阅读说明：本技术 一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺 (Process for preparing gamma-aminobutyric acid by immobilized enzyme ) 是由 林金新 黄平 郭小雷 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及氨基丁酸的制备技术领域,尤其涉及一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺。其包括以下步骤：制备固定化谷氨酸脱羧酶：制备离子液体再生纤维素载体；将海藻糖、普鲁兰多糖和氧化石墨烯混合后高速匀浆得到热稳定剂,并加入到谷氨酸脱羧酶液中得到热稳定处理后的酶液；向热稳定处理后的酶液中加入还原型谷胱甘肽,得到活性处理后的酶液；将离子液体再生纤维素载体加入到活性处理后的酶液中,密封、并置于25~30℃水浴震荡12~16h,然后取出载体、并用去离子冲洗,冷冻冻干得到固定化谷氨酸脱羧酶；以浓度为1~2%的谷氨酸溶液为底物,固定化谷氨酸脱羧酶为酶源,将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。通过本申请的工艺制备γ-氨基丁酸具有较高的收率。(The invention relates to the technical field of preparation of aminobutyric acid, and particularly relates to a process for preparing gamma-aminobutyric acid by using immobilized enzyme. Which comprises the following steps: preparation of immobilized glutamate decarboxylase: preparing an ionic liquid regenerated cellulose carrier; mixing trehalose, pullulan and graphene oxide, homogenizing at a high speed to obtain a heat stabilizer, and adding the heat stabilizer into a glutamic acid decarboxylase solution to obtain an enzyme solution subjected to heat stabilization treatment; adding reduced glutathione into the enzyme solution after the thermal stabilization treatment to obtain enzyme solution after the activity treatment; adding an ionic liquid regenerated cellulose carrier into the enzyme solution after the activity treatment, sealing, placing in a water bath at 25-30 ℃, oscillating for 12-16 h, taking out the carrier, washing with deionized water, freezing and freeze-drying to obtain immobilized glutamic acid decarboxylase; glutamic acid solution with the concentration of 1-2% is used as a substrate, immobilized glutamate decarboxylase is used as an enzyme source, and glutamic acid is converted into gamma-aminobutyric acid. The process for preparing the gamma-aminobutyric acid has higher yield.)

一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺

技术领域

本发明涉及氨基丁酸的制备技术领域，尤其涉及一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺。

背景技术

γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然存在的功能性氨基酸，具有治疗高血压、癫痫和帕金森病，防止动脉硬化、调节心律失常、镇痛、抗皮肤衰老等功能，在医疗、保健上有非常重要的价值。生物体内的GABA大多由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化谷氨酸脱羧产生，其辅酶是5-磷酸吡哆醛。作为药品或保健品原理的GABA制备方法主要有化学合成法、分离提取法和生物合成法3种，生物合成法成为主流技术。生物合成法是利用固定化谷氨酸脱羧酶（IGAD）转化谷氨酸得到GABA。

生物合成法的产率极大程度上由固定化酶的活性决定，酶的固定化是将酶束缚在载体材料上，使其与整体相分隔，但仍能与底物反应，这种固定化酶不但具有酶的专一性、高效性等特性，且具有可回收、反复使用等优点，使用寿命和存储寿命都比游离酶长。载体材料作为固定化酶的一个重要部分，其自身的结构和性能对固定化酶的各种性能有及其重大的影响，目前常用的固定化载体大多为水凝胶、碳纤维、壳聚糖等。

比如专利号为CN103045666A的专利号公开了这样一种用磁性微球固定化米糠谷氨酸脱羧酶制备γ-氨基丁酸的方法。其是将米糠酶提取液提取出谷氨酸脱羧酶，与制备好的磁性壳聚糖微球进行微粒反应，得到磁性固定化谷氨酸脱羧酶；将此固定化酶与反应液混合，加入0.01-0.05mol/L的谷氨酸钠作为底物，摇床反应得到γ-氨基丁酸。其以磁性壳聚糖作为载体，只是通过磁性便于载体从反应体系中分离回收，不具有提高酶活的效用，γ-氨基丁酸的产率较低。

发明内容

本发明要解决上述问题，提供一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺。

本发明解决问题的技术方案是，提供一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺，包括以下步骤：

（1）制备固定化谷氨酸脱羧酶：a.制备离子液体再生纤维素载体；b. 将海藻糖、普鲁兰多糖和氧化石墨烯混合后高速匀浆得到热稳定剂，并加入到谷氨酸脱羧酶液中得到热稳定处理后的酶液；c.向热稳定处理后的酶液中加入还原型谷胱甘肽，并使得还原型谷胱甘肽的质量浓度为0.3~0.8mg/mL，得到活性处理后的酶液；d. 将离子液体再生纤维素载体加入到活性处理后的酶液中，密封、并置于25~30℃水浴震荡12~16h，然后取出载体、并用去离子冲洗，冷冻冻干得到固定化谷氨酸脱羧酶；

（2）以浓度为1~2%的谷氨酸溶液为底物，所述固定化谷氨酸脱羧酶为酶源，将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。

其中，普鲁兰多糖、海藻糖和氧化石墨烯形成的热稳定剂能够在酶周边提供保水层，使得酶不容易因为失水变形，利于维持酶分子空间构造的稳定性。

凡能增强酶的活性、加快酶促反应速度的物质，称为激活剂。激活剂种类很多，有①无机阳离子，如钠离子、钾离子、铜离子、钙离子等；②无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、硫酸盐离子磷酸盐离子等；③有机化合物，如维生素C、半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等。还原性谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，在体内可以增强GABA激活的神经元反应，本申请采用还原形谷胱甘肽作为酶刺激剂，能够激发酶的活性，提高酶活以提高γ-氨基丁酸的收率，并提高生产得到的γ-氨基丁酸的使用效果。

同时，氧化石墨烯能够吸附固定谷胱甘肽分子，谷胱甘肽在氧化石墨烯上原位氧化并自组装形成胶体粒子，胶体粒子可作为酶的载体，进一步提高酶活。

作为本发明的优选，步骤（2）中，将固定化谷氨酸脱羧酶填充于反应柱中，在35~40℃下，使得谷氨酸溶液以1.1~1.3V柱体积/h的流速流经反应柱。

作为发明的优选，步骤（1）中，还包括以下步骤：将离子液体再生纤维素载体加入到高碘酸钠溶液中，改性结束后取出载体，直接冷冻冻干，得到高碘酸钠改性的载体，再将改性的载体加入到活性处理后的酶液中。

采用高碘酸钠对载体进行改性，高碘酸钠的氧化作用能够使得纤维素的连二醇基断裂产生醛基（-CHO），醛基可与酶分子中的氨基（-NH₂）以共价键形式结合，从而能够提高固定化酶酶活性。同时，改性结束后的载体不经过去离子水清洗、直接冻干，这就使得部分高碘酸钠附着在载体上，当含有高碘酸钠的载体加入到含有以氧化石墨烯和谷胱甘肽形成的胶体粒子的酶液中，胶体粒子中的还原性谷胱甘肽的结构中含有一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢；高碘酸钠可以将硫化物选择性地氧化成亚砜，在高温或加入过量的高碘酸钠的情况下，会将硫化物氧化为砜。因此在高碘酸钠的选择性氧化作用下，巯基被氧化为亚砜基甚至砜基，亚砜基和砜基均具有很强的吸电子性，而纤维素中具有供电子基团-OH，酶中具有供电子基-NH₂。因此胶体粒子除去以本身凝胶物理吸附作为酶的载体外，还能成为中间连接结构，通过吸电子基团分别与纤维素供电子基团和酶的供电子基团结合，这就使得酶被牢牢地负载在载体上，从而有效提高固定化的稳定性和酶活性。

作为本发明的优选，采用浓度为0.5~1mol/L的高碘酸钠溶液，且离子液体再生纤维素载体和高碘酸钠的投加比例为1g：（0.05~0.1）mol。

作为本发明的优选，冷冻冻干条件为：以液氮于-85℃~-75℃下冷冻干燥18~24h。

作为本发明的优选，步骤b中，谷氨酸脱羧酶液的浓度为4~7mg/mL。

作为本发明的优选，谷氨酸脱羧酶和离子液体再生纤维素载体混合质量比为（0.25~0.3）：1。

作为本发明的优选，步骤a的处理步骤包括：将纤维素溶解于离子液体中，置于100~120℃下磁力搅拌溶解5~7h后静置12~16h，得到离子液体/纤维素混合溶液；然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球用去离子水冲洗后自然晾干，得到离子液体再生纤维素载体。

作为本发明的优选，纤维素和离子液体的投加质量比为（10~15）：100。

作为本发明的优选，所述离子液体选用[BMIM]Cl、[C4MIM]Cl中的一种。

本发明的有益效果：

1.本申请通过还原性谷胱甘肽刺激酶活性，不仅能够提高酶活，从而能够提高γ-氨基丁酸的收率，还能提高生产得到的γ-氨基丁酸的使用效果。

2.本申请通过离子液体预处理后的再生纤维素作为固定酶载体，具有固定化率高、易回收、易生物降解、绿色环保的优点。

3.本申请通过填充反应柱连续制备γ-氨基丁酸，制备速度快。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施方式，并对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺，包括以下步骤：

（1）制备固定化谷氨酸脱羧酶：

a.制备离子液体再生纤维素载体，将1.2g纤维素溶解于10g [BMIM]Cl离子液体中，置于110℃下磁力搅拌溶解6h后静置15h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到载体。

b. 将1.5g海藻糖、0.3g普鲁兰多糖和10mL浓度为1.5mg/mL的氧化石墨烯混合后高速匀浆得到热稳定剂，并加入到10mL、5mg/mL谷氨酸脱羧酶液中得到热稳定处理后的酶液。

c.向热稳定处理后的酶液中加入5mg还原型谷胱甘肽，搅拌均匀，得到活性处理后的酶液。

d. 取0.18g改性的载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于28℃水浴震荡5h，然后取出载体、并用去离子冲洗，以液氮于-80℃下冷冻干燥20h，得到固定化谷氨酸脱羧酶。

（2）将0.1g固定化谷氨酸脱羧酶填充于反应柱中，在38℃下，使得浓度为1.5%的谷氨酸溶液以1.2V柱体积/h的流速流经反应柱，将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。

分别连续反应0h、20h后，取出载体测定酶活；于反应20h后取反应柱流出液，通过比色法测定、计算谷氨酸转化率，检测结果如下表1。

实施例2

一种固定化酶制备γ-氨基丁酸的工艺，包括以下步骤：

（1）制备固定化谷氨酸脱羧酶：

a.制备离子液体再生纤维素载体，将1g纤维素溶解于10g [C4MIM]Cl离子液体中，置于100℃下磁力搅拌溶解5h后静置12h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到载体。

将上述得到的载体取0.5g加入到50mL浓度为0.5mol/L高碘酸钠溶液中，置于30℃恒温下反应90min。改性结束后取出载体，直接以液氮于-85℃下冷冻干燥18h，得到高碘酸钠改性的载体。

b. 将5g海藻糖、1g普鲁兰多糖和10mL浓度为2mg/mL的氧化石墨烯混合后高速匀浆得到热稳定剂，并加入到10mL、4mg/mL谷氨酸脱羧酶液中得到热稳定处理后的酶液。

c.向热稳定处理后的酶液中加入3mg还原型谷胱甘肽，搅拌均匀，得到活性处理后的酶液。

d. 取0.16g改性的载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于25℃水浴震荡12h，然后取出载体、并用去离子冲洗，以液氮于-85℃下冷冻干燥18h，得到固定化谷氨酸脱羧酶。

（2）将0.1g固定化谷氨酸脱羧酶填充于反应柱中，在35℃下，使得浓度为1%的谷氨酸溶液以1.1V柱体积/h的流速流经反应柱，将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。

分别连续反应0h、20h后，取出载体测定酶活；于反应20h后取反应柱流出液，通过比色法测定、计算谷氨酸转化率，检测结果如下表1。

实施例3

（1）制备固定化谷氨酸脱羧酶：

a.制备离子液体再生纤维素载体，将1.5g纤维素溶解于10g[BMIM]Cl离子液体中，置于120℃下磁力搅拌溶解7h后静置16h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到载体。

将上述得到的载体取0.5g加入到 50mL浓度为1mol/L高碘酸钠溶液中，置于35℃恒温下反应120min。改性结束后取出载体，直接以液氮于-75℃下冷冻干燥24h，得到高碘酸钠改性的载体。

b. 将3g海藻糖、1g普鲁兰多糖和10mL浓度为1.7mg/mL的氧化石墨烯混合后高速匀浆得到热稳定剂，并加入到10mL、7mg/mL谷氨酸脱羧酶液中得到热稳定处理后的酶液。

c.向热稳定处理后的酶液中加入8mg 还原型谷胱甘肽，搅拌均匀，得到活性处理后的酶液。

d. 取0.233g载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于30℃水浴震荡16h，然后取出载体、并用去离子冲洗，以液氮于-75℃下冷冻干燥24h，得到固定化谷氨酸脱羧酶。

（2）取0.1g固定化谷氨酸脱羧酶填充于反应柱中，在40℃下，使得浓度为2%的谷氨酸溶液以1.3V柱体积/h的流速流经反应柱，将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。

分别连续反应0h、20h后，取出载体测定酶活；于反应20h后取反应柱流出液，通过比色法测定、计算谷氨酸转化率，检测结果如下表1。

实施例4

（1）制备固定化谷氨酸脱羧酶：

a.制备离子液体再生纤维素载体，将1.1g纤维素溶解于10g [C4MIM]Cl离子液体中，置于115℃下磁力搅拌溶解5.5h后静置13h，得到离子液体/纤维素混合溶液。然后将离子液体/纤维素混合溶液用注射器滴加至去离子水中，使得离子液体/纤维素混合溶液再生成小球；将小球浸泡在去离子水中48h，期间多次换水，然后用去离子水冲洗后自然晾干，得到载体。

将上述得到的载体取0.5g加入到50mL浓度为1mol/L高碘酸钠溶液中，置于30℃恒温下反应100min。改性结束后取出载体，直接以液氮于-75℃下冷冻干燥22h，得到高碘酸钠改性的载体。

b. 将2g海藻糖、0.5g普鲁兰多糖和10mL浓度为1.6mg/mL的氧化石墨烯混合后高速匀浆得到热稳定剂，并加入到10mL、6mg/mL谷氨酸脱羧酶液中得到热稳定处理后的酶液。

c.向热稳定处理后的酶液中加入6mg还原型谷胱甘肽，搅拌均匀，得到活性处理后的酶液。

d. 取0.2g改性的载体加入到上述10mL活性处理后的酶液中，密封、并置于29℃水浴震荡14h，然后取出载体、并用去离子冲洗，以液氮于-80℃下冷冻干燥23h，得到固定化谷氨酸脱羧酶。

（2）取0.1g固定化谷氨酸脱羧酶和100mL浓度为1.2%的谷氨酸溶液混合，置于37℃恒温下反应，将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。

分别连续反应0h、20h后，取出载体测定酶活；于反应20h后取剩余液体，通过比色法测定、计算谷氨酸转化率，检测结果如下表1。

表1.

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。