阅读说明：本技术 富硒魔芋低聚糖及其制备方法 (Selenium-rich konjac oligosaccharide and preparation method thereof ) 是由 李利军 卢美欢 马英辉 仝泽方 于 2020-05-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及富硒魔芋低聚糖的制备方法,步骤为：对产葡甘聚糖酶菌种进行斜面培养；将斜面菌种孢子接入产酶液体发酵培养基中继续培养；过滤,收集滤液即得葡甘聚糖酶粗液；与蒸馏水混合再加入魔芋精粉后,溶解加热恒温酶解,得葡甘低聚糖混合液；将酵母斜面菌种接入含有魔芋低聚糖混合液和亚硒酸钠溶液的培养基中,培养得到富硒魔芋低聚糖溶液；喷雾干燥,降低含水率,获得富硒魔芋低聚糖粉剂。本发明自制高活性葡甘聚糖酶,快速有效的将魔芋精粉分解为魔芋低聚糖；制备方法安全,无污染；得到的产品既解决了不可控酶解产生的单糖残留问题,又通过微生物法将毒性较大的无机硒转化为安全的有机硒,进一步强化了魔芋低聚糖和硒的活性。(The invention relates to a preparation method of selenium-rich konjac oligosaccharides, which comprises the following steps: carrying out slant culture on the strain producing the glucomannanase; inoculating the slant strain spores into an enzyme-producing liquid fermentation culture medium for continuous culture; filtering, and collecting filtrate to obtain crude glucomannanase solution; mixing with distilled water, adding rhizoma Amorphophalli refined powder, dissolving, heating, and performing enzymolysis at constant temperature to obtain mixed solution of glucomannooligosaccharide; inoculating yeast slant strain into culture medium containing rhizoma Amorphophalli oligosaccharide mixed solution and sodium selenite solution, and culturing to obtain selenium-rich rhizoma Amorphophalli oligosaccharide solution; spray drying, and reducing water content to obtain selenium-rich konjac oligosaccharide powder. The invention self-prepares high-activity glucomannanase, decompose konjak refined powder into konjak oligose fast and effectively; the preparation method is safe and pollution-free; the obtained product not only solves the problem of monosaccharide residue generated by uncontrollable enzymolysis, but also converts inorganic selenium with high toxicity into safe organic selenium by a microbiological method, and further enhances the activity of konjac oligosaccharide and selenium.)

富硒魔芋低聚糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物工程技术领域，具体涉及一种富硒魔芋低聚糖及其制备方法。

背景技术

魔芋又名蒟蒻、鬼芋，属于天南星科（Araceae）魔芋属（Amorphophallus）多年生草本植物，在中国有2000多年的栽培史。魔芋的主要活性成分葡甘聚糖是已知植物胶中粘度最大的天然高分子多糖，它是由β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1:1.6或1:1.69的摩尔比，以β-1,4吡喃糖苷键结合构成的复合天然高分子多糖。魔芋葡甘聚糖由于其独特的分子结构，具有良好的保水性、胶凝性、增稠性等，被广泛应用于食品、医药、化工、石油钻探、环保、高分子材料等领域。将葡甘聚糖降解成低聚糖，可促进双歧杆菌生长，是肠道菌群的益生因子；具有低能量或零能量，适合特殊人群使用；可提高机体抗氧化能力；具有降血糖作用，也是糖尿病患者理想的功能性甜味剂。

硒是生命活动的必须微量元素，它和许多疾病的发生有密切联系。早在20世纪90年代，我国营养学会就把硒列入了每日膳食营养的15种营养之一。每日补硒可显著提高人体免疫力，对肝病、冠心病、癌症有显著作用，并具有抗衰老、抗疲劳、保护视力等功效。中国营养学会推荐每人每日应补充膳食硒50～250 µg。目前补硒来源主要是无机化合物亚硒酸钠等，但无机硒吸收率低、毒性高，容易污染环境，并对动物存在潜在的危害。而有机硒具有安全、稳定性好、易吸收、污染少的优点。酵母可通过富集硒在细胞内将无机硒转化为有机硒，是补硒的最佳来源，具有很好的保健作用。

魔芋低聚糖常用酶解法制备，由于酶解反应的不可控，获得的酶解产物是单糖和寡聚糖的混合物，单糖的存在影响魔芋低聚糖的功能价值，特别是不能用于特殊人群的使用，如糖尿病人等，使得应用范围和价值大大降低。目前常用的单糖分离技术有膜过滤和微生物发酵法。膜过滤是常用分离手段，能有效将单糖和分子量较大的聚糖分离开，但由于魔芋葡甘聚糖黏度非常大，即使酶解后仍有一定的黏度，使得膜的耗损较大，效率下降。根据酵母可以利用单糖，无法利用寡糖的特点，可以有效将混合物中的单糖选择性去除。

发明内容

本发明的目的是提供一种富硒魔芋低聚糖及其制备方法，在酶解混合物中加入无机硒，通过酵母发酵将混合物中单糖去除的同时，将无机硒转化为有机硒，进一步增强魔芋低聚糖的功能活性。

本发明所采用的技术方案为：

富硒魔芋低聚糖的制备方法，其特征在于：

所述方法包括以下步骤：

步骤一：菌种培养：

将产葡甘聚糖酶菌种转接至斜面培养基活化，得到斜面菌种；

步骤二：产酶液体发酵：

将斜面菌种孢子接入产酶液体发酵培养基中继续培养；

步骤三：酶液收集：

培养好的产酶液体发酵培养基用纱布过滤，收集滤液即得葡甘聚糖酶粗液；

步骤四：酶解反应：

将葡甘聚糖酶粗液与蒸馏水混合，加入魔芋精粉后，溶解加热酶解，酶解结束后，加热灭酶活，即得魔芋低聚糖混合液；

步骤五：酵母培养：

将酵母菌转接至斜面培养基活化，得到酵母斜面菌种；

步骤六：富硒发酵培养：

将酵母斜面菌种接入含有魔芋低聚糖混合液和亚硒酸钠溶液的培养基中，培养得到富硒魔芋低聚糖溶液；

步骤七：将富硒魔芋低聚糖溶液进行喷雾干燥，降低含水率，获得富硒魔芋低聚糖粉剂。

步骤一中，产葡甘聚糖酶菌种为黑曲霉。

步骤一中，斜面培养基成分为：魔芋精粉6 g/L，马铃薯浸出汁1000 mL,葡萄糖20g/L，琼脂15 g/L；

菌种转接至斜面培养基活化的条件是30℃培养3 d。

步骤二中：

产酶液体发酵培养基成分为：魔芋精粉6 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨3 g/L，NaNO₃ 3 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO₄•7H₂O 0.01 g/L,水1000 mL，pH 6.0。

步骤四中：

葡甘聚糖酶粗液与蒸馏水按1:（5～9）的质量比混合，魔芋精粉的加入量为混合液质量的10%～50%；

酶解的条件为：置于55～60℃水浴加热酶解4～6h；

灭酶活的条件为：沸水浴加热15min。

步骤五中，所述酵母菌选自酿酒酵母、葡萄酒酵母或假丝酵母。

步骤五中：

斜面培养基成分为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.0；

菌种转接至斜面培养基活化的条件为：30℃培养1d。

步骤六中：

含有魔芋低聚糖混合液和亚硒酸钠溶液的培养基成分为：魔芋低聚糖混合液1000 mL，加入质量体积分数为100 μg/mL的亚硒酸钠溶液0.1～1 mL；

菌种接入培养基的培养条件是：30℃，150 rpm/min培养3d。

步骤七中：

喷雾干燥的条件为：喷雾干燥器入口温度150℃，出口温度高于80℃，雾化转速为16000r/min，喷雾干燥将含水率降至5%以下。

如所述的制备方法制得的富硒魔芋低聚糖。

本发明具有以下优点：

1、本发明采用纯生物法制备，工艺简单安全，成本低，自制高活性葡甘聚糖酶，快速有效的将魔芋葡甘聚糖分解为魔芋低聚糖。

2、制备方法安全，无污染。

3、得到的产品既解决了不可控酶解产生的单糖残留问题，又通过微生物法将毒性较大的无机硒转化为安全的有机硒，达到富硒食品含量要求，进一步强化了魔芋低聚糖和硒的活性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

微生物发酵法是利用微生物无法利用寡糖，只能利用单糖的特性，将混合物中的单糖去除。本发明在此基础上，以天然魔芋精粉为原料，加入自制葡甘聚糖酶，酶解得到魔芋低聚糖，再在魔芋低聚糖溶液中加入一定量的亚硒酸钠，接入富硒酵母培养，酵母分解利用魔芋低聚糖中的单糖，同时将无机硒转化为有机硒，从而制备出不含单糖的富硒魔芋低聚糖。

本发明涉及的富硒魔芋低聚寡糖的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：菌种培养：将产葡甘聚糖酶菌种转接至斜面培养基活化，得到斜面菌种；

所述产葡甘聚糖酶菌种为黑曲霉3324（购自陕西省微生物研究所微生物菌种资源中心）；

所述斜面培养基成分为：魔芋精粉6 g/L，马铃薯浸出汁1000 mL,葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L；

马铃薯浸出汁的获得方法是：200～300 g马铃薯切块煮20 min，纱布过滤后取汁，加水定容至1000 mL；

所述菌种转接至斜面培养基活化的条件是30℃培养3 d。

步骤二：产酶液体发酵：将斜面菌种孢子接入产酶液体发酵培养基中继续培养；

所述产酶液体发酵培养基成分为：魔芋精粉6 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨3 g/L，NaNO₃3 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO₄•7H₂O 0.01 g/L,水1000 mL，pH 6.0。

步骤三：酶液收集：培养好的产酶液体发酵培养基用纱布过滤，收集滤液即得葡甘聚糖酶粗液；

步骤四：酶解反应：将葡甘聚糖酶粗液与蒸馏水混合，加入魔芋精粉后，溶解加热酶解，酶解结束后，加热灭酶活，即得魔芋低聚糖混合液；

所述葡甘聚糖酶粗液与蒸馏水按1:（5～9）的质量比混合，魔芋精粉的加入量为混合液质量的10%～50%；

所述酶解的条件为：置于55～60℃水浴加热酶解4～6h；

所述灭酶活的条件为：沸水浴加热15min。

步骤五：酵母培养：将酵母菌转接至斜面培养基活化，得到酵母斜面菌种；

酵母菌可以是酿酒酵母、葡萄酒酵母或假丝酵母，优选为酿酒酵母。

所述酿酒酵母为保藏编号为CCTCC AY 2013001的酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae Hansen），购自中国典型培养物保藏中心。

所述斜面培养基成分为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，pH 6.0；

所述菌种转接至斜面培养基活化的条件为：30℃培养1 d。

步骤六：富硒发酵培养：将酵母斜面菌种接入含有魔芋低聚糖混合液和亚硒酸钠溶液的培养基中，培养得到富硒魔芋低聚糖溶液；

所述含有魔芋低聚糖混合液和亚硒酸钠溶液的培养基成分为：魔芋低聚糖混合液1000mL，加入质量体积分数为100 μg/mL的亚硒酸钠溶液0.1～1 mL；

所述菌种接入培养基的培养条件是：30℃，150 rpm/min培养3d。

步骤七：将富硒魔芋低聚糖溶液进行喷雾干燥，降低含水率，获得富硒魔芋低聚糖粉剂；

所述喷雾干燥的条件为：喷雾干燥器入口温度150℃，出口温度高于80℃，雾化转速为16000r/min，喷雾干燥将含水率降至5%以下。

实例1：

将魔芋精粉6 g，马铃薯浸出汁1000 mL（200～300g马铃薯切块煮20 min，纱布过滤后取汁，加水定容至1000 mL）,葡萄糖20 g和琼脂15 g加热混合，制成试管斜面培养基，灭菌。将黑曲霉3324 接种到上述斜面培养基中，28℃活化培养3天。每管用10 mL冲洗得到孢子悬浮液。

将魔芋精粉6 g，酵母粉5 g，蛋白胨3 g，NaNO₃ 3 g，MgSO₄•7H₂O 0.5 g,KCl 0.5g，FeSO₄•7H₂O 0.01 g,水1000 mL，混合得到液体培养基，分装至250 mL三角瓶中，灭菌后接入活化后的黑曲霉3324孢子悬浮液，接种比例为1%，28℃培养3天。将培养好的菌液用纱布过滤，收集滤液，即得酶液。

取上述酶液100 mL，加水900 mL，在搅拌下加入85%魔芋精粉100 g，置于55℃恒温水浴维持4小时后，煮沸加热15 min，冷却，得到酶解液。

酵母种子液制备：酵母从斜面培养基中转接至YEPD液体培养基中，30℃下150rmp/min摇床培养1天。

酶解液分装至250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，灭菌后加入100μg/mL的亚硒酸钠0.2mL，按1%接入酵母种子液，30℃，150 rmp/min培养3天，喷雾干燥后得到富硒魔芋低聚糖。测得富硒魔芋低聚糖总硒1.07 mg/kg，无机硒0.01 mg/kg。

实例2：

将魔芋精粉6 g，马铃薯浸出汁1000 mL（200～300g马铃薯切块煮20 min，纱布过滤后取汁，加水定容至1000 mL）,葡萄糖20 g，琼脂15 g，混合后制成试管斜面培养基，灭菌。将黑曲霉3324 接种到上述斜面培养基中，28℃活化培养3天。每管用10 mL冲洗得到孢子悬浮液。将孢子悬浮液接于发酵培养基中，28℃培养3天，得到种子液。

将魔芋精粉42 g，酵母粉35 g，蛋白胨21 g，NaNO₃ 21 g，MgSO₄•7H₂O 3.5 g，KCl3.5 g，FeSO₄•7H₂O 0.07 g,水7 L，混合得到液体培养基，装于10 L发酵罐中，灭菌后接入种子液，接种比例为1%，28℃培养3天。将培养好的菌液离心，收集上清液，即得酶液。

取上述酶液1 L，加水6 L，在搅拌下加入85%魔芋精粉180 g，55℃恒温维持5小时后，煮沸加热15 min，冷却，得到酶解液。

酵母种子液制备：酵母从斜面培养基中转接至YEPD液体培养基中，30℃150 rmp/min摇床培养1天。

在10 L发酵罐中加入上述酶解液，灭菌后加入100 μg/mL的亚硒酸钠1.8 mL，按1%接入酵母种子液，30℃，150 rmp/min培养2天，喷雾干燥后得到富硒魔芋低聚糖。测得富硒魔芋低聚糖总硒 0.516 mg/kg，无机硒未检出。

实例3：

将魔芋精粉6 g，马铃薯浸出汁1000 mL（200～300 g马铃薯切块煮20 min，纱布过滤后取汁，加水定容至1000 mL）,葡萄糖20 g，琼脂15 g，加热混合后制成试管斜面培养基，灭菌。将黑曲霉3324接种到上述斜面培养基中，28℃活化培养3天。每管用10 mL冲洗得到孢子悬浮液。将孢子悬浮液接于发酵培养基中，28℃培养3天，得到种子液。

将魔芋精粉420 g，酵母粉350 g，蛋白胨210 g，NaNO₃ 210 g，MgSO₄•7H₂O 35 g,KCl 35 g，FeSO₄•7H₂O 0.7 g,水70 L，混合得到液体培养基，装于100 L发酵罐中，灭菌后接入种子液，接种比例为1%，28℃培养3天。将培养好的菌液过滤，收集滤液，即得酶液。

取上述酶液10 L置于100 L反应釜中，加水70 L，在搅拌下加入85%魔芋精粉4 kg，55℃恒温维持6小时后，煮沸加热15 min，冷却，得到酶解液。

酵母种子液制备：酵母从斜面培养基中转接至YEPD液体培养基中，30℃150 rmp/min摇床培养1天。

在100 L发酵罐中加入70 L酶解液，灭菌后加入100 μg/mL的亚硒酸钠24 mL，按1%接入酵母种子液，30℃，150 rmp/min培养2天，喷雾干燥后得到富硒魔芋低聚糖。测得富硒魔芋低聚糖总硒 0.308 mg/kg，无机硒未检出。

本发明的葡甘聚糖酶能专一性酶解葡甘聚糖，保证产品纯度；酵母为富硒酵母，能有效将无机硒亚硒酸钠转化为有机硒，保证硒源的安全性；酵母能发酵利用葡甘低聚糖混合液中的单糖，保证了魔芋低聚糖只含寡糖，不含单糖，使产品也适用于糖尿病等特殊病人；将魔芋低聚糖和有机硒的功效叠加，增加了产品的功能活性。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。