阅读说明：本技术 荧光差分超分辨成像方法及成像系统 (Fluorescence differential super-resolution imaging method and imaging system ) 是由 严伟 王璐玮 屈军乐 高欣慰 黄仰锐 于 2020-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种荧光差分超分辨成像方法及成像系统。通过调整系统中角反射器的位置延长或缩短一束高斯脉冲激光在第一光路中传播的光程并转换为环形脉冲激光后聚焦照射样品,另一束高斯脉冲激光沿第二光路传播聚焦照射样品,照射样品的环形脉冲激光与高斯脉冲激光之间的脉冲间隔大于荧光染料的荧光寿命,通过两个探测器分别采集得到激发光脉冲信号及荧光信号。从荧光信号中分离出第一图像及第二图像,根据图像处理规则对第一图像及第二图像进行分析处理后得到分辨率进一步提升的目标超分辨图像。通过上述方法,采用低功率的脉冲激光减小了对生物样品的破坏,解决了传统荧光差分超分辨成像时因像素失配导致超分辨图像质量下降的问题。(The invention discloses a fluorescence differential super-resolution imaging method and an imaging system. The position of a corner reflector in the system is adjusted to prolong or shorten the optical path of one beam of Gaussian pulse laser transmitted in a first optical path and convert the optical path into annular pulse laser to focus and irradiate a sample, the other beam of Gaussian pulse laser transmits and focuses and irradiates the sample along a second optical path, the pulse interval between the annular pulse laser and the Gaussian pulse laser irradiating the sample is longer than the fluorescence life of the fluorescent dye, and an excitation light pulse signal and a fluorescence signal are acquired by two detectors respectively. And separating the first image and the second image from the fluorescence signal, and analyzing and processing the first image and the second image according to an image processing rule to obtain a target super-resolution image with further improved resolution. By the method, the damage to the biological sample is reduced by adopting the low-power pulse laser, and the problem of the quality reduction of the super-resolution image caused by pixel mismatch in the traditional fluorescence differential super-resolution imaging is solved.)

荧光差分超分辨成像方法及成像系统

技术领域

本发明涉及超分辨光学显微成像的技术领域，尤其涉及一种荧光差分超分辨成像方法及成像系统。

背景技术

活细胞和组织成像对生物医学领域的研究至关重要，除了正确的细胞培养条件和样品制备方法，先进的成像方法及成像系统可以在保持被观测样品自身生物特性的基础上，最大程度地保障获取信息的真实性和有效性。光学显微镜具有非接触、无损伤和特异性的优点，是近代自然科学发展开端的重要标志，它可以很好地应用于活细胞和组织的成像。但是，光的衍射限制了光学显微镜的分辨率能力，使其无法清晰地辨别尺寸在200nm以下的微观生物结构。超分辨光学显微镜(Super-resolution optical microscopy,SRM)技术继承了光学显微镜的非接触和特异性优点，通过物理化学原理将光学显微镜的分辨率提升1～2个数量级，可以在分子水平了解生命的发展变化规律，揭示生物体的抗/耐药性和干预治疗作用的细胞分子机理，是本世纪光学显微成像领域最重大的突破之一。近年来，超分辨光学成像技术的快速发展让光学显微镜与生物医学等领域的联系更加紧密，但是现有的技术对样品(制备)和荧光染料有着极其严格的要求，限制了在活体生物成像中的应用。

1994年，德国科学家StefanW.Hell根据爱因斯坦辐射理论提出受激发射损耗(Stimulated emission depletion,STED)显微技术。基于荧光饱和与激发态荧光受激辐射之间的非线性关系，STED技术利用第二束波长红移的激光对激发态分子提前进行选择性耗散，通过压缩激发光斑的有效点扩展函数提高成像分辨率，理论上可以实现三维空间上纳米级的分辨率。作为第一个理论上提出和实验中实现的远场超分辨成像方法，STED技术具有快速成像和无需后期图像重构的优势。但是，为了避免再激发效应对超分辨图像质量的影响，损耗激光波长通常位于荧光染料发射光谱尾端。由于发射光谱尾端的受激辐射截面极小，STED技术需要极高的损耗能量(通常比激发光能量高三个数量级以上)实现分辨率的提升。过高的激光能量会引起光漂白和光毒性，对荧光探针和生物组织产生破坏，因此限制了该技术在活细胞和组织成像中的应用。2013年，浙江大学匡翠方教授基于压缩激发光斑点扩展函数的思想，提出了一种荧光发射差分(Fluorescence emission difference,FED)超分辨成像方法，通过从高斯光斑激发的共聚焦图像中减去一幅由环形光斑激发的负共聚焦图像，在极低的激光能量下实现了超分辨成像。由于不涉及受激辐射过程，该方法简单有效，成像系统简易且造价低。但是，荧光差分需要在样品的同一个位置先后采集两幅图像，成像模式之间的切换和成像时样品自身的移动会产生像素失配(即高斯光斑和环形光斑的非完全重合)，进而严重地降低超分辨图像的质量，因此不适宜活细胞等生物样品的长时间成像研究，无法对生物样品进行长时间观测并获取高分辨率图像。

发明内容

本发明实施例提供了一种荧光差分超分辨成像方法及成像系统，旨在解决现有荧光差分超分辨成像方法中因像素失配导致无法对生物样品进行长时间观测并获取高质量超分辨图像的问题。

第一方面，本发明实施例提供了一种荧光差分超分辨成像方法，其包括：

将被荧光染料染色的样品置于载物台上并调整第一光路中角反射器的位置；

发射高斯脉冲激光并进行分光得到两束高斯脉冲激光，其中一束所述高斯脉冲激光沿第二光路传播后聚焦照射所述样品，另一束所述高斯脉冲激光沿所述第一光路传播并被转换为环形脉冲激光后聚焦照射所述样品，其中，照射所述样品的所述环形脉冲激光与照射所述样品的所述高斯脉冲激光之间的脉冲间隔大于所述荧光染料的荧光寿命；

同时采集所述高斯脉冲激光的激发光脉冲信号以及所述样品被照射后产生的荧光信号，所述荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息；

根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出第一图像及第二图像；

根据预置的图像处理规则对所述第一图像及所述第二图像进行分析处理，以得到高分辨率的目标超分辨图像。

第二方面，本发明实施例提供了一种荧光差分超分辨成像系统，其包括：

信号采集装置及成像处理终端；

所述信号采集装置，用于采集得到所述高斯脉冲激光的激发光脉冲信号作为参考信号，并采集所述样品被照射后产生的荧光信号；

所述成像处理终端，用于对所述信号采集装置所采集的所述激发光脉冲信号及所述荧光信号进行处理以得到所述目标超分辨图像。

本发明实施例提供了一种荧光差分超分辨成像方法及成像系统。通过调整设置于第一光路中角反射器的位置延长或缩短一束高斯脉冲激光在第一光路中进行传播的光程，并将沿第一光路传播的高斯脉冲激光转换为环形脉冲激光后聚焦照射样品，另一束高斯脉冲激光沿第二光路传播聚焦照射样品，照射样品的环形脉冲激光与照射样品的高斯脉冲激光之间的脉冲间隔大于荧光染料的荧光寿命，采集得到的荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息。通过数据处理从荧光信号中分离出第一图像及第二图像，根据图像处理规则对第一图像及第二图像进行分析处理后得到分辨率进一步提升的目标超分辨图像。通过上述方法，采用低功率的激光减小了对生物样品的破坏，降低了荧光染料的光漂白效应，延长了超分辨成像的有效时间，结合图像增强处理得到包含细微结构特征的高分辨率图像，特别适用于对生物样品进行长时间观测并获取高分辨率图像，在实际应用过程中取得了良好的技术效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的流程示意图；

图2为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的子流程示意图；

图3为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的子流程示意图；

图4为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的子流程示意图；

图5为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的子流程示意图；

图6为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的子流程示意图；

图7为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的子流程示意图；

图8为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像系统的示意图；

图9为本发明实施例提供的成像处理终端的示意性框图；

图10为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图；

图11为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图；

图12为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图；

图13为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图；

图14为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。

还应当理解，在此本发明说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明。如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。

还应当进一步理解，在本发明说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。

请参阅图1及图8，图1是为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的流程示意图，图8为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像系统的示意图。该荧光差分超分辨成像方法应用于成像系统中，成像系统包括信号采集装置10及成像处理终端20，该方法通过信号采集装置10结合安装于成像处理终端20中的应用软件进行执行，成像系统即是用于执行荧光差分超分辨成像方法以实现对所述样品进行高分辨率成像的系统装置，信号采集装置10即是用于发射高斯脉冲激光对所述样品进行探测并采集激发光脉冲信号和荧光信号的装置，成像处理终端20即是用于获取信号采集装置所采集的激发光脉冲信及荧光信号后进行成像处理得到目标超分辨图像的终端设备，例如工作站、台式电脑、笔记本电脑、平板电脑或手机等。

如图1所示，该方法包括步骤S110～S150。

S110、将被荧光染料染色的样品置于载物台上并调整第一光路中角反射器的位置。

将被荧光染料染色的样品置于载物台上并调整第一光路中角反射器的位置。首先采用荧光染料对样品进行染色，具体的，样品可以是活细胞、病毒或组织等生物材料，荧光染料即为被激光照射后产生自发荧光信号的材料，角反射器设置于第一光路中，高斯脉冲激光可分别沿第一光路及第二光路进行传播，调节角反射器的位置可延长或缩短高斯脉冲激光在第一光路中进行传播的光程，以改变高斯脉冲激光在第一光路及第二光路进行传播的光程间隔。

图14为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图，具体的，如图14所示，未调节角反射器时角反射器位于图14中位置①处，高斯脉冲激光沿第一光路传播的光程(光沿某一路径传播一定路程所需的时间)为τ₁，此时第一光路与第二光路之间的光程间隔为Δτ₁(光程间隔也即等于照射所述样品的所述环形脉冲激光与照射所述样品的所述高斯脉冲激光之间的脉冲间隔时间)；调节角反射器的位置至图14中位置②处，位置①与位置②的距离为S，则高斯脉冲激光沿第一光路传播的光程为τ₁+2S/c，其中c为光速，则此时第一光路与第二光路之间的光程间隔为Δτ₂＝Δτ₁+2S/c。

S120、发射高斯脉冲激光并进行分光得到两束高斯脉冲激光，其中一束所述高斯脉冲激光沿第二光路传播后聚焦照射所述样品，另一束所述高斯脉冲激光沿所述第一光路传播并被转换为环形脉冲激光后聚焦照射所述样品。

发射高斯脉冲激光并进行分光得到两束高斯脉冲激光，其中一束所述高斯脉冲激光沿第二光路传播后聚焦照射所述样品，另一束所述高斯脉冲激光沿所述第一光路传播并被转换为环形脉冲激光后聚焦照射所述样品，其中，照射所述样品的所述环形脉冲激光与照射所述样品的所述高斯脉冲激光之间的脉冲间隔大于所述荧光染料的荧光寿命。

具体的，可在第一光路的角反射器之前设置螺旋相位板，通过螺旋相位板将沿第一光路传播的高斯脉冲激光转换为环形脉冲激光，沿第一光路传播的环形脉冲激光及沿第二光路传播的一束高斯脉冲激光在不同时间分别被聚焦后照射样品，已染色的样品被照射后荧光染料会产生荧光信号，环形脉冲激光可先于高斯脉冲激光对样品进行照射，也可后于高斯脉冲激光对样品进行照射。所发射的激光为高斯脉冲激光(如脉冲频率为80MHz)，激光的频率与激光的脉冲周期呈反比，脉冲周期应至少包含一个完整的自发荧光过程(通常为纳秒及以上的时间量级)。荧光寿命越长，则激光的脉冲周期就要越大，激光的频率就越小。其中，高斯脉冲激光的功率与发光材料的光谱特性有关，通常为0.1-100μW。高斯脉冲激光的功率越大，所得到的环状图像中环形光斑的中心零强度区域越小，且峰值强度越大，照射样品的环形脉冲激光与照射样品的高斯脉冲激光之间的脉冲间隔需大于荧光染料的荧光寿命。所述高斯脉冲激光的脉冲宽度为百皮秒量级，例如，高斯脉冲激光的取值范围可以是0.1-1纳秒，为实现对样品进行超分辨成像，需控制高斯脉冲激光为百皮秒量级(100皮秒＝0.1纳秒)。

S130、同时采集所述高斯脉冲激光的激发光脉冲信号以及所述样品被照射后产生的荧光信号，所述荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息。

同时采集得到高斯脉冲激光的激发光脉冲信号，以及样品被照射后产生的荧光信号，所采集到的高斯脉冲激光的激发光脉冲信号作为荧光寿命探测的起始点；荧光染料被照射后自发辐射产生荧光光子信号，所得到的荧光光子的信号即组成上述荧光信号，荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息，荧光光子的空间信息即为所辐射出的该荧光光子在二维平面上的具体位置信息，荧光分子所辐射出的荧光光子强度在单个脉冲周期内随时间逐渐减弱，荧光光子的时间信息即为采集到该荧光光子相对参考信号到达探测器的时间信息。

S140、根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出第一图像及第二图像。

激发光脉冲信号及荧光信号分别被传输至成像处理终端，通过该成像处理终端对激发光脉冲信号及荧光信号进行解析处理，以得到对所述样品进行高分辨率成像的超分辨图像。具体的，首先根据分割规则及激发光脉冲信号对荧光信号进行分割，得到第一图像及第二图像。若环形脉冲激光后于高斯脉冲激光对样品进行照射，则得到的第一图像为共聚焦图像，第二图像为环状图像，共聚焦图像即为通过高斯脉冲激光照射样品所产生的荧光寿命成像，环状图像即为通过高斯脉冲激光对样品进行照射后再通过环形脉冲激光照射样品所产生的荧光信号图像；若环形脉冲激光先于高斯脉冲激光对样品进行照射，则得到的第一图像为环状图像，环状图像即为通过环形脉冲激光照射样品所产生的环状荧光寿命成像，第二图像为共聚焦图像。

在一实施例中，如图2所示，步骤S140包括子步骤S141、S142、S143和S144。

在本实施例中，环形脉冲激光后于高斯脉冲激光对样品进行照射，得到的第一图像为共聚焦图像，第二图像为环状图像，分割规则包括荧光强度区间、荧光强度阈值及时间阈值。

S141、将采集到的所述激发光脉冲信号的时间点作为荧光寿命探测的起始时间，获取所述荧光光子在时间通道上的强度变化，以得到所述荧光信号的荧光衰减曲线。

将探测到激发光脉冲信号的时刻作为荧光寿命探测的起始时间，也即是作为时间通道的零点，根据该起始时间获取荧光光子在时间通道上的强度变化，也即是以时间作为横坐标，通过光子数累积获取荧光光子的强度变化，一个时间通道即为一段单位时间(例如，可设置一个时间通道为0.05纳秒)，纵坐标即为荧光光子的强度值，荧光光子的强度可通过每一时间通道内时间积累所采集得到的荧光光子的数量进行体现，某一时间通道内荧光光子数量越多则荧光光子的强度越高，得到荧光信号的荧光衰减曲线。

图10为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图。采用直径为23nm的荧光珠样品进行试验，高斯脉冲激光的波长为635nm，功率为35μW，激光的脉冲频率为40MHz，脉冲宽度为0.3纳秒(ns)，第一光路与第二光路之间的光程间隔Δτ₂为12.5纳秒，所得到的荧光信号的荧光衰减曲线如图10(a)所示。

S142、根据所述分割规则确定所述荧光衰减曲线的分割点。

根据所述分割规则确定所述荧光衰减曲线的分割点。具体的，可根据荧光衰减曲线及分割规则确定荧光寿命探测的截止时间，将起始时间与终止时间的中间点对应的时间通道位置作为分割点，根据该分割点对荧光信号进行分割。

在一实施例中，如图3所示，步骤S142包括子步骤S1421、S1422、S1423和S1424。

S1421、对所述荧光衰减曲线每一时间通道的荧光强度是否位于所述荧光强度区间内进行判断，获取荧光强度位于所述荧光强度区间的时间通道作为第一时间通道；S1422、对所述荧光衰减曲线中与所述第一时间通道间隔所述时间阈值的时间通道的荧光强度是否小于所述荧光强度阈值进行判断；S1423、若与所述第一时间通道间隔所述时间阈值的时间通道的荧光强度小于所述荧光强度阈值，将所述第一时间通道作为所述荧光寿命探测的截止时间；S1424、将所述起始时间与所述截止时间的中间点对应的时间通道位置作为所述分割点。

具体的，荧光衰减曲线由多个点组成，每个点位于一个时间通道内，每个点对应一个荧光强度值。可先对荧光衰减曲线中每一时间通道的荧光强度值是否位于荧光强度区间内进行判断，将荧光强度位于荧光强度区间之内的时间通道作为第一时间通道，获取与第一时间通道间隔时间阈值的时间通道的荧光强度，并判断该荧光强度是否小于荧光强度阈值，若小于，则将第一时间通道作为荧光寿命探测的截止时间，根据上述判断方法所得到的截止时间有且仅有一个，将起始时间与终止时间的中间点对应的时间通道位置作为分割点。

例如，对图10中所示的荧光衰减曲线采用上述方法确定得到截止时间为25ns，起始时间为0，则起始时间与终止时间的中间点为τ_x＝12.5ns，则将与12.5ns对应的一个时间通道位置作为分割点。

S143、根据所述荧光信号中位于所述分割点之前的荧光光子的空间信息组成所述共聚焦图像。

S144、根据所述荧光信号中位于所述分割点之后的荧光光子的空间信息组成所述环状图像。

以分割点为基准，获取荧光信号中从起始时间至该分割点的荧光光子的空间信息组成一张共聚焦图像，获取荧光信号中从该分割点之后至截止时间的荧光光子的空间信息组成一张环状图像。

例如，如图10所示，对所得到的荧光信号进行分割后，得到样品的一张共聚焦图像如图10(b)所示，得到对应的一张环状图像如图10(c)所示，其中共聚焦图像可命名为图像A，环状图像可命名为图像B。

S150、根据预置的图像处理规则对所述第一图像及所述第二图像进行分析处理，以得到高分辨率的目标超分辨图像。

通过图像处理规则对第一图像及第二图像进行分析处理，可大幅提升对样品进行成像的分辨率，得到样品的目标超分辨图像。共聚焦图像及环状图像的视场相同(图像尺寸相同)。

在一实施例中，如图4所示，步骤S150包括子步骤S151和S152。

S151、将所述环状图像与所述图像处理规则中的增强系数相乘以得到增强环状图像。

具体的，将环状图像中每一像素的像素值与增强系数相乘，得到对应的增强环状图像。其中，所述增强系数为用户预设的一个系数值，增强系数的取值大于1，增强系数可以为整数或者小数。

图11为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图。例如，取增强系数为1，环状图像如图11(a)所示，此时得到的增强环状图像(可表示为1×B)与环状图像B相同；取增强系数为2，此时得到的增强环状图像(可表示为2×B)如图11(b)所示；取增强系数为4，此时得到的增强环状图像(可表示为4×B)如图11(c)所示。

S152、将所述共聚焦图像的强度值减去所述增强环状图像的强度值得到所述目标超分辨图像。

所得到的目标超分辨图像与共聚焦图像的视场相同(图像尺寸相同)。具体的，将共聚焦图像中一个像素的像素值减去环状图像中与该像素对应的像素值，得到该像素的像素差值，获取共聚焦图像中每一像素的像素差值进行组合即可得到对应的一目标超分辨图像。

例如，取增强系数为1，得到的增强环状图像可表示为1×B，目标超分辨图像可表示为A-1×B，此时得到的目标超分辨图像如图11(d)所示；取增强系数为2，得到的增强环状图像可表示为2×B，目标超分辨图像可表示为A-2×B，此时得到的目标超分辨图像如图11(e)所示；取增强系数为4，得到的增强环状图像可表示为4×B，目标超分辨图像可表示为A-4×B，此时得到的目标超分辨图像如图11(f)所示。

在另一实施例中，如图5所示，步骤S140包括子步骤S1401、S1402、S1403和S1404。

在本实施例中，环形脉冲激光先于高斯脉冲激光对样品进行照射，得到的第一图像为环状图像，第二图像为共聚焦图像，分割规则包括荧光强度阈值及强度差阈值。

S1401、将采集到的所述激发光脉冲信号的时间点作为荧光寿命探测的起始时间，获取所述荧光光子在时间通道上的强度变化，以得到所述荧光信号的荧光衰减曲线。

此过程与S141相同，在此不作赘述。

图12为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图。采用直径为23nm的荧光珠样品进行试验，高斯脉冲激光的波长为635nm，功率为35μW，激光的脉冲频率为80MHz，脉冲宽度为0.3纳秒(ns)，第一光路与第二光路之间的光程间隔Δτ₂为3纳秒，所得到的荧光信号的荧光衰减曲线如图12(a)所示。

S1402、根据所述分割规则确定所述荧光衰减曲线的分割点。

根据所述分割规则确定所述荧光衰减曲线的分割点。具体的，可根据分割规则确定所述荧光衰减曲线中对应的一个点作为分割点。

在一实施例中，如图6所示，步骤S1402包括子步骤S14021、S14022和S14023。

S14021、对所述荧光衰减曲线每一时间通道的荧光强度是否不小于所述荧光强度阈值进行判断，获取所述荧光衰减曲线中不小于所述荧光强度阈值的曲线段作为目标曲线段；S14022、对所述目标曲线段中每一目标时间通道与相邻的两个时间通道之间的荧光强度差值的绝对值是否均大于所述强度差阈值进行判断；S14023、若所述目标时间通道与相邻的两个时间通道之间的荧光强度差值的绝对值均大于所述强度差阈值，将所述目标时间通道的位置作为所述分割点。

具体的，荧光衰减曲线由多个点组成，每个点位于一个时间通道内，每个点对应一个荧光强度值。可先对荧光衰减曲线中每一时间通道的荧光强度值是否不小于荧光强度阈值进行判断，将荧光强度不小于荧光强度阈值的曲线段作为目标曲线段，判断目标曲线段中每一目标时间通道与相邻两个时间通道之间的荧光强度差值的绝对值是否均大于强度差阈值进行判断，若均大于，将该目标时间通道作为分割点，根据上述判断方法所得到的分割点有且仅有一个。

例如，对图12中所示的荧光衰减曲线采用上述方法确定得到的一个目标时间通道对应的时间为τ_x’＝4ns，则将该目标时间通道位置作为分割点。

S1403、根据所述荧光信号中位于所述分割点之前的荧光光子的空间信息组成所述环状图像。

S1404、根据所述荧光信号中位于所述分割点之后的荧光光子的空间信息组成所述共聚焦图像。

以分割点为基准，获取荧光信号中从起始时间至该分割点的荧光光子的空间信息组成一张环状图像，获取荧光信号中从该分割点之后至截止时间的荧光光子的空间信息组成一张共聚焦图像。

例如，如图12所示，对所得到的荧光信号进行分割后，得到样品的一张环状图像如图12(b)所示，得到对应的一张共聚焦图像如图10(c)所示。

在该一实施例中，如图7所示，步骤S150包括子步骤S1501和S1502。

S1501、将所述环状图像与所述图像处理规则中的增强系数相乘以得到增强环状图像。

具体的，将环状图像中每一像素的像素值与增强系数相乘，得到对应的增强环状图像。其中，所述增强系数为用户预设的一个系数值，增强系数的取值大于1，增强系数可以为整数或者小数。

图13为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像方法的使用效果示意图。例如，取增强系数为1，环状图像如图13(a)所示，此时得到的增强环状图像(可表示为1×B)与环状图像B相同；取增强系数为1.25，此时得到的增强环状图像(可表示为1.25×B)如图13(b)所示；取增强系数为1.5，此时得到的增强环状图像(可表示为1.5×B)如图13(c)所示。

S1502、将所述共聚焦图像的强度值减去所述增强环状图像的强度值得到所述目标超分辨图像。

所得到的目标超分辨图像与共聚焦图像的视场相同。具体的，将共聚焦图像中一个像素的像素值减去环状图像中与该像素对应的像素值，得到该像素的像素差值，获取共聚焦图像中每一像素的像素差值进行组合即可得到对应的一目标超分辨图像。

例如，取增强系数为1，目标超分辨图像可表示为A-1×B，，此时得到的目标超分辨图像如图13(d)所示；取增强系数为1.25，目标超分辨图像可表示为A-1.25×B，，此时得到的目标超分辨图像如图13(e)所示；取增强系数为1.5，目标超分辨图像可表示为A-1.5×B，此时得到的目标超分辨图像如图13(f)所示。

本发明实施例所提供的荧光差分超分辨成像方法，通过调整设置于第一光路中角反射器的位置延长或缩短一束高斯脉冲激光在第一光路中进行传播的光程，并将沿第一光路传播的高斯脉冲激光转换为环形脉冲激光后聚焦照射样品，另一束高斯脉冲激光沿第二光路传播聚焦照射样品，照射样品的环形脉冲激光与照射样品的高斯脉冲激光之间的脉冲间隔大于荧光染料的荧光寿命，采集得到的荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息。通过数据处理从荧光信号中分离出第一图像及第二图像，根据图像处理规则对第一图像及第二图像进行分析处理后得到分辨率进一步提升的目标超分辨图像。通过上述方法，解决了强度差分时的像素失配问题，采用低功率的高斯脉冲激光减小了对生物样品的破坏，降低了荧光染料的光漂白效应，延长了超分辨成像的有效时间，有利于实现长时间的活细胞动态超分辨成像研究，结合图像增强处理得到包含细微结构特征的高分辨率图像，大幅提升了目标超分辨图像的成像质量，特别适用于对生物样品进行长时间观测并获取高分辨率图像，在实际应用过程中取得了良好的技术效果。

本发明实施例还提供一种荧光差分超分辨成像系统，该荧光差分超分辨成像系统可用于实现前述荧光差分超分辨成像方法的任一实施例。具体地，请参阅图8-图9，图8为本发明实施例提供的荧光差分超分辨成像系统的示意图，图9为本发明实施例提供的成像处理终端的示意性框图，所述成像系统包括信号采集装置10及成像处理终端20。

所述信号采集装置10，用于采集得到所述高斯脉冲激光的激发光脉冲信号作为参考信号，并采集所述样品被照射后产生的荧光信号。

具体的，所述信号采集装置包括激光器101、第一分光镜102、第二分光镜103、第三分光镜104、双色镜105、所述角反射器106、螺旋相位板107、扫描振镜108、物镜109、所述载物台110、前置放大器111、第一探测器112、第二探测器113、时间相关单光子计数器114。

其中，所述激光器101，用于发射高斯脉冲激光；所述第一分光镜102，用于对所述高斯脉冲激光进行分光得到两束高斯脉冲激光，其中一束所述高斯脉冲激光沿所述第二光路传播、另一束所述高斯脉冲激光沿所述第一光路；所述第二分光镜103，用于对沿所述第二光路传播的高斯脉冲激光进行分光，以使一部分所述高斯脉冲激光射入所述第二探测器，另一部分所述高斯脉冲激光被反射并传播至所述第三分光镜；所述螺旋相位板107，用于将沿所述第一光路传播的所述高斯脉冲激光转换为环形脉冲激光并传播至所述角反射器；所述角反射器106，用于对入射的所述环形脉冲激光进行反射以使其传播至所述第三分光镜；所述第三分光镜104，用于对所述环形脉冲激光进行反射、对沿所述第二光路传播的所述高斯脉冲激光进行透射以使两束激光可沿同一路径进行传播；所述双色镜105，用于对所述环形脉冲激光及沿所述第二光路传播的所述高斯脉冲激光进行反射以使两束激光可沿同一路径传播至所述扫描振镜，并对所述荧光信号进行透射；所述扫描振镜108，用于对入射的高斯脉冲激光及环形脉冲激光进行同步扫描，以实现对样品的面阵成像；所述物镜109，用于对入射的激光进行聚焦后照射所述样品；所述载物台110，用于放置和固定样品，并对所述样品进行三维移动；所述第一探测器112，用于探测和收集荧光染料被激光照射后发出的荧光光子信号；所述第二探测器113，用于对入射的高斯脉冲激光进行探测以得到所述激发光脉冲信号；所述前置放大器111，用于对来自所述第一探测器的荧光光子信号进行放大和滤波；所述时间相关单光子计数器(TCSPC)114，用于信号存储和荧光寿命成像以得到所述荧光信号，其中所述荧光信号中包含荧光光子的时间信息和空间信息。

所述成像处理终端20，用于对所述信号采集装置所采集的所述激发光脉冲信号及所述荧光信号进行处理以得到所述目标超分辨图像。

所述成像处理终端20即是用于获取信号采集装置所采集的激发光脉冲信及荧光信号后进行成像处理得到目标超分辨图像的终端设备，例如工作站、台式电脑、笔记本电脑、平板电脑或手机等。

成像处理终端20可执行以下步骤：根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出第一图像及第二图像；根据预置的图像处理规则对所述第一图像及所述第二图像进行分析处理，以得到高分辨率的目标超分辨图像。

在一实施例中，如图6所示，所述成像处理终端20包括荧光信号分割单元210及图像处理单元220。

荧光信号分割单元210，用于根据所述激发光脉冲信号及预置的分割规则从所述荧光信号中分离出第一图像及第二图像；图像处理单元220，用于根据预置的图像处理规则对所述第一图像及所述第二图像进行分析处理，以得到高分辨率的目标超分辨图像。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。