脂肪组织冻存保护剂
阅读说明：本技术 脂肪组织冻存保护剂 (Protective agent for fat tissue freezing ) 是由 李青峰 周双白 张佩祺 于 2019-12-26 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种甘油用于制备脂肪组织冻存保护剂的用途及一种脂肪组织冻存保护剂。以脂肪组织冻存保护剂总量为基准计,所述脂肪组织冻存保护剂包含：甘油体积分数为60％-80％；海藻糖0.090-0.200g/ml；溶剂为PBS缓冲液。本发明的脂肪组织冻存保护剂,无DMSO及其他含生物毒性的保护剂,对细胞及组织均无毒性,洗脱不彻底的情况下仍不会引起临床使用时的安全问题；无异种抗原,成本较低,甘油及海藻糖均为临床获批药物成分且成本较低的产品,且本发明不含有诸如人血白蛋白类成本较高的产品,故临床使用及推广的可能性较高；保护能力强,脂肪组织复苏后活性高,在移植后形成的炎性细胞少。(The invention provides application of glycerol in preparation of an adipose tissue cryopreservation protective agent and the adipose tissue cryopreservation protective agent. Based on the total amount of the fat tissue freezing protective agent, the fat tissue freezing protective agent comprises: the volume fraction of the glycerol is 60-80 percent; trehalose 0.090-0.200 g/ml; the solvent was PBS buffer. The fat tissue cryopreservation protective agent disclosed by the invention is free of DMSO (dimethyl sulfoxide) and other protective agents containing biotoxicity, has no toxicity to cells and tissues, and does not cause the safety problem in clinical use under the condition of incomplete elution; the invention has the advantages that the vaccine has no foreign antigen, the cost is lower, the glycerol and the trehalose are all clinical approved medicinal components and are lower in cost, and the vaccine does not contain products such as human serum albumin with higher cost, so the possibility of clinical use and popularization is higher; strong protective capability, high activity after the recovery of adipose tissues and less inflammatory cells formed after transplantation.)
技术领域
本发明涉及医疗领域，特别是涉及一种脂肪组织冻存保护剂。
背景技术
随着脂肪移植技术的不断发展，自体脂肪移植技术在临床上已有广泛应用，如在瘢痕填 充、面部萎缩、组织再造、皱纹及乳房填充等问题上均是较好的解决方案。但目前脂肪移植 存在重吸收较高的问题，大部分情况仍需要多次抽脂及术后即刻的脂肪填充，以精确达到修 复效果。由于抽脂手术存在较严重的局部损伤，对患者造成较大的痛苦，每次抽脂手术后均 需局部压迫至少1月。抽脂手术也具有较高的感染风险。因此，如能有效地长期保存一次抽 取的脂肪，在必要时进行脂肪填充治疗，可减少手术抽取脂肪的次数，将显著减轻患者的术 中痛苦、减少术后恢复时间、降低手术的经济负担及手术风险，提高治疗效率。
冷冻保存是可长期保存细胞和组织的方法。在冷冻过程中，通常需要加入冻存保护剂， 保护细胞免受低温后水分子结晶的破坏。
然而，目前脂肪组织的冻存保护效果尚有争议，存在诸如冻存后组织活性降低，再移植 后组织留存率较低等问题；现有的组织冻存保护剂均含有生物毒性物质或含异种抗原，再移 植后会产生生物安全问题。目前尚未发现有效的针对脂肪组织的长期冻存且安全无毒的冻存 保护剂。与单纯细胞悬液或其他均质组织相比，脂肪组织对冷冻保护剂的要求更高。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脂肪组织冻存保护剂，用于 解决现有技术中冻存保护剂毒性高、冻存效果差的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供甘油用于制备脂肪组织冻存保护 剂的用途。
本发明第二方面提供一种脂肪组织冻存保护剂，以脂肪组织冻存保护剂总量为基准计， 所述脂肪组织冻存保护剂包含：
甘油体积分数为60％-80％；
海藻糖0.090-0.200g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
本发明第三方面提供一种脂肪冻存保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将海藻糖加入到PBS缓冲液中，配制海藻糖溶液；
2)以甘油为溶质，海藻糖溶液为溶剂配成脂肪冻存保护剂。
本发明第四方面提供一种脂肪组织冻存的方法，包括如下步骤：
1)将前述脂肪冻存保护剂与脂肪组织以体积比1:1混合，得到混合物1；
2)将混合物1置于程序降温盒中，于-80摄氏度下程序降温；
3)将步骤2)得到的混合物1置于液氮中冻存，得到冻存的脂肪组织。
本发明第五方面提供一种冻存的脂肪组织复温的方法，包括如下步骤：
a.将前述冻存的脂肪组织从液氮中取出，水浴加热；
b.使用PBS缓冲液洗脱步骤a得到的脂肪组织，离心；
c.取离心后的上层物质，使用PBS缓冲液洗脱，离心，上层物质即为复温后的脂肪组织。
如上所述，本发明的脂肪组织冻存保护剂，具有以下有益效果：
本发明的脂肪组织冻存保护剂，无DMSO及其他含生物毒性的保护剂，对细胞及组织均 无毒性，洗脱不彻底的情况下仍不会引起临床使用时的安全问题；无异种抗原，在传统保护 剂中需要使用胎牛血清的情况下，进行脂肪移植后可能会引起超敏反应，而本发明中无此类 生物制剂；成本较低，甘油及海藻糖均为临床获批药物成分且成本较低的产品，且本发明不 含有诸如人血白蛋白类成本较高的产品，故临床使用及推广的可能性较高；保护能力强，脂 肪组织复苏后活性高，在移植后形成的炎性细胞少。
附图说明
图1显示为脂肪细胞和脂肪组织的对比图。左图为细胞的镜下画面，右图为脂肪组织(HE 染色)。可见脂肪组织相对于细胞而言，其团块大，细胞数量多，存在多种类型的细胞，且有 其固有组织结构。细胞悬液则仅有单一种类细胞，细胞较分散，无明显团块，冻存保护剂较 易包裹每个细胞。
图2显示为裸鼠背部行脂肪移植图。A：本专利配方保存后进行脂肪移植：组织块可见周围 血管包绕可，移植物较均匀，未见明显脂肪液化坏死区域。
B：FBS+DMSO保存后进行脂肪移植：组织块血管包绕尚可，但上下级均可见液化坏死区域 AB对比可见，本专利配方应用时，脂肪组织冻存后移植的组织块在大体上形态较优。
图3显示为各样本G3PDH实验的结果图，该实验为组织团块活性的定量测试。
图4显示为-196摄氏度冻存后脂肪移植留存率结果图。
图5为脂肪在-196摄氏度冻存6月后，移植至裸鼠背部，观察1月后取出移植脂肪，切片HE 染色观察结果(图中*为纤维化组织，△为炎性浸润，#为脂肪坏死后的空泡)。
具体实施方式
传统细胞冻存保护剂多针对单一种类的细胞，对于脂肪组织这种复合组织保存效果欠佳。 针对单一细胞冻存保护有效的冻存保护及在保存复合组织时，对于组织三维结构的保护效果 较差。细胞悬液经冻存保护剂处理后低温冷冻，复苏后活性通常在95％及以上，而组织经传 统冻存保护剂处理后活性通常仅余30％左右。
脂肪组织作为一种复合组织，其细胞种类多，包含有脂肪细胞、脂肪前体细胞、脂肪干 细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等(图1)，且脂肪组织团块较大，传统冻存保护剂难以 有效渗入组织。脂肪组织主要由脂肪细胞构成，而脂肪细胞中细胞器成分较少，大部分为富 含甘油三酯的脂滴，与其他细胞及组织存在较大差异，其他组织常用的传统冻存保护剂对与 脂肪组织的特殊结构成分难以起到有效保护效果。其次，渗透进入脂肪组织内部的保护剂在 洗脱中往往不能被充分移除，而以胎牛血清(FBS)+二甲基亚砜(DMSO)为配方的传统冻 存保护剂中，含异种抗原且二甲基亚砜对细胞有毒性，在临床使用时残留的保护剂可能对患 者造成毒性、过敏等不良影响(根据Sigma产品编号Vetec-V900090说明书)。有效的脂 肪组织冻存不仅需要在取出即刻具有良好的形态，更重要的是保证组织内细胞的生物学活性， 以保证其再移植后存活率和生物学功能，减少局部炎症反应引起的组织破坏。因此，到目前 为止仍没有一种能够有效、无毒地对脂肪组织进行长期冻存，且成本低、适宜大量推广的的 冻存保护剂问世。
甘油是一种渗透性冻存保护剂，在低温下可通过抑制冰晶形成，防止渗透性损伤，保护 细胞膜和细胞内蛋白等机制，发挥冻存保护作用，目前在皮肤、软骨、睾丸等复合组织的冻 存中已有研究。在脂肪组织保存方面，甘油与脂肪细胞内大量存在的甘油三酯的相似性，能 更好地保存脂肪细胞活性及脂滴完整性，且在细胞学层面已有验证将脂肪细胞浸润于甘油溶 液中可有效抑制脂肪细胞内的甘油三酯外流；其对复合组织的渗透性较强，对团块较大的脂 肪组织能更好地渗透及洗脱；无组织毒性且成本较低，有利于临床大批量使用。因此，以甘 油为主要有效成分的冻存保护剂，可有效保护脂肪在冷存条件下组织活性，减少细胞凋亡； 复苏过程中，不存在保护剂残留的毒副作用，移植后组织形态结构更好。本发明中同时加入 了一定浓度的海藻糖，作为非渗透性冻存保护剂，加强对组织的保护作用。
现已有单独使用海藻糖为主要成分的细胞冻存保护剂，主要保护目标是细胞悬浮液而非 脂肪组织，本发明中将单纯海藻糖作为对照后进行验证，发现本发明中添加甘油后，可见经 移植后组织形态明显优于仅含海藻糖的组别，经海藻糖保护后的组织经过移植后，可见明显 的炎症细胞浸润，可能是由于冻存后，由于保护效果不佳，脂肪细胞的坏死所引起的免疫反 应。而同样的实验显示经过本发明配方处理后，脂肪组织移植后的炎性浸润明显较少，进一 步提供了以甘油作为主要成分的脂肪组织冻存保护剂更优的证据。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
本发明提供甘油用于制备脂肪组织冻存保护剂的用途。
所述脂肪组织冻存保护剂中，甘油作为为一种渗透性保护剂。
进一步的，甘油为脂肪组织冻存保护剂的有效成分。
进一步的，所述脂肪组织冻存保护剂不包含二甲基亚砜、动物血清或人血白蛋白。
在一种实施方式中，所述脂肪组织冻存保护剂中，还包括海藻糖和PBS缓冲液。
所述脂肪组织冻存保护剂中，海藻糖作为辅助的非渗透性保护剂。更全面的减少冻存过 程中冰晶的形成及其对细胞结构的损害。
在一种实施方式中，所述脂肪组织冻存保护剂中，以脂肪组织冻存保护剂总量为基准计， 各组分含量为：
甘油 体积分数为60％-80％；
海藻糖 0.090-0.200g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
在一种实施方式中，所述海藻糖的组分含量为0.25-0.50mol/L。可选的，为0.25-0.3mol/L， 0.3-0.35mol/L，0.35-0.4mol/L，0.4-0.45mol/L，0.45-0.5mol/L。
可选的，所述脂肪组织冻存保护剂中，甘油的体积分数为60％-65％，65％-70％，70％-75％， 75％-80％。
可选的，所述脂肪组织冻存保护剂中，海藻糖的质量浓度为0.009-0.015g/ml，0.015-0.020g/ml，0.020-0.030g/ml，0.030-0.040g/ml，0.050-0.060g/ml，0.060-0.070g/ml， 0.070-0.080g/ml，0.080-0.090g/ml，0.090-0.100g/ml，0.010-0.120g/ml，0.120-0.140g/ml， 0.140-0.160g/ml，0.160-0.180g/ml，0.180-0.200g/ml。
所述脂肪组织冻存保护剂能使脂肪组织在-196℃条件下能稳定存储至少6个月。
本发明提供的脂肪组织冻存保护剂，以脂肪组织冻存保护剂总量为基准计，所述脂肪组 织冻存保护剂包含：
甘油 体积分数为60％-80％；
海藻糖 0.090-0.200g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
在一种实施方式中，所述海藻糖的组分含量为0.25-0.50mol/L。
可选的，所述脂肪组织冻存保护剂中，甘油的体积分数为60％-65％，65％-70％，70％-75％， 75％-80％。
可选的，所述脂肪组织冻存保护剂中，海藻糖的质量浓度为0.009-0.015g/ml，0.015-0.020g/ml，0.020-0.030g/ml，0.030-0.040g/ml，0.050-0.060g/ml，0.060-0.070g/ml， 0.070-0.080g/ml，0.080-0.090g/ml，0.090-0.100g/ml，0.010-0.120g/ml，0.120-0.140g/ml， 0.140-0.160g/ml，0.160-0.180g/ml，0.180-0.200g/ml。
所述PBS缓冲液的溶质为：200mmol/L Na2HPO4，35mmol/LKH2PO4，2.74mol/L NaCl，53mmol/LKCl。溶剂为水。pH7.2-7.6。
进一步的，所述脂肪组织冻存保护剂不包含二甲基亚砜、动物血清或人血白蛋白。
本发明提供的脂肪冻存保护剂的制备方法，包括如下步骤：
1)将海藻糖加入到PBS缓冲液中，配制海藻糖溶液；
2)以甘油为溶质，海藻糖溶液为溶剂配成脂肪冻存保护剂。
在一种实施方式中，步骤1)中，所述海藻糖溶液中，海藻糖的所述浓度为0.25mol/L-0.50 mol/L。可选的，为0.25-0.3mol/L，0.3-0.35mol/L，0.35-0.4mol/L，0.4-0.45mol/L，0.45-0.5mol/L。
在一种实施方式中，步骤2)中，所述脂肪冻存保护剂含有体积分数为60％-80％的甘油。 可选的，甘油的体积分数为60％-65％，65％-70％，70％-75％，75％-80％。
进一步的，步骤1)还包括对得到的海藻糖溶液进行高压蒸汽灭菌。
进一步的，步骤2)在无菌条件下进行。
所述甘油为医用无菌甘油。
本发明提供的脂肪组织冻存的方法，包括如下步骤：
1)将前述脂肪冻存保护剂与脂肪组织以体积比1:1混合，得到混合物1；
2)将混合物1置于程序降温盒中，于-80摄氏度下程序降温；
3)将步骤2)得到的混合物1置于液氮中冻存，得到冻存的脂肪组织。
进一步的，步骤1)中还包括对混合物1进行密封。
步骤2)中，程序降温时间至少为12个小时。
本发明提供的冻存的脂肪组织复温的方法，包括如下步骤：
a.将前述冻存的脂肪组织从液氮中取出，水浴加热；
b.使用PBS缓冲液洗脱步骤a得到的脂肪组织，离心；
c.取离心后的上层物质，使用PBS缓冲液洗脱，离心，上层物质即为复温后的脂肪组 织。
进一步的，步骤a中，水浴加热的温度为37℃。
进一步的，步骤a中，水浴加热的时间为2分钟。
在一种实施方式中，步骤b中，洗脱时间为3分钟。
在一种实施方式中，步骤b中，离心条件为500rpm，离心3分钟。
在一种实施方式中，步骤c中，洗脱时间为3分钟。
在一种实施方式中，步骤c中，离心条件为500rpm，离心3分钟。
本发明所述的脂肪组织冻存的方法或冻存的脂肪组织复温的方法均不涉及诊断和治疗目 的。可以为保健目的，或者为基础研究目的。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定 的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指 出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以 及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术 语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外， 根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例 中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常 规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关 领域的常规技术。
实施例1
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为60％；
海藻糖 0.090g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
实施例2
1.将脂肪组织分离后在无菌条件下，将脂肪组织与实施例1所述脂肪组织冻存保护剂1:1混匀， 将混匀后的冻存管上下颠倒后混匀。
2.将混匀后的冻存管放入程序降温盒，并放入-80℃冰箱，降温12小时后，转移至-196℃液氮 中。
3.待需要使用本次冻存脂肪时，将冻存管从液氮中取出，并放置入37℃水浴中，2分钟复温。
4.将本冻存管转移至无菌条件下，将内容混合物置于无菌离心管中，先使用PBS缓冲液洗脱 一次混合物，3分钟后，以500rpm，离心3分钟，取出下层液体。再用PBS缓冲液洗脱一次， 3分钟后，以500rpm，离心3分钟，取出下层液体。
实施例3
将脂肪组织分别在不添加冻存保护剂、添加FBS+DMSO保护剂(10％DMSO+ 90％FBS)、海藻糖保护剂(0.25mol/L海藻糖溶液，溶剂为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液 的配方为：200mmol/L Na2HPO4，35mmol/LKH2PO4，2.74mol/L NaCl，53mmol/LKCl， pH7.2-7.6)及添加施例1所述脂肪组织冻存保护剂后，分别程序降温并在-80℃或-196℃条件 下保存6月，取出后在裸鼠背部行脂肪移植。如图2所示，于身体中段的背部两侧移植脂肪 组织，每侧注射0.2ml。观察一个月后取出并称量剩余组织的质量。计算留存率。(留存率＝ 剩余组织质量÷移植组织质量*100％)。
留存率结果见图4。图中可知，本发明在两个温度条件下，其留存率均优于传统冻存保 护剂及未添加保护剂的组别。说明应用本发明后，脂肪移植临床应用中最重要的术后留存率 有明显提高，具有较高的临床应用价值。
利用Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase(G3PDH)Assay试剂盒(Sigma-aldrich， MAK208)，对脂肪组织进行G3PDH实验。实验步骤根据试剂盒说明书进行。结果如图3 所示，G3PDH为定量测量组织块活性的实验，同样质量的样本量，G3PDH数值越大，组织块内生物活性越高。在实验中经过验证，本专利申请配方保存下的脂肪组织，相比于传统冻存剂配方及单纯海藻糖的配方均活性更好，且存在统计学差异。
实施例4
脂肪在未添加任何冻存保护剂的情况下、脂肪在FBS+DMSO保护下、脂肪在海藻糖保 护剂保护下、脂肪在实施例1中冻存保护剂保护下-196摄氏度冻存6月后，移植至裸鼠背部， 观察1月后取出移植脂肪，切片HE染色观察。
结果如图5所示，脂肪在-196摄氏度冻存6月后，移植至裸鼠背部，观察1月后取出移 植脂肪，切片HE染色观察结果。
可见空白对照、传统组(FBS+DMSO)及海藻糖组中均有较多纤维化组织，说明移植后 坏死组织较多；对比后其余三组均有较多炎性渗出，说明低温及冻存保护剂均对脂肪组织产 生较大炎性刺激；且其余三组均有较多脂肪空泡，说明低温冻存后脂滴破裂较多，产生无功 能的空泡。而应用本发明专利配方后，脂肪组织再移植后未见明显纤维化及炎性渗出，空泡 较少，组织结构完整，说明其保护效果较好。
对比后可见，在相同条件下，实施例1所述的冻存保护剂产生的空泡及纤维化区域，均 明显少于传统保护剂及空白组，证明其对脂肪组织长期冻存后再移植的效果和质量均优于传 统保护剂。
实施例5
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为80％；
海藻糖 0.200g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
实施例6
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为70％；
海藻糖 0.100g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
实施例7
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为65％；
海藻糖 0.150g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
实施例8
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为68％；
海藻糖 0.020g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
实施例9
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为72％；
海藻糖 0.030g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
实施例10
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为78％；
海藻糖 0.040g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
实施例11
按以下配方配制脂肪组织冻存保护剂：
甘油 体积分数为80％；
海藻糖 0.160g/ml；
溶剂为PBS缓冲液。
本发明还利用权利要求5-11中的脂肪组织冻存保护剂进行了经过动物模型验证，结果据 表明在应用本发明进行脂肪组织冻存后，脂肪移植后的留存率显著提升，且组织形态较传统 保护剂完整，炎性浸润、脂肪空泡及纤维化的组织均明显减少。证明在移植质量上，本发明 处理过得脂肪组织也优于传统组及空白组。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外， 本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前 提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对 本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种 如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围 内。