一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法
阅读说明：本技术 一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法 (Method for rapidly screening non-transgenic site-directed mutant plants ) 是由 梁振 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法,属于生物技术领域。该方法包括以下步骤：(1)将靶向特定基因靶位点的sgRNA导入含有正负筛选标记(coda::nptii或hpt::coda)的基因编辑载体中；(2)以基因编辑载体为基础构建基因敲除载体并将其通过农杆菌转化需要处理的植株,实施转基因,并通过nptii或hygromycin进行正向筛选获得第一代(拟南芥叫T1代,烟草、水稻等叫T0代)含有转基因元件的基因定点突变材料；(3)种植步骤(2)中所获得的第一代突变体,并收获种子。(4)利用负向筛选标记codA,对所收获的种子进行筛选,最终获得不含转基因成分的基因定点突变材料。(The invention discloses a method for rapidly screening non-transgenic site-directed mutant plants, belonging to the technical field of biology. The method comprises the following steps: (1) introducing sgRNA targeting a specific gene target site into a gene editing vector containing a positive and negative selection marker (cod:: nptii or hpt:: cod); (2) constructing a gene knockout vector based on a gene editing vector, transforming the gene knockout vector into a plant to be treated through agrobacterium, implementing transgenosis, and carrying out forward screening through nptii or hygromycin to obtain a first generation (arabidopsis called T1 generation, tobacco, rice and the like called T0 generation) gene site-directed mutant material containing a transgenic element; (3) planting the first generation mutant obtained in the step (2), and harvesting seeds. (4) And screening the harvested seeds by using a negative screening marker codA to finally obtain the gene site-directed mutation material without the transgenic component.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法。
背景技术
基因组编辑技术可以在基因组中产生定点突变，是近十年来新兴的分子生物学技术，其主要依赖于序列特异性核酸酶(Sequence Specific Nucleases,SSNs)对基因组定向切割产生DNA双链断裂(DNA double-strandbreaks，DSBs)。生物体细胞主要通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)两种途径来修复DSBs。NHEJ修复途径会产生几个碱基的插入或缺失，造成移码突变，从而导致基因的敲除；HR修复途径会使基因组完整修复或在提供模板的情况下，发生碱基替换或定点插入。目前，常用的SSNs主要包括锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFNs)、转录激活子样效应核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered,regularly interspaced,short palindromic repeat/CRISPR，CRISPR/Cas)系统。以上三种序列特异性核酸酶都可以在基因组中产生DSBs，进而诱发基因定点突变，其中CRISPR/Cas9技术具有简单便捷高效等特点，目前在小鼠、大鼠、猪、牛、狗等多种动物及其细胞系以及包括小麦、玉米、水稻、烟草、拟南芥、番茄等在内的多种植物中已经得到了广泛应用。
常规植物基因组编辑技术主要是利用农杆菌或基因枪将SSNs，如CRISPR/Cas9，以DNA的形式转入植物细胞，并随机整合到植物基因组中，进而对基因组进行编辑。SSNs，如CRISPR/Cas9，整合到植物基因组中会产生多种不良效应。首先，在基础研究领域：SSNs，如CRISPR/Cas9的DNA表达框整合到基因组中会带来因CRISPR/Cas9持续表达导致的潜在脱靶效应增加的问题。其次，SSNs属于外源DNA，整合到植物基因组中会涉及到转基因问题，难以进行从管理部门获得商业种植批准。因此，转基因组分的剔除，是基因组编辑作物获得商业应用的必要先决条件。
目前，鉴定并获取不含有外源转基因片段基因组编辑作物的方法主要有以下几种：1)通过后代自交或回交分离，并提取基因组DNA，利用PCR并辅以Southern的方法进行鉴定。这种方法中基因组DNA提取比较繁琐，鉴定工作量大，而且PCR假阳性较高，Southern操作也极为复杂。2)在种子中加入特异性表达mcherry荧光蛋白作为转基因标记元件，进行后代分离鉴定。这种方法目前仅适用于拟南芥中，没有在植物中广泛应用，此外也需要有特定的荧光显微镜，该设备条件不是所有实验室都具备。3)将CRISPR/Cas9以核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP)的形式转化植物原生质体或者幼胚，进而获得不含外源DNA的定点突变材料。但是原生质体转化需要经历原生质体培养、愈伤诱导、分化再生等多种复杂问题，在单子叶植物中难以实现。幼胚转化的方法目前只在小麦和玉米中得以实现。此外，这两种方法均不用抗生素筛选，后续鉴定耗费极大的人力物力。4)将CRISPR/Cas9元件与靶向除草剂抗性P450酶的RNAi元件偶联，也可通过除草剂筛选，鉴定无转基因编辑的水稻。但是这种方法需要对后代进行长期种植和筛选，增加了人力投入。因此，本领域仍亟需一种通用的鉴定非转基因后代定点突变体的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明可应用于单子叶和双子叶植物中基因组编辑(如CRISPR/Cas9)中。目前常用的基因组编辑方法中，通过农杆菌或者基因枪将SSNs载体转入细胞中，载体通常包括基因组编辑元件(如CRISPR/Cas9)和转基因正向筛选标记(如nptii和Hygromycin等)，利用正向筛选标记筛选在第一代富集发生转化和基因编辑的植株。细菌胞嘧啶脱氨酶基因(codA)，可以将无毒性的5-氟胞嘧啶转化为有毒性的5-氟尿嘧啶，因此可以用于转基因的负向筛选。本发明将正向筛选标记(如nptii和Hygromycin等)和负向筛选标记(codA)相融合，生成新的正负筛选标记(coda::nptii或hpt::codA)，既可以用于第一代转基因定点突变植株的正向筛选，又可以用于后代非转基因定点突变植株的快速负向筛选。
本发明提供了一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法，步骤如下：(1)将靶向特定基因靶位点的sgRNA导入含有正负筛选标记(coda::nptii或hpt::coda)的基因编辑载体中，该基因编辑载体包括基因编辑元件、正负筛选标记以及农杆菌载体骨架片段；(2)以基因编辑载体为基础构建基因敲除载体并将其通过农杆菌转化需要处理的植株(包括烟草、拟南芥、水稻等)，实施转基因，并通过nptii或hygromycin进行正向筛选获得第一代(拟南芥叫T1代，烟草、水稻等叫T0代)含有转基因元件的基因定点突变材料；(3)种植步骤(2)中所获得的第一代突变体，并收获种子。(4)利用负向筛选标记codA，对所收获的种子进行筛选，最终获得不含转基因成分的基因定点突变材料。
进一步的，所述基因编辑元件为ZFNs、TALENs或CRISPR/Cas9。
进一步的，所述正负筛选标记coda::nptii的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述正负筛选标记hpt::coda的序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述步骤(2)中构建的基因编辑载体中Cas9基因由35S启动子驱动，正负筛选标记为coda::nptii或hpt::coda，上述基因编辑载体适用于烟草、大豆或油菜。
进一步的，所述步骤(2)中构建的基因编辑载体中Cas9基因由Ec1.1启动子驱动，正负筛选标记为hpt::coda，上述基因编辑载体适用于拟南芥。
进一步的，所述步骤(2)中构建的基因编辑载体中Cas9基因由玉米Ubi-1启动子驱动，正负筛选标记为coda::nptii或hpt::coda，上述基因编辑载体适用于水稻、小麦、玉米或谷子。
本发明提供的上述方法适用的植物包括包括烟草、大豆、油菜、拟南芥等双子叶植物和水稻、小麦、玉米、谷子等单子叶植物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明极大的减少了后代的基因定点突变材料剔除转基因成分鉴定所需的大量时间和劳动力，包括PCR和Southern等，而且可以有效避免假阳性，为突变体获取和后代遗传改良提供切实有用的工具。
附图说明
图1为快速筛选非转基因定点突变植物的流程图。
图2为实施例1-3中含有coda::nptii或hpt::codA正负筛选编辑的一系列基因编辑载体示意图。
图3为实施例1中烟草NbXylt1和NbXylt2基因示意图。
图4为实施例1中利用PCR/RNP检测pCNS-Xylt和pHCS-Xylt诱导的基因定点突变及测序结果图，其中箭头所示为突变条带。
图5为实施例1中利用CodA负向筛选标记进行筛选烟草T1代不含转基因的xylt突变体结果图。
图6为实施例1中CodA筛选后烟草T1代不含转基因的xylt突变体的PCR鉴定结果。
图7为实施例2中拟南芥基因AtBRI1示意图。
图8为实施例2中利用Sanger测序检测pHCE-BRI1诱导的基因定点突变图。
图9为实施例2中拟南芥纯合bri1突变体表型图。
图10为实施例2中利用CodA负向筛选标记进行筛选拟南芥T2代不含转基因的bri1突变体结果图。
图11为实施例3中水稻Osglossy2基因示意图。
图12为实施例3中利用PCR/RE检测pCNU-glossy2和pHCU-glossy2诱导的基因定点突变图，其中箭头所示为突变条带。
具体实施方式
实施例1
本实施例利用正负筛选标记筛选获得了非转基因烟草Nbxylt基因的突变体，过程如下：
1.适用于烟草的含正负筛选标记(coda::nptii或hpt::coda)敲除载体的构建
(1)pCNS-Cas9载体的构建：包含coda::nptii正负筛选标记、35S启动子驱动Cas9的表达、AtU6-26启动子驱动sgRNA的表达，适用于烟草基因敲除。设计引物411-F SEQ IDNO.3：5’-AGTAGATGCCGACCGGATCTGTC-3’和RB-R SEQ ID NO.4：5’-TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC-3’，以pCambia1300为模板(pCambia1300可从优宝生物公司购买)，扩增得到包含农杆菌载体骨架的片段1；设计引物RB-F SEQ ID NO.5：5’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA-3’和411-R SEQ ID NO.6：5’-ATCTCATTGCCCCCCGGATC-3’，以pHSN401为模板(pHSN401质粒：在文献“Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-PingWang,Hai-YanZhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plantbiology.14:327-338(2014)”中公开过)，得到包含有Cas9和sgRNA表达框的片段2；设计引物CN-FSEQ IDNO.7：5’-ATCCCGGGGGGCAATGAGATATGTCGAATAACGCTTTACA-3’和5’-CN-R SEQ ID NO.8：AGATCCGGTCGGCATCTACTTCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3’，以pUC-CodANPTII(订购自Genscript公司)为模板，扩增得到包含有coda::nptii表达框的片段3；利用购买自全式金公司的pEASY-UniSeamless Cloning andAssembly Kit试剂盒将上述3个片段连接起来，得到pCNS-Cas9载体，如图2所示。
(2)pHCS-Cas9载体的构建：包含hpt::coda正负筛选标记、35S启动子驱动Cas9的表达、AtU6-26启动子驱动sgRNA的表达，适用于烟草基因敲除。设计引物411-F SEQ IDNO.9：5’-AGTAGATGCCGACCGGATCTGTC-3’和RB-R SEQ ID NO.10：5’-TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC-3’，以pCambia1300为模板，扩增得到包含农杆菌载体骨架的片段1；设计引物RB-F SEQ ID NO.11：5’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA-3’和hyg-R SEQ IDNO.12：5’-CTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGG-3’，以pHSN401为模板，得到包含有Cas、sgRNA表达框和hygromycin的片段2；设计引物CodA-F SEQ ID NO.13：5’-CTCGTCCGAGGGCAAAGAAAGCGGCCGCCGGAGGCGGAATGTCGAATAACGCTTTACA-3’和CodA-R SEQ ID NO.14：5’-GATCCCGGTCGGCATCTACTCTAACGTTTGTAATCGATGG-3’，以pUC-CodANPTII(订购自Genscript公司)为模板，扩增得到包含有coda表达框的片段3；利用购买自全式金公司的pEASY-Uni Seamless CloningandAssembly Kit试剂盒将上述3个片段连接起来，得到pHCS-Cas9载体，如图2所示。
2.烟草NbXylT基因敲除载体的构建
烟草NbXylT基因敲除载体的构建：烟草中含有两个拷贝XylT基因，分别命名为NbXylt1和NbXylt2基因，设计sgRNA靶位点，序列SEQ ID NO.15如下：5’-GCGAGGGTTACTTCGGTAATGG-3’，下划线标注为PAM序列，可以同时靶向NbXylt1和NbXylt2基因，如图3所示。合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
Xylt-F SEQ ID NO.16：5’-ATTGCGAGGGTTACTTCGGTAA-3’；
Xylt-R SEQ ID NO.17：5’-AAACTTACCGAAGTAACCCTCG-3’。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，分别插入到pCNS-Cas9和pHCS-Cas9质粒的两个BsaI酶切位点之间，即得含有Xylt靶位点的质粒，质粒经测序验证阳性质粒，，分别命名为pCNS-Xylt和pHCS-Xylt。
3.pCNS-Xylt和pHCS-Xylt敲除载体分别转化烟草
(1)分别将pCNS-Xylt和pHCS-Xylt敲除载体转化到农杆菌EHA105中，分别得到重组农杆菌pCNS-Xylt/EHA105和pHCS-Xylt/EHA105。
(2)重组农杆菌pCNS-Xylt/EHA105和pHCS-Xylt/EHA105在含有卡那霉素和利福平的LB固体培养基上培养2天，挑选1个单克隆，接种于LB液体培养基中，28℃培养过夜，离心收集农杆菌，用MS0培养基(每升培养基中：MS培养基4.4g；蔗糖30g,KOH调PH＝5.8)重悬，OD600调至0.6左右。
(3)选取生长周期约40天的烟草，将叶片剪成约0.6CM2的叶盘，用上述农杆菌悬浮液侵染8-10min，滤纸吸干液体，叶脉朝上平铺共培养培养基上，24℃暗培养，培养3天。
(4)转入第一轮筛选培养基(每升培养基中：MS培养基4.4g；MES 0.5g；6-BA 1mg；IAA0.1mg；Timentin 150mg；蔗糖30g；phytagel 2.5g；KOH调PH＝5.8)，24℃条件下暗培养2-3周，待黄色芽长出后，转入光下。利用50mg/L的卡那霉素对pCNS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选；利用30mg/L的潮霉素对pHCS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选。
(5)转入第二轮筛选培养基(每升培养基中：MS培养基4.4g；MES 0.5g；6-BA0.6mg；IAA0.05mg；Timentin 150mg；蔗糖30g；phytagel 2.5g；KOH调PH＝5.8)，光下培养一周，待芽长出。利用50mg/L的卡那霉素对pCNS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选；利用30mg/L的潮霉素对pHCS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选。
(6)切下芽转入到第三轮筛选培养基(每升培养基中：MS培养基4.4g；MES 0.5g；6-BA 0.2mg；IAA0.02mg；Timentin 100mg；蔗糖30g；phytagel 2.5g；KOH调PH＝5.8)上，光下培养一周。利用50mg/L的卡那霉素对pCNS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选；利用10mg/L的潮霉素对pHCS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选。
(7)待芽长出后转入到生根培养基上(每升培养基中：MS培养基2.2g；MES 0.5g；Timentin 100mg；蔗糖30g；phytagel 2.5g；KOH调PH＝5.8)，生长大约10天，得到待检测的T0代转基因植株。利用50mg/L的卡那霉素对pCNS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选；利用10mg/L的潮霉素对pHCS-Xylt/EHA105转化材料进行正向筛选。
4.T0代烟草xylt突变体的鉴定
(1)分别设计引物D-Nbxylt1-F SEQ ID NO.18：5’-TACGGTAGGTGACGACCATC-3’和D-Nbxylt1-R SEQ ID NO.19：5’-GGCATCTAGTCGGGATATTC-3’，用于扩增NbXylT1基因中包含有靶位点的PCR片段；分别设计引物D-Nbxylt2-F SEQ ID NO.20：5’-GAGAGGTTGTCCCGAAATAG-3’和D-Nbxylt2-R SEQ ID NO.21：5’-CTGCCAACATTCACAAAGTTC-3’，用于扩增NbXylT2基因中包含有靶位点的PCR片段用于突变检测；
(2)提取步骤3中获得的烟草植株基因组DNA，利用PCR/RNP进行突变检测，分析结果显示，pCNS-Xylt和pHCS-Xylt两个载体在NbXylt1和NbXylt2两个的基因靶位点均发生了突变，测序结果表明在靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变，如图4所示。
5.T1代烟草xylt突变体后代转基因成分剔除的鉴定
(1)将上述获得的T0代烟草xylt突变体种植于温室中，并收获T1代种子。
(2)将T1代烟草种子，分别铺于含有5-FC(工作浓度为500mg/L)的1/2MS固体培养基和常规1/2MS固体培养基上，每个家系50粒种子，光下培养10天左右。
(3)统计T1代种子在上述两种培养基上的发芽率。以家系CNS-1为例，在含有5-FC的1/2MS培养基上，发芽率为28％(14/50)，而且符合孟德尔遗传规律；在普通1/2MS固体培养基上，发芽率为100％(图5)。多个家系统计结果如下表1所示。
表1 CodA筛选非转基因烟草xylt突变体统计结果
(4)将步骤(3)中两种培养基上长出的苗，取部分叶片，提取基因组DNA，设计以下4对引物：第一对，PDS-F SEQ ID NO.22：5’-CATAGCAATTTCTTTCAAGATCTC-3’和PDS-R SEQ IDNO.23：5’-AACGCTGAAGGGAGAAATTTAC-3’(用于检测基因组DNA是否完好)；第二对，NPTII-FSEQ ID NO.24：5’-CTTGGGTGGAGAGGCTATTC-3’和NPTII-R SEQ ID NO.25：5’-TACCGTAAAGCACGAGGAAG-3’(用于codA::nptii是否存在)；第三对，HPT-F SEQ ID NO.26：5’-GCGAAGAATCTCGTGCTTTC-3’和HPT-R SEQ ID NO.27：5’-TCCATCACAGTTTGCCAGTG-3’(用于hpt::coda是否存在)；第四对，AtU6-26F SEQ ID NO.28：5’-CGACTTGCCTTCCGCACAATAC-3’和XylT-R SEQ ID NO.29：5’-AAACTTACCGAAGTAACCCTCG-3’(用于基因编辑元件是否存在)。利用PCR鉴定是否含有转基因。结果显示：含有5-FC的1/2MS培养基上所长出的突变体，均不含转基因成分，比例为100％，如图6所示。以上结果说明，本发明在利用正负筛选标记(coda::nptii或hpt::coda)进行快速筛选非转基因定点突变体的结果与常规PCR鉴定结果完全一致，十分有效。
实施例2
本实施例利用含有hpt::coda正负筛选标记载体定点突变拟南芥AtBRI1基因，过程如下：
1.适用于拟南芥的含正负筛选标记hpt::coda敲除载体pHCE-Cas9的构建
pHCE-Cas9载体：包含hpt::coda正负筛选标记、EC1.1启动子驱动Cas9的表达、AtU6-26启动子驱动sgRNA的表达，适用于拟南芥基因敲除。设计引物411-F SEQ ID NO.30：5’-AGTAGATGCCGACCGGATCTGTC-3’和RB-R SEQ ID NO.31：5’-TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC-3’，以pCambia1300为模板，扩增得到包含农杆菌载体骨架的片段1；设计引物RB-F SEQ ID NO.32：5’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA-3’和hyg-R SEQ IDNO.33：5’-CTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGG-3’，以pHEE401为模板(pHEE401质粒：在文献“Hui-LiXing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plantbiology.14:327-338(2014)”中公开过)，得到包含有Cas9、sgRNA表达框和hygromycin的片段2；设计引物CodA-F SEQ ID NO.34：5’-CTCGTCCGAGGGCAAAGAAAGCGGCCGCCGGAGGCGGAATGTCGAATAACGCTTTACA-3’和CodA-R SEQ ID NO.35：5’-GATCCCGGTCGGCATCTACTCTAACGTTTGTAATCGATGG-3’，以pUC-CodANPTII(订购自Genscript公司)为模板，扩增得到包含有coda表达框的片段3；利用购买自全式金公司的pEASY-Uni SeamlessCloning andAssembly Kit试剂盒将上述3个片段连接起来，得到pHCE-Cas9载体，如图2所示。
2.拟南芥AtBRI1基因敲除载体的构建
设计sgRNA靶位点，序列SEQ ID NO.36如下：5’-TTGGGTCATAACGATATCTCTGG-3’，下划线标注为PAM序列，可以同时靶向AtBRI1基因外显子区域(图7)。合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
BRI1-F SEQ ID NO.37：5’-ATTGTGGGTCATAACGATATCTC-3’；
BRI1-R SEQ ID NO.38：5’-AAACGAGATATCGTTATGACCCA-3’。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，分别插入到pHCE-Cas9质粒的两个BsaI酶切位点之间，即得含有BRI1靶位点的质粒，质粒经测序验证阳性质粒，命名为pHCE-BRI1。
3.pHCE-BRI1转化拟南芥已经转基因植株的获得
(1)将pHCE-BRI1敲除载体转化到农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌pHCE-BRI1/EHA105。
(2)重组农杆菌pHCE-BRI1/EHA105在含有卡那霉素和利福平的LB固体培养基上培养2天，挑选1个单克隆，接种于LB液体培养基中，28℃培养过夜，离心收集农杆菌，用5％蔗糖溶液重悬菌体，OD600调至0.6左右，加入0.02％的Silwet L-77。
(3)将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉)。
(4)然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次。之后在光下培养直至成熟，并收取种子。
(5)将收取的拟南芥种子，用10％的NaClO消毒液表面消毒6-8min，继而用无菌水漂洗3次；然后播种在含有30mg/L潮霉素的1/2mMS培养基上，4℃低温避光处理2天后，转入光照培养室生长。幼苗培养7天左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长(蛭石：营养土＝1：1)。植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。
4.T0代拟南芥bri1突变体的鉴定
(1)分别设计引物D-AtBRI1-F SEQ ID NO.39：5’-GATGGGATGAAGAAAGAGTG-3’和D-AtBRI1-R SEQ ID NO.40：5’-CTCATCTCTCTACCAACAAG-3’，用于扩增AtBRI1基因中包含有靶位点的PCR片段，用于突变检测；
(2)将步骤(1)中的PCR产物直接进行Sanger测序，最终检测到4株突变体，测序结果表明在靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变(图8)。其中2株为杂合突变体，2株为纯合突变体，纯合突变体表现出矮小皱缩等表型(图9)，与前人结果相符。
5.T2代拟南芥bri1突变体后代转基因成分剔除的鉴定
(1)将上述获得的T1代拟南芥bri1突变体种植于温室中，并收获T2代种子。
(2)将T2代拟南芥种子，分别铺于含有5-FC(工作浓度为500mg/L)的1/2MS固体培养基和常规1/2MS固体培养基上，每个家系50粒种子左右，光下培养10天左右。
(3)统计T2代种子在上述两种培养基上的发芽率。以家系bri1-1为例，在含有5-FC的1/2MS培养基上，发芽率为20％(10/50)，而且符合孟德尔遗传规律；在普通1/2MS固体培养基上，发芽率为100％(图10)。
实施例3
本实施例利用含有正负筛选标记(coda::nptii或hpt::coda)的载体定点突变水稻Osglossy2基因，过程如下：
1.适用于水稻的含正负筛选标记(coda::nptii或hpt::coda)敲除载体的构建
(1)pCNU-Cas9载体的构建：包含coda::nptii正负筛选标记、玉米Ubi-1启动子驱动Cas9的表达、OsU3启动子驱动sgRNA的表达，适用于水稻基因敲除。设计引物411-F SEQID NO.41：5’-AGTAGATGCCGACCGGATCTGTC-3’和RB-R SEQ ID NO.42：5’-TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC-3’，以pCambia1300为模板，扩增得到包含农杆菌载体骨架的片段1；设计引物RB-F SEQ ID NO.43：5’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA-3’和411-R SEQ IDNO.44：5’-ATCTCATTGCCCCCCGGATC-3’，以pHUN411为模板(pHUN411质粒：在文献“Hui-LiXing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338(2014)”中公开过)，得到包含有Cas9和sgRNA表达框的片段2；设计引物CN-F SEQ ID NO.45：5’-ATCCCGGGGGGCAATGAGATATGTCGAATAACGCTTTACA-3’和CN-R SEQ ID NO.46：5’-AGATCCGGTCGGCATCTACTTCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3’，以pUC-CodANPTII(订购自Genscript公司)为模板，扩增得到包含有coda::nptii表达框的片段3；利用GibsonAssembly将上述3个片段连接起来，得到pCNU-Cas9载体(图2)。
(2)pHCU-Cas9载体的构建：包含hpt::coda正负筛选标记、Ubiquitin启动子驱动Cas9的表达、OsU3启动子驱动sgRNA的表达，适用于水稻基因敲除。设计引物411-F SEQ IDNO.47：5’-AGTAGATGCCGACCGGATCTGTC-3’和RB-R SEQ ID NO.48：5’-TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC-3’，以pCambia1300为模板，扩增得到包含农杆菌载体骨架的片段1；设计引物RB-F SEQ ID NO.49：5’-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA-3’和hyg-R SEQ IDNO.50：5’-CTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGG-3’，以pHUN411为模板(pHUN411质粒：在文献“Hui-LiXing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang,Chun-Yan Han,Bing Liu,Xue-Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338(2014)”中公开过)，得到包含有Cas、sgRNA表达框和hygromycin的片段2；设计引物CodA-F SEQ ID NO.51：5’-CTCGTCCGAGGGCAAAGAAAGCGGCCGCCGGAGGCGGAATGTCGAATAACGCTTTACA-3’和CodA-R SEQ ID NO.52：5’-GATCCCGGTCGGCATCTACTCTAACGTTTGTAATCGATGG-3’，以pUC-CodANPTII(订购自Genscript公司)为模板，扩增得到包含有coda表达框的片段3；利用购买自全式金公司的pEASY-Uni SeamlessCloning andAssembly Kit试剂盒将上述3个片段连接起来，得到pHCU-Cas9载体(图2)。
2.水稻Osglossy2基因敲除载体的构建
设计sgRNA靶位点，序列SEQ ID NO.53如下：5’-CATGGCGCTCGGCTTCAGCTGGG-3’，下划线标注为PAM序列，可以同时靶向Osglossy2基因外显子区域(图11)。合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：
glossy2-F SEQ ID NO.54：5’-GGCGATGGCGCTCGGCTTCAGCT-3’；
glossy2-R SEQ ID NO.55：5’-AAACAGCTGAAGCCGAGCGCCAT-3’。
经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，分别插入到pCNU-Cas9和pHCU-Cas9质粒的两个BsaI酶切位点之间，即得含有glossy2靶位点的质粒，质粒经测序验证阳性质粒，命名为pCNU-glossy2和pHCU-glossy2。
3.pCNU-glossy2和pHCU-glossy2敲除载体分别转化烟草
分别将pCNU-glossy2和pHCU-glossy2敲除载体转化到农杆菌EHA105中，分别得到重组农杆菌pCNU-glossy2/EHA105和pHCU-glossy2/EHA105，分别转化水稻胚性愈伤，具体过程如下：
(1)手动去除成熟水稻种子的壳以免损害胚。将去壳的种子洗涤30分钟，同时在含有1至2滴Tween20的2％次氯酸钠的50mL管中剧烈摇动。然后用30至40ml无菌水冲洗种子约4至6次。
(2)将种子在滤纸上沥干，并将其置于含有30mLM1愈伤组织诱导培养基的塑料培养皿中。用封口膜密封培养皿。将成熟种子在28℃暗中孵育。
(3)七天后，来自成熟种子的愈伤组织形成。用镊子小心地分离种子和愈伤组织，并将愈伤组织放入含有30ml新鲜M1培养基的塑料9cm培养皿中，将它们在28℃暗中孵育。
(4)在立体显微镜下选择胚性愈伤组织，并将其转移到具有30ml新鲜M1培养基的9cm塑料培养皿中。两周内，严重分化的愈伤组织直径将增长至5毫米。
(5)将愈伤组织转移到具有30ml新鲜M1培养基的9cm培养皿中。3天后，它们将用于转化。
(6)转化前3天，将重组农杆菌pCNU-glossy2/EHA105和pHCU-glossy2/EHA105接种到含有5mL含有适当抗生素的LB培养基的50mL管中用于选择。将试管在28℃、250rpm/min的振荡器上孵育过夜至OD600达到1.0-2.0。在13,400ⅹg，25℃下离心5分钟，并将沉淀重新悬浮在最终体积为约25ml的AAM培养基(OD600～0.1)中。将农杆菌置于100ml锥形玻璃烧瓶中在振荡器上混匀，而后在28℃和250rpm/min下孵育4小时，以激活农杆菌用于愈伤组织转化。
(7)把步骤(5)中的愈伤组织收集到无菌玻璃盘中。把步骤(6)的农杆菌悬浮液添加到玻璃皿中，直到浸没所有愈伤组织。搅拌30分钟直至转染过程完成。
(8)孵育后去除多余的细菌悬浮液，将转染的愈伤组织到滤纸上干燥。用镊子将它们转移到无菌玻璃培养皿中的两片滤纸上，并用微孔医用密封带密封培养皿。25℃暗中孵育3天
(9)与农杆菌共培养后，在含有200mg/L羧苄青霉素或头孢噻肟的无菌水中冲洗转染的愈伤组织2至3次，直至洗涤后的水变澄清。
(10)将转染的愈伤组织在滤纸上脱水，进行充分的空气干燥，然后将组织转移到含有30ml M2选择培养基的9cm塑料培养皿中。将转染的愈伤组织在28℃暗中孵育两周。pCNU-glossy2/EHA105使用150mg/L的G418进行筛选和pHCU-glossy2/EHA105使用50mg/L的潮霉素B进行筛选。
(11)两周的选择过后，许多转染了的愈伤组织会变黑。将所有愈伤组织转移至新鲜含有相应抗生素的M2选择培养基中，并在28℃下在暗中孵育另外两周。
(12)十到十四天后，抗性愈伤组织长大并可转移到M5再生培养基中。将抗性愈伤组织置于含有30ml M5再生培养基的9cm培养皿中，并在28℃下在光照下孵育。
(13)大约3周后，在愈伤组织表面应形成许多绿色尖端，这些绿色尖端将产生具有抗性的绿色幼苗。
(14)将抗性绿色小植株转移到具有约60mLM6生根培养基的18cm长玻璃容器中，以在28℃下在光照下进一步发育。
(15)转基因植物长大后，打开容器的盖子并加入一些水以适应环境。一周后，将转基因植物移植到土壤中。
4.T0代水稻glossy2突变体的鉴定
(1)分别设计引物D-Osglossy2-F SEQ ID NO.56：5’-TGCAGCACAGCTCACAAGTC-3’和D-Osglossy2-R SEQ ID NO.57：5’-CCATGTCGACGAACGTCAGG-3’，用于扩增Osglossy2基因中包含有靶位点的PCR片段，用于突变检测；
(2)提取步骤3中获得的水稻植株基因组DNA，利用PCR/RE进行突变检测，分析结果显示，pCNU-glossy2和pHCU-glossy2两个载体均可以在Osglossy2基因靶位点均发生了突变，如图12所示。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 山西大学
<120> 一种快速筛选非转基因定点突变植物的方法
<130> 2020.4.29
<141> 2020-05-11
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg 60
tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg 120
cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag 180
ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc 240
acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat 300
gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg 360
cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg 420
aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt 480
ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta 540
gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa 600
accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat 660
gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc 720
gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca 780
cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat 840
attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa 900
gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg 960
tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag 1020
ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg 1080
acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg 1140
ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt 1200
ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca 1260
gaagccatcg attacaaacg tgcggccgcc ggaggcggaa tggggattga acaagatgga 1320
ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa 1380
cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg tttcggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt 1440
ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tccaggacga ggcagcgcgg 1500
ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa 1560
gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac 1620
cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt 1680
gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact 1740
cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg 1800
ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg 1860
acacatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc 1920
atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt 1980
gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc 2040
gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctga 2097
<210> 2
<211> 2325
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat 360
gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca 780
cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020
aaagcggccg ccggaggcgg aatgtcgaat aacgctttac aaacaattat taacgcccgg 1080
ttaccaggcg aagaggggct gtggcagatt catctgcagg acggaaaaat cagcgccatt 1140
gatgcgcaat ccggcgtgat gcccataact gaaaacagcc tggatgccga acaaggttta 1200
gttataccgc cgtttgtgga gccacatatt cacctggaca ccacgcaaac cgccggacaa 1260
ccgaactgga atcagtccgg cacgctgttt gaaggcattg aacgctgggc cgagcgcaaa 1320
gcgttattaa cccatgacga tgtgaaacaa cgcgcatggc aaacgctgaa atggcagatt 1380
gccaacggca ttcagcatgt gcgtacccat gtcgatgttt cggatgcaac gctaactgcg 1440
ctgaaagcaa tgctggaagt gaagcaggaa gtcgcgccgt ggattgatct gcaaatcgtc 1500
gccttccctc aggaagggat tttgtcgtat cccaacggtg aagcgttgct ggaagaggcg 1560
ttacgcttag gggcagatgt agtgggggcg attccgcatt ttgaatttac ccgtgaatac 1620
ggcgtggagt cgctgcataa aaccttcgcc ctggcgcaaa aatacgaccg tctcatcgac 1680
gttcactgtg atgagatcga tgacgagcag tcgcgctttg tcgaaaccgt tgctgccctg 1740
gcgcaccatg aaggcatggg cgcgcgagtc accgccagcc acaccacggc aatgcactcc 1800
tataacgggg cgtatacctc acgcctgttc cgcttgctga aaatgtccgg tattaacttt 1860
gtcgccaacc cgctggtcaa tattcatctg caaggacgtt tcgatacgta tccaaaacgt 1920
cgcggcatca cgcgcgttaa agagatgctg gagtccggca ttaacgtctg ctttggtcac 1980
gatgatgtct tcgatccgtg gtatccgctg ggaacggcga atatgctgca agtgctgcat 2040
atggggctgc atgtttgcca gttgatgggc tacgggcaga ttaacgatgg cctgaattta 2100
atcacccacc acagcgcaag gacgttgaat ttgcaggatt acggcattgc cgccggaaac 2160
agcgccaacc tgattatcct gccggctgaa aatgggtttg atgcgctgcg ccgtcaggtt 2220
ccggtacgtt attcggtacg tggcggcaag gtgattgcca gcacacaacc ggcacaaacc 2280
accgtatatc tggagcagcc agaagccatc gattacaaac gttag 2325
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
agtagatgcc gaccggatct gtc 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tgacaggata tattggcggg taaac 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gtttacccgc caatatatcc tgtca 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
atctcattgc cccccggatc 20
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
atcccggggg gcaatgagat atgtcgaata acgctttaca 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
agatccggtc ggcatctact tcagaagaac tcgtcaagaa 40
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
agtagatgcc gaccggatct gtc 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tgacaggata tattggcggg taaac 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gtttacccgc caatatatcc tgtca 25
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ctttgccctc ggacgagtgc tgg 23
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
ctcgtccgag ggcaaagaaa gcggccgccg gaggcggaat gtcgaataac gctttaca 58
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gatcccggtc ggcatctact ctaacgtttg taatcgatgg 40
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gcgagggtta cttcggtaat gg 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
attgcgaggg ttacttcggt aa 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
aaacttaccg aagtaaccct cg 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
tacggtaggt gacgaccatc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
ggcatctagt cgggatattc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
gagaggttgt cccgaaatag 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
ctgccaacat tcacaaagtt c 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
catagcaatt tctttcaaga tctc 24
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
aacgctgaag ggagaaattt ac 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
cttgggtgga gaggctattc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
taccgtaaag cacgaggaag 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
gcgaagaatc tcgtgctttc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
tccatcacag tttgccagtg 20
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
cgacttgcct tccgcacaat ac 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
aaacttaccg aagtaaccct cg 22
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
agtagatgcc gaccggatct gtc 23
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
tgacaggata tattggcggg taaac 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
gtttacccgc caatatatcc tgtca 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
ctttgccctc ggacgagtgc tgg 23
<210> 34
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
ctcgtccgag ggcaaagaaa gcggccgccg gaggcggaat gtcgaataac gctttaca 58
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
gatcccggtc ggcatctact ctaacgtttg taatcgatgg 40
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
ttgggtcata acgatatctc tgg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
attgtgggtc ataacgatat ctc 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
aaacgagata tcgttatgac cca 23
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
gatgggatga agaaagagtg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
ctcatctctc taccaacaag 20
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
agtagatgcc gaccggatct gtc 23
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
tgacaggata tattggcggg taaac 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 43
gtttacccgc caatatatcc tgtca 25
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 44
atctcattgc cccccggatc 20
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 45
atcccggggg gcaatgagat atgtcgaata acgctttaca 40
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 46
agatccggtc ggcatctact tcagaagaac tcgtcaagaa 40
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 47
agtagatgcc gaccggatct gtc 23
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 48
tgacaggata tattggcggg taaac 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 49
gtttacccgc caatatatcc tgtca 25
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 50
ctttgccctc ggacgagtgc tgg 23
<210> 51
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 51
ctcgtccgag ggcaaagaaa gcggccgccg gaggcggaat gtcgaataac gctttaca 58
<210> 52
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 52
gatcccggtc ggcatctact ctaacgtttg taatcgatgg 40
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 53
catggcgctc ggcttcagct ggg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 54
ggcgatggcg ctcggcttca gct 23
<210> 55
<211> 23
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<213> 人工序列()
<400> 55
aaacagctga agccgagcgc cat 23
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 56
tgcagcacag ctcacaagtc 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 57
ccatgtcgac gaacgtcagg 20