养影响最终的发酵水平。
具体地，通过改进PDA培养基的配方，裂褶菌在该改良PDA平板上的生长状态和生长活性发生显著改变，例如显著提高裂褶菌菌丝的生长速度和生长密度、生长的菌丝更为茂盛蓬松，不仅便于平板件传代、缩短了传代时间，而且显著提高了后期发酵培养生产β-葡聚糖的产量。
在本发明中，“PDA固体培养基”或“普通PDA固体培养基”可互换使用，均指未经过改良的常规PDA固体培养基。本发明的PDA固体培养基可以通过常规方法制备。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基通过以下方法制备：
取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取180-220g，加入500mL纯净水，沸煮1小时；然后取出浸煮液(包含土豆块)使用粉碎机搅打10-30秒，取出粉碎物，使用2-4层纱布进行过滤，取滤液，其中含有能够被滤出的土豆粗粉，加入18-22g葡萄糖与15-20g琼脂，使用纯净水定容至1000mL，并灭菌，制成改良PDA固体培养基。
在另一优选例中，所述改良PDA固体培养基通过以下方法制备：
取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取200g，加入500mL纯净水，沸煮直至土豆块能够被玻璃棒戳碎，使用八层纱布进行过滤，取滤液，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂与5-10g过筛后80-20目(0.18-0.85mm)玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合物，使用纯净水定容至1000mL，后隔水沸浴至琼脂完全溶解；121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至约65℃后倒平板，制成改良PDA平板培养基。
在另一优选例中，本发明一种制备普通PDA固体培养基的方法如下：
取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取200g，加入500mL纯净水，沸煮直至土豆块能够被玻璃棒戳碎，使用八层纱布进行过滤，取滤液，加入20g葡萄糖与15-20g琼脂，使用纯净水定容至1000mL，后隔水沸浴至琼脂完全溶解；121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至约65℃后倒平板，制成普通PDA平板培养基。
本发明的方法
本发明提供一种通过液体发酵获得高含量β葡聚糖发酵液的方法。典型地，所述方法包括以下步骤：
(1)提供改良PDA固体培养基，并在所述改良PDA固体培养基上培养裂褶菌；
(2)将上一步骤培养获得的裂褶菌接种于种子培养基中并进行培养，得到菌悬液；和
(3)将上一步骤培养获得的菌悬液转接于发酵培养基中并进行培养，得到β-葡聚糖；
其中，在步骤(1)中，所述改良PDA固体培养基为含有固体颗粒的PDA固体培养基，其中所述固体颗粒包括：土豆粗粉、玉米粗粉、豆粕粗粉、玉米芯粗粉、或其组合。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述土豆为未浸煮或浸煮后的土豆。
在另一优选例中，所述玉米粗粉为玉米(粒)经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述豆粕粗粉为豆粕经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述玉米芯粗粉为玉米芯经粉碎后得到的固体颗粒。
在另一优选例中，所述土豆粗粉为浸煮后的土豆经粉碎后得到的固体颗粒。
为了更好地理解本发明，本发明人提供具体的步骤供参考。应理解，本发明的权利要求所限定的保护范围并不受该具体步骤的限定。具体地，本发明方法包括步骤：
本发明所提供的通过液体发酵获得高含量β-葡聚糖发酵液的方法，包括下述步骤：
1)将裂褶菌菌株(冻存株)接种于改良PDA平板培养基；PDA培养基配制方法经过改良，在处理土豆浸煮液的过程中，通过对土豆进行破碎，并经由粗过滤保留部分土豆碎屑；裂褶菌在改良PDA平板培养基上静置培养，25-30℃生长5-7天，继续下级传代；
2)将1)得到的成熟裂褶菌菌丝，依照1)中所述方法在改良PDA平板上再次传代1-3次，至裂褶菌菌丝稳定在6天内生长覆盖整块平板；
3)将2)得到的成熟裂褶菌菌丝接种于PDA平板(商用成品或依照标准方法自制)，裂褶菌在PDA平板培养基静置培养，25-30℃生长5-7天，直至裂褶菌菌丝生长覆盖整块平板；
4)将3)得到生长有裂褶菌菌丝的PDA平板培养基，切割成约0.3*0.3cm2的小块，然后接入摇瓶种子培养基，每200mL培养基接入15-40块带菌丝的琼脂块；25-30℃、100-200rpm震荡培养5-7天；
5)将4)得到的成熟摇瓶种子以0.5-20％的比例接入改良MRS培养基(基于MRS培养基进行改良，以提高β葡聚糖产量)，根据不同发酵容器，选择适宜的震荡、通气或搅拌条件，25-30℃发酵6-9天；
6)取适量5)得到的发酵液加入3倍体积的纯净水，混合均匀后80℃浸煮4h，然后12000rpm离心5min；取离心分离后的上清加入3倍体积的无水乙醇进行醇析，以分离发酵液中的多糖，将得到的多糖析出物置于60℃烘箱干燥48h；
7)将6)中离心分离得到的菌体沉淀，重复6)中所述的浸煮、醇析与干燥，根据发酵液的多糖产量，菌体沉淀需要重复浸提2-3次；
8)将6)-7)中得到的干燥多糖进行称重，并换算出单位体积发酵液中的多糖产量；
9)经前述方法培养的裂褶菌发酵液，富含β-葡聚糖，根据发酵环境的不同：在500mL摇瓶中，β-葡聚糖产量可以达到7-10g/L；在5L发酵罐中，β-葡聚糖产量可以达到12-20g/L；在50L发酵罐中，β-葡聚糖产量可以达到16-30g/L；在500L发酵罐及5000L发酵罐中，β-葡聚糖产量可以达到20-100g/L。
本发明的主要优点在于：
1.本法使用的改良PDA固体培养基，通过改变其配方及制备方法，可以显著改变裂褶菌的生长状态和活性，包括显著提高裂褶菌菌丝的生长速度、生长密度和生长活性，并且能够显著提高后期发酵阶段β-葡聚糖的产量和缩短发酵周期。
2.本发明方法使用的种子培养基和/或发酵培养基中，添加了珍珠岩、黄豆粉、玉米粉等固形不溶物，显著提高了β-葡聚糖产量。
3.本发明方法制得的裂褶菌发酵液中β-葡聚糖产量非常高，可以达到7-50g/L，明显高于现有技术水平。
4.种子及发酵培养基中未使用任何纤维素或其衍生物，得到的发酵液精制后不会含有纤维素类杂质，后期分离纯化简单。
5.本方法放大至3000L规模的发酵，β-葡聚糖产量依发酵体积增加而提高，非常适用于大规模生产。
6.本发明方法制得的裂褶菌发酵液中β-葡聚糖分子量高，精制成的β-葡聚糖溶液粘度大，透光率高，具有更高的生物活性，适于各种应用。
7.本发明方法成本低、产量高、纯度高，并且发酵周期短，后期分离纯化简单。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
1)取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取200g，加入500mL纯净水，沸煮60min；使用搅拌机高速粉碎呈泥状，继续沸煮60min；使用双层纱布进行过滤，取滤液，加入20g葡萄糖与15-20g琼脂，使用纯净水定容至1000mL，后隔水沸浴至琼脂完全溶解；121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至约65℃后倒平板，制成改良PDA平板培养基，待用；
2)将装有裂褶菌菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，编号5.120)的冻存管从超低温冰箱中取出，置入超净工作台；冻存管置于手心解冻，然后取200μL滴加于1)中所制备的改良PDA平板培养基上，涂布均匀后，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
3)取2)中所述接种有冻存裂褶菌的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入4团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
4)取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取200g，加入500mL纯净水，沸煮直至土豆块能够被玻璃棒戳碎，使用八层纱布进行过滤，取滤液，加入20g葡萄糖与15-20g琼脂，使用纯净水定容至1000mL，后隔水沸浴至琼脂完全溶解；121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至约65℃后倒平板，制成普通PDA平板培养基，待用；
5)取3)中所述接种有裂褶菌菌丝团的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的普通或改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入6团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
6)取纯净水适量，加入20-90g葡萄糖、0.5-5g酵母膏、0.5-5g酪蛋白胨、0.5-5gNH4Cl、0.2-2g KH2PO4、0.2-2g MgSO4·7H2O、0.2-2g MnSO4·7H2O、0.5-5g玉米粉、0.1-2gCaCO3，混匀后定容至1000mL，取500mL三角烧瓶分装入200mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，制成种子培养基，待用；
7)取5)中所述接种有裂褶菌菌丝团的普通或改良PDA平板，置入超净工作台；使用手术刀切割出1-4cm2的带菌琼脂块，接入1瓶6)所述装有200mL种子培养基的三角烧瓶中，重新封口，置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养5-7天；
8)取纯净水适量，加入60-200g葡萄糖、1-10g酵母膏、1-10g酪蛋白胨、1-20gNH4Cl、0.5-5g KH2PO4、0.2-2g MgSO4·7H2O、0.2-2g MnSO4·7H2O、1-20g珍珠岩、1-20g玉米粉、1-20g黄豆粉、0.1-3g CaCO3，混匀后定容至1000mL，分装至不同容器后，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，制成发酵培养基，待用；
9)取7)中所述接种有裂褶菌的种子培养基，置入超净工作台以15％的接种比例接入8)所述装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中，用平板封口膜密封；置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养7-9天；
10)取9)中制得的裂褶菌发酵液25mL，加入25mL纯净水，混合均匀后80℃水浴浸煮4h，之后12000rpm离心，分离上清与沉淀；上清液加入3倍体积95％食用乙醇，混合均匀后令其中的β-葡聚糖固化析出，之后60-70℃干燥至衡重；沉淀部分重复浸煮、离心及醇析1-2次，至发酵液中β-葡聚糖被充分提取；根据多次浸提得到的干燥物总质量，计算该批次发酵的β-葡聚糖产量；
11)经检测，发酵液中β-葡聚糖产量可以为7.212g/L。
实施例2
1)取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取200g，加入500mL纯净水，沸煮直至土豆块能够被玻璃棒戳碎，使用八层纱布进行过滤，取滤液，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂与10g过筛后20-80目粗粒径玉米粉，使用纯净水定容至1000mL，后隔水沸浴至琼脂完全溶解；121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至约65℃后倒平板，制成改良PDA平板培养基；
2)将装有裂褶菌菌株的冻存管从超低温冰箱中取出，置入超净工作台；冻存管置于手心解冻，然后取200μL滴加于1)中所制备的改良PDA平板培养基上，涂布均匀后，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
3)取2)中所述接种有冻存裂褶菌的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入4团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
4)依实施例1所述方法，配制普通PDA平板培养基，待用；
5)取3)中所述接种有裂褶菌菌丝团的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的普通或改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入6团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
6)依实施例1所述方法，配制并分装种子培养基，待用；
7)取5)中所述接种有裂褶菌菌丝团的普通或改良PDA平板，置入超净工作台；使用手术刀切割出1-4cm2的带菌琼脂块，接入数瓶6)所述装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，重新封口，置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养5-7天；
8)依实施例1所述方法，配制发酵培养基并装入5L发酵罐，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，待用；
9)取7)中所述接种有裂褶菌的种子培养基，通过火焰接种以20％的接种比例接入8)所述装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，25-30℃，100-600rpm搅拌，0.5-3vvm通气培养7-9天；
10)取9)中制得的裂褶菌发酵液，依实施例1所述方法，检测该批次发酵的β-葡聚糖产量；
11)经检测，发酵液中β-葡聚糖产量可以为15.877g/L。
实施例3
1)取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取200g，加入500mL纯净水，沸煮直至土豆块能够被玻璃棒戳碎，使用八层纱布进行过滤，取滤液，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂与5g过筛后20-80目粗粒径豆粕粉，使用纯净水定容至1000mL，后隔水沸浴至琼脂完全溶解；121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至约65℃后倒平板，制成改良PDA平板培养基；
2)将装有裂褶菌菌株的冻存管从超低温冰箱中取出，置入超净工作台；冻存管置于手心解冻，然后取200μL滴加于1)中所制备的改良PDA平板培养基上，涂布均匀后，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
3)取2)中所述接种有冻存裂褶菌的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入4团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
4)依实施例1所述方法，配制普通PDA平板培养基，待用；
5)取3)中所述接种有裂褶菌菌丝团的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的普通或改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入6团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
6)依实施例1所述方法，配制并分装种子培养基，待用；
7)取5)中所述接种有裂褶菌菌丝团的普通或改良PDA平板，置入超净工作台；使用手术刀切割出1-4cm2的带菌琼脂块，接入数瓶6)所述装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，重新封口，置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养5-7天；
8)依实施例1所述方法，于100L发酵罐内配制种子培养基，121-126℃高压蒸汽灭菌30分钟，待用；
9)取7)中所述接种有裂褶菌的种子培养基，通过火焰接种以0.1-5％的接种比例接入8)所述装有60L种子培养基的100L发酵罐中，25-30℃，100-300rpm搅拌，0.5-3vvm通气培养4-6天；
10)依实施例1所述方法，于500L发酵罐内配制发酵培养基，121-126℃高压蒸汽灭菌30分钟，待用；
11)取9)中所述接种有裂褶菌的种子液，通过发酵罐间的移种管道以10-20％的接种比例接入10)所述装有200-350L发酵培养基的500L发酵罐中，25-30℃，100-200rpm搅拌，0.5-3vvm通气培养7-10天；
12)取11)中制得的裂褶菌发酵液，依实施例1所述方法，检测该批次发酵的β-葡聚糖产量；
10)经检测，发酵液中β-葡聚糖产量可以为22.212g/L。
实施例4
1)取新鲜土豆若干，去皮后切成均匀小块；称取200g，加入500mL纯净水，沸煮直至土豆块能够被玻璃棒戳碎，使用八层纱布进行过滤，取滤液，加入20g葡萄糖、15-20g琼脂、5g过筛后20-80目粗粒径玉米糁粉碎物、5g过筛后20-80目粗粒径玉米芯粉碎物，使用纯净水定容至1000mL，后隔水沸浴至琼脂完全溶解；121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至约65℃后倒平板，制成改良PDA平板培养基；
2)将装有裂褶菌菌株的冻存管从超低温冰箱中取出，置入超净工作台；冻存管置于手心解冻，然后取200μL滴加于1)中所制备的改良PDA平板培养基上，涂布均匀后，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
3)取2)中所述接种有冻存裂褶菌的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入4团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
4)依实施例1所述方法，配制普通PDA平板培养基，待用；
5)取3)中所述接种有裂褶菌菌丝团的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的普通或改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入6团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
6)依实施例1所述方法，配制并分装种子培养基，待用；
7)取5)中所述接种有裂褶菌菌丝团的普通或改良PDA平板，置入超净工作台；使用手术刀切割出1-4cm2的带菌琼脂块，接入数瓶6)所述装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，重新封口，置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养5-7天；
8)依实施例1所述方法，于1000L发酵罐内配制种子培养基，121-126℃高压蒸汽灭菌30分钟，待用；
9)取7)中所述接种有裂褶菌的种子培养基，通过火焰接种以0.1-5％的接种比例接入8)所述装有600L种子培养基的1000L发酵罐中，25-30℃，50-200rpm搅拌，0.5-3vvm通气培养4-6天；
10)依实施例1所述方法，于5000L发酵罐内配制发酵培养基，121-126℃高压蒸汽灭菌30分钟，待用；
11)取9)中所述接种有裂褶菌的种子液，通过发酵罐间的移种管道以10-20％的接种比例接入10)所述装有2000-3500L发酵培养基的5000L发酵罐中，25-30℃，20-100rpm搅拌，0.5-3vvm通气培养7-10天；
12)取11)中制得的裂褶菌发酵液，依实施例1所述方法，检测该批次发酵的β-葡聚糖产量；
10)经检测，发酵液中β-葡聚糖产量可以为31.762g/L。
实施例5低固形物发酵培养基的发酵结果
1)依实施例1所述方法，配制改良PDA平板培养基，待用；
2)将装有裂褶菌菌株的冻存管从超低温冰箱中取出，置入超净工作台；冻存管置于手心解冻，然后取200μL滴加于1)中所制备的改良PDA平板培养基上，涂布均匀后，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
3)取2)中所述接种有冻存裂褶菌的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的改良PDA平板培养基上，每块平板嵌入4团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
4)依实施例1所述方法，配制普通PDA平板培养基，待用；
5)取3)中所述接种有裂褶菌菌丝团的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的普通PDA平板培养基上，每块平板嵌入6团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养5-7天，待用；
6)依实施例1所述方法，配制并分装种子培养基，待用；
7)取5)中所述接种有裂褶菌菌丝团的普通PDA平板，置入超净工作台；使用手术刀切割出1-4cm2的带菌琼脂块，接入数瓶6)所述装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，重新封口，置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养5-7天；
8)依照如下配方：葡萄糖60-200g/L、酵母膏1-10g/L、酪蛋白胨1-10g/L、NH4Cl1-20g/L、KH2PO4 0.5-5g/L、MgSO4·7H2O 0.2-2g/L、MnSO4·H2O 0.2-2g/L、1-20g黄豆粉、CaCO3 0.1-3g/L，制成低固形物发酵培养基3L，并装入5L发酵罐，121℃高压蒸汽灭菌30分钟，待用；
9)取7)中所述接种有裂褶菌的种子培养基，通过火焰接种以20％的接种比例接入8)所述装有3L低固形物发酵培养基的5L发酵罐中，25-30℃，100-600rpm搅拌，0.5-3vvm通气培养7-9天；
10)取9)中制得的裂褶菌发酵液，依实施例1所述方法，检测该批次发酵的β-葡聚糖产量；
11)经检测，发酵液中β-葡聚糖产量为13.136g/L。
对比例1使用未改良的普通PDA平板培养后的发酵结果
1)将装有裂褶菌菌株的冻存管从超低温冰箱中取出，置入超净工作台；冻存管置于手心解冻，然后取200μL滴加于1)中所制备的普通PDA平板培养基上，涂布均匀后，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养7-9天，待用；
2)取1)中所述接种有冻存裂褶菌的普通PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的普通PDA平板培养基上，每块平板嵌入4团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养7-9天，待用；
3)取2)中所述接种有裂褶菌菌丝团的改良PDA平板，置入超净工作台；使用接种针，挑取小团菌丝，并嵌入新鲜的普通PDA平板培养基上，每块平板嵌入6团菌丝，用平板封口膜密封；置于恒温培养箱25-30℃培养7-9天，待用；
4)取纯净水适量，加入20-90g葡萄糖、0.5-5g酵母膏、0.5-5g酪蛋白胨、0.5-5gNH4Cl、0.2-2g KH2PO4、0.2-2g MgSO4·7H2O、0.2-2g MnSO4·7H2O、0.5-5g玉米粉、0.1-2gCaCO3，混匀后定容至1000mL，取500mL三角烧瓶分装入200mL培养基，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，制成种子培养基，待用；
5)取3)中所述接种有裂褶菌菌丝团的普通PDA平板，置入超净工作台；使用手术刀切割出1-4cm2的带菌琼脂块，接入1瓶4)所述装有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，重新封口，置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养7-10天；
6)取纯净水适量，加入60-200g葡萄糖、1-10g酵母膏、1-10g酪蛋白胨、1-20gNH4Cl、0.5-5g KH2PO4、0.2-2g MgSO4·7H2O、0.2-2g MnSO4·7H2O、1-20g珍珠岩、1-20g玉米粉、1-20g黄豆粉、0.1-3g CaCO3，混匀后定容至1000mL，分装至不同容器后，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，制成发酵培养基，待用；
7)取5)中所述接种有裂褶菌的种子培养基，置入超净工作台以15％的接种比例接入6)所述装有200mL发酵培养基的500mL摇瓶中，用平板封口膜密封；置于恒温摇床，25-30℃，120-180rpm震荡培养7-9天；
8)取7)中制得的裂褶菌发酵液25mL，加入25mL纯净水，混合均匀后80℃水浴浸煮4h，之后12000rpm离心，分离上清与沉淀；上清液加入3倍体积95％食用乙醇，混合均匀后令其中的β-葡聚糖固化析出，之后60-70℃干燥至衡重；沉淀部分重复浸煮、离心及醇析1-2次，至发酵液中β-葡聚糖被充分提取；根据多次浸提得到的干燥物总质量，计算该批次发酵的β-葡聚糖产量；
9)经检测，发酵液中β-葡聚糖产量可以为4.267g/L。同时整个发酵周期被显著延长。
结果表明，使用改良PDA固体培养基培养裂褶菌后发酵得到的β-葡聚糖产量(7.212g/L)，明显高于未改良的普通PDA平板培养裂褶菌发酵得到的β-葡聚糖产量，提高了约69％。
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