阅读说明：本技术 一种利用蝗虫构建泌尿系结石动物模型的方法 (Method for constructing urinary calculus animal model by using locust ) 是由 刘耀明 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：一种利用蝗虫构建泌尿系结石动物模型的方法,属于生物医学领域；它包括：(1)第一次向蝗虫腹腔内注入4-8μL且浓度为5.0-10.5 mM的氯化铜溶液,在光照与黑暗时间比为13:11小时,光照时温度24-28±2℃,黑暗时温度20-26±2℃,湿度为60-85%的条件下,用新鲜麦苗饲养蝗虫；(2)第二次向蝗虫腹腔内注入4-8μL的氯化铜溶液,在光照与黑暗时间比为14:10小时,光照时温度24-28±2℃,黑暗时温度20-26±2℃,湿度为60-85%的条件下,用新鲜麦苗饲养蝗虫；(3)注入氯化铜溶液的蝗虫经24-48小时生理代谢后其马氏管内逐渐产生不同形态的草酸钙晶体。本发明具有材料成本低、稳定性好、过程可控、周期短优点。(A method for constructing a urinary calculus animal model by using locust belongs to the field of biomedicine; it includes: (1) injecting 4-8 μ L of 5.0-10.5 mM copper chloride solution into locusts abdominal cavity for the first time, and feeding locusts with fresh wheat seedlings under the conditions that the ratio of light to dark is 13:11 hours, the temperature in light is 24-28 + -2 ℃, the temperature in dark is 20-26 + -2 ℃, and the humidity is 60-85%; (2) injecting 4-8 μ L of copper chloride solution into abdominal cavity of locust for the second time, and feeding locust with fresh wheat seedling under the conditions of light illumination and dark time ratio of 14:10 hr, light illumination temperature of 24-28 + -2 deg.C, dark temperature of 20-26 + -2 deg.C, and humidity of 60-85%; (3) the locust injected with the copper chloride solution is physiologically metabolized for 24 to 48 hours to gradually generate calcium oxalate crystals with different forms in the Malpighian tube. The invention has the advantages of low material cost, good stability, controllable process and short period.)

一种利用蝗虫构建泌尿系结石动物模型的方法

技术领域

本发明属于生物医学研究领域，具体涉及一种用中华稻蝗构建动物代谢性泌尿结石模型的方法。

背景技术

代谢性泌尿结石（肾结石或尿结石）是包括人类在内的动物泌尿统常见的疾病，调查显示不同地区人群的结石发病率在3%-12%之间，医疗工作者经长期的研究后确定了代谢性泌尿结石的主要成分是草酸钙，其单独或与其他钙盐共同组成动物泌尿结石。由于人类作为医治对象和科研材料的特殊性，相关泌尿结石的研究需要依赖于其他动物作为替代和试验模型，选择适当的动物并通过规范的方法和程序造模，诱导或胁迫动物体产生代谢性结石相关症状和相应的病变，才能有效开展相应的科研试验。

造模试验中常根据不同症状和特点，选用小鼠、大鼠、兔子、犬、猪等动物建立动物代谢性结石模型并开展相关研究，目前的报到中有人应用乙二醇（乙二醇+氯化铵）、乙二酰胺、对苯二甲酸、三聚氰胺等，通过持续定量的给药来诱导动物产生并具备相关疾病的主要症状和体征指标，从而获得相应的动物模型。这些模型的局限性在一定程度上阻碍和限制了有效医学治疗、预防措施、医学转化应用。为了全方位的认识代谢性泌尿结石，客观上需要拓展多样化的动物模型。近年来，研究发现果蝇（Drosophila melanogaster）为代表的昆虫正成为动物疾病的转化模型。昆虫模型可为疾病形成的生理过程、发病机制、防治策略、药物筛选提供便捷操作和高效试验。

中华稻蝗在全国水稻种植区均有分布，主要以水稻的茎叶为食物。中华稻蝗体内有一组织叫马氏管，为中空且具盲端的管，其浸浴在腹腔内的血淋巴中且盲端可以蠕动。从动物发育学和昆虫生理学的角度可知，昆虫马氏管与哺乳动物（人类）肾脏的遗传组成、解剖结构以及生理功能非常类似，它可以从血淋巴中吸收代谢产物进入管内形成原尿，所以马氏管内产生的草酸钙结晶体就等同于哺乳动物的肾结石或尿结石。

前期的深入研究发现，氯化铜作用下中华稻蝗马氏管内会形成尿酸盐，即草酸钙。基于这一生理现象，可建立代谢性昆虫泌尿结石动物模型。可人为以控制生理条件来调节草酸钙晶体的形成过程，这可为人类了解泌尿结石的形成、发病机制、筛选和试验相关药物提供科学便捷的实验模型。

发明内容

本发明针对现有动物疾病模型的缺陷，本发明提供容易获取饲养简单；成本低，建模周期短，试验重复性好、操作简单的一种利用蝗虫构建泌尿系结石动物模型的方法。

为实现上述目的，具体通过以下技术方法实现：

将蝗虫置于透气的纱笼内，置于气候培养箱中用新鲜麦苗适应性饲养2-3天；

饲养环境条件，气候培养箱相关设置为：光照与黑暗时间为14:10小时，光照时温度24-28±2 ℃，黑暗时温度20-26±2 ℃，湿度为60-85%；

向蝗虫腹部注射采用昆虫生理盐水配置浓度为5.0-10.5 mM的氯化铜溶液；所述氯化铜溶液要经120℃蒸汽灭菌20 min灭菌；

昆虫生理盐水配方为：NaCl：0.138 M，KCl：0.0027 M，Na₂HPO₄：0.0073 M，KH₂PO₄：0.00147 M，pH=7.4；

随机挑选经过适应性饲养的蝗虫，用注射器从蝗虫腹部缓缓注入氯化铜溶液4-8 μL；

注射氯化铜的蝗虫装入纱笼内，置于气候培养箱中饲养1天；培养箱中饲养环境：光照与黑暗时间为13:11小时，光照时温度24-28±2 ℃，黑暗时温度20-26±2 ℃，湿度为60-85%；

随机挑选经过饲养的注射氯化铜的蝗虫，再次注射氯化铜溶液4-8 μL，饲养2-3天；

解剖蝗虫，置于解剖镜下获取马氏管，并用偏光显微镜观察，可见马氏管内结晶体；

结晶体在蝗虫马氏管内停留24-48小时，最终运输进入后肠；

在马氏管内或后肠粪便中分离得到的晶体经X-射线荧光光谱仪(XRF)测试确定其化学组成是草酸钙；

所述蝗虫为水稻田捕获的中华稻蝗成虫，雌雄均可使用。

本发明的优点在于所用主体材料-中华稻蝗为田间昆虫，容易获取饲养简单；所用药物为氯化铜，成本低，建模周期短（20-48小时），试验重复性好、操作简单。中华稻蝗和果蝇生理极为类似，与果蝇模型相比，其优点在于体型比果蝇大，马氏管的数量多且比果蝇马氏管粗，便于观察、解剖和分离草酸钙晶体。作为人类代谢性泌尿结石的转化模型，可人为控制发病历程从而得到不同阶段的草酸钙晶体。

本发明所构建的方法及其模型经济便捷操作简单周期短效率高，与目前所用的其他动物模型相比较，具有显著的优越性，可作为现有模型的补充或替代。

附图说明

图1是中华稻蝗成虫注射氯化铜溶液48小时后马氏管内生成的结晶物显微镜照片。

具体实施方式

实施例1：

1、从水稻田捕获中华稻蝗成虫，放入通风的纱笼再置于气候培养箱中用新鲜麦苗适应性饲养2-3天，优选的饲养环境条件为：光照与黑暗时间为13:11小时，光照时温度25±2℃，黑暗时温度21±1 ℃，湿度为60-65%；

2、精确配置标准昆虫生理盐水配方为：NaCl：0.138 M，KCl：0.0027 M，Na₂HPO₄：0.0073M，KH₂PO₄：0.00147 M，pH=7.4；配置好的昆虫生理盐水置于高燕灭菌锅内经120℃蒸汽灭菌20 min灭菌；

3、用上述经灭菌的昆虫生理盐水配置10.5 mM氯化铜溶液；

4、随机挑选经适应性饲养的中华稻蝗，向其体表喷洒75%酒精进行消毒，用微量注射器吸取75%酒精润洗注射器内管进行消毒；

5、随机抓取中华稻蝗，用注射器从其腹部第三和第四腹节之间逆腹部延伸方向刺入节间膜并缓缓注入6.0 mM的氯化铜溶液5 μL；

6、注射过氯化铜的中华稻蝗放回纱笼内饲养1天，饲养环境条件为：光照与黑暗时间为13:11小时，光照时温度25±2 ℃，黑暗时温度21±1 ℃，湿度为60-65%；

7、随机抓取回纱笼内饲养1天后中华稻蝗，第二次用注射器从中华稻蝗腹部第三和第四腹节之间逆腹部延伸方向刺入节间膜并缓缓注入6.0 mM的氯化铜溶液5 μL；放回气候培养箱中饲养2-3天；

8、 置于解剖镜下解剖中华稻蝗获取马氏管，并用偏光显微镜观察，可见马氏管内结颗粒即为草酸钙晶体；

9、分离得到的草酸钙晶体在显微镜下为透明规则外形的晶体，在紫外可见光下呈蓝色荧光，外形为正方体、长方体、八面体等形状，见图1；

10、按照上述方法即可完成在昆虫体内构建代谢性泌尿结石的模型，获得的结晶物即为动物代谢性尿结石的主要成分-草酸钙。

11 、通过控制氯化铜溶液的浓度和饲养时间来控制草酸钙晶胞的形成、生长和晶体运输的动态过程，可以在不同浓度和时间段观察到形态不同的草酸钙晶体，应用该模型便可开展原发性或代谢性泌尿结石的相关研究或相关药物筛选。

实施例2：本实施例注入中华稻蝗腹腔的氯化铜溶液浓度为7.0 mM，注射量为5 μL，中华稻蝗饲养条件为：光照与黑暗时间为13:11小时，光照时温度27±2 ℃，黑暗时温度20±2 ℃，湿度为70-75%，其它操作与实施例1相同。

实施例3：本实施例注入中华稻蝗腹腔的氯化铜溶液浓度为8.0 mM，注射量为6 μL，中华稻蝗饲养条件和其它操作与实施例1相同。

实施例4：本实施例注入中华稻蝗腹腔的氯化铜溶液浓度为9.0 mM，注射量为7 μL，中华稻蝗饲养条件为：光照与黑暗时间为13:11小时，光照时温度28±2 ℃，黑暗时温度22±2 ℃，湿度为80-85%，其它操作与实施例1相同。

实施例5：本实施例注入中华稻蝗腹腔的氯化铜溶液浓度为10.5 mM，注射量为4 μL，中华稻蝗饲养条件为：光照与黑暗时间为14:10小时，光照时温度25±2 ℃，黑暗时温度26±2 ℃，湿度为70-75%，其它操作与实施例1相同。

实施例6：本实施例注入中华稻蝗腹腔的氯化铜溶液浓度为5.5 mM，注射量为5 μL，中华稻蝗饲养条件为：光照与黑暗时间为14:10小时，光照时温度26±2 ℃，黑暗时温度24±2 ℃，湿度为65-70%，其它操作与实施例1相同。

实施例7：本实施例注入中华稻蝗腹腔的氯化铜溶液浓度、注射量、中华稻蝗饲养条件选用实施例1-6的任一组参数，二次注射氯化铜溶液并饲养2-4天后任意1天解剖马氏管或后肠或粪便，均可获得不同形态的草酸钙晶体。