阅读说明：本技术 一种寄生性小杆线虫制剂及制备方法和应用 (Parasitic nematode preparation, preparation method and application ) 是由 李星月 张鸿 杨武云 符慧娟 陈鹏 李其勇 易军 陆文壹 于 2020-04-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种寄生性小杆线虫制剂及制备方法和应用,属于生物农药技术领域,解决了现有技术中生防速效性不高的问题,不能高效、快速地杀灭草地贪夜蛾的问题。本发明的寄生性小杆线虫制剂包括：寄生性小杆线虫,干扰草地贪夜蛾的多酚氧化酶PO基因表达的RNA片段；还包括害虫诱食剂基质、线虫保湿剂、线虫共生菌养分。本发明创造性地从引诱、侵染、腐生、加dsRNA抑制害虫免疫反应等多方面入手,共同作用,有效地提高了线虫对草地贪夜蛾的杀灭效果。(The invention discloses a parasitic rhabditis elegans preparation, a preparation method and application, belongs to the technical field of biological pesticides, and solves the problems that in the prior art, the biological control is low in quick-acting performance, and Spodoptera frugiperda cannot be efficiently and quickly killed. The parasitic nematode formulation of the present invention comprises: parasitic nematodes, RNA fragments that interfere with the expression of the polyphenol oxidase PO gene of spodoptera frugiperda; also comprises a pest phagostimulant matrix, a nematode humectant and nematode symbiotic bacteria nutrients. The invention creatively starts from the aspects of induction, infection, saprophytic, inhibition of the immune response of pests by adding dsRNA and the like, and effectively improves the killing effect of the nematodes on spodoptera frugiperda.)

一种寄生性小杆线虫制剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种寄生性小杆线虫制剂及制备方法和应用。

背景技术

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)原生于美洲热带和亚热带地区，是夜蛾科灰翅夜蛾属的一种蛾类农业害虫。草地贪夜蛾幼虫可大量啃食禾本科如水稻、甘蔗和玉米之类细粒禾榖及菊科、十字花科等多种农作物，其发育的速度会随着气温的提升而变快，一年可繁衍数代，一只雌蛾即可产下超过1000颗卵。2016年1月入侵西非地区后，很快蔓延到撒哈拉以南的44个国家。2018年5月草地贪夜蛾侵入印，2018年12月11日从缅甸迁入中国，到2019年10月已扩散至我国26个省(区、市)。草地贪夜蛾入侵后很快进入严重发生阶段，对非洲和亚洲许多国家的玉米等农作物生产造成了重大影响，形成了对国家粮食生产安全的长期性威胁。

现有技术中，对于草地贪夜蛾的防治工作分为采用化学药剂和生物药剂两种方式进行杀灭。目前，主要通过实施以化学防治为主的综合防治策略解决应急防控问题，防止出现因严重为害玉米和小麦等作物而产生粮食安全问题。但是，这样的技术路线防治投入成本高并存在一定的食品安全风险与较高的环境安全风险。由于入侵定殖的草地贪夜蛾已经对有机磷、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯和烟碱类化学杀虫剂产生了很高的抗性，大面积使用酰胺类等为数不多的高防效杀虫剂将很快引起抗药性的产生。一旦草地贪夜蛾对目前防效尚高的几类农药产生抗性，生产上将出现缺乏有效控制措施的被动局面，这将很可能重现上世纪90年代棉铃虫失控的严重后果。为了满足人类对环境和食品安全等方面的日益增长的需求，开发新的害虫治理措施刻不容缓，而大力开发与应用生物农药不仅可以保护天敌，也可以减轻农药的选择压力。

昆虫寄生性线虫与昆虫病原线虫一样，具有“天敌昆虫”兼“病原微生物”双重特点，是一类重要的害虫生物防治因子(对有害生物高效、对非靶标生物及环境安全)，昆虫寄生性线虫作为微生物农药在害虫可持续治理中具有巨大的应用潜力。但对于草地贪夜蛾，采用昆虫寄生性线虫存在生防速效性不高的问题，不能高效、快速地杀灭草地贪夜蛾。因此，利用“生物合理设计”，针对草地贪夜蛾的多酚氧化酶PO的表达基因，利用RNA干扰技术，构建干扰该基因dsRNA并与昆虫寄生性线虫共同使用，可以实现人为抑制昆虫体内PO介导的体液免疫，加快昆虫寄生性线虫侵染草地贪夜蛾的致病进程、提高了害虫生防效率。创制这样的一种制剂，可以利用昆虫寄生性线虫快速、高效、可持续性地杀灭草地贪夜蛾，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种寄生性小杆线虫制剂，其能引诱草地贪夜蛾取食制剂、抑制草地贪夜蛾的免疫反应、加速线虫侵染致死草地贪夜蛾等鳞翅目幼虫、并在其尸体上大量快速繁殖，从而高效、快速地杀灭草地贪夜蛾。

本发明的目的之二在于，提供该寄生性小杆线虫制剂的制备方法。

本发明的目的之三在于，提供该寄生性小杆线虫制剂的应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的一种寄生性小杆线虫制剂，包括：寄生性小杆线虫，干扰草地贪夜蛾的多酚氧化酶PO基因表达的RNA片段。

本发明的技术方案中，所述寄生性小杆科线虫为Oscheius sp.属，从土里自然死亡的蛹期草地贪夜蛾中分离纯化的一种昆虫寄生性小杆科线虫，其能够快速侵染致死草地贪夜蛾等鳞翅目幼虫，并在其尸体上大量快速繁殖。

寄生性小杆科线虫具体的分离纯化操作为：将土里自然死亡的草地贪夜蛾的蛹清水洗净并表面蛹75％酒精消毒，后用采用White trap法收集到蒸馏水中，并挑取单条带卵雌性线虫用大腊螟体液离体繁殖，纯化到单个品种。

本发明的技术方案中，所述RNA片段为dsRNA，其核苷酸序列选自以下三组序列中的任意一组：

A组：正向序列(5'-3')：CCAUGGAGCUGCCCUAUAA；反向序列(5'-3')：UUAUAGGGCAGCUCCAUGG；

B组：正向序列(5'-3')：GGAAACGUUGAUAGGAGAU；反向序列(5'-3')：AUCUCCUAUCAACGUUUCC；

C组：正向序列(5'-3')：CCUUCCUUCUGCCAUAUAU；反向序列(5'-3')：AUAUAUGGCAGAAGGAAGG。

本发明创造性地根据草地贪夜蛾的多酚氧化酶基因序列，设计了干扰该基因表达的小RNA序列(dsRNA)片段。该dsRNA进入草地贪夜蛾中体中，会沉默其多酚氧化酶PO基因，抑制其表达，特异性抑制草地贪夜蛾体内由多酚氧化酶介导的体液免疫，从而提高了线虫寄生致死草地贪夜蛾的速率及防治效果。

作为本发明的一些实施例，每1L制剂中，寄生性小杆线虫的数量为：8,000,000IJs/L～12,000,000IJs/L。其中IJs为侵染期幼虫infective juveniles的英文缩写。

或/和所述RNA片段的用量为：80μg～160μg。

作为优选，所述RNA片段的用量为：100μg～120μg；进一步优选地，为120μg。

作为优选，本发明的一些实施例中，每1L所述制剂还包括害虫诱食剂基质500ml～800ml。

所述害虫诱食剂基质每1L包括大豆粉20g～40g、酵母粉2g～5g、玉米粉40g～60g，抗坏血酸0.2g～0.5g，大豆油1g～3g。

作为优选，本发明的一些实施例中，所述制剂还包括维持线虫生命力的保湿剂，每1L制剂中所述保湿剂包括琼脂粉2g～5g，α,α-海藻糖2g～6g，聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(聚醚)1g～1.5g。

作为优选，本发明的一些实施例中，所述制剂还包括共生菌养分，每1L制剂中所述共生菌养分包括蛋白胨2.5g～5g，牛肉膏2.5g～6g。

本发明所述的一种寄生性小杆线虫制剂的制备方法，包括以下步骤：按比例准备各组份，混匀，即得。

优选地，所述寄生性小杆线虫经草地贪夜蛾的5-6龄期幼虫侵染扩繁后使用；更优选地，将侵染扩繁后的寄生性小杆线虫采用White trap法收集到蒸馏水中，低温储存一段时间后使用；

优选地，按比例称取害虫诱食剂基质、或/和保湿剂、或/和共生菌养分，加入蒸馏水至规定量，密封，灭菌，备用；

优选地，所述RNA片段为人工合成。其中，RNA片段的合成方法为现有技术。

本发明所述RNA片段来源于promega公司的RiboMAXExpressRNAiSystem试剂盒。

本发明所述的一种寄生性小杆线虫制剂在防治草地贪夜蛾中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用食物害虫诱食剂基质能引诱害虫主动接近本发明制剂并主动取食目标dsRNA；采用寄生性小杆线虫，能够快速侵染致死草地贪夜蛾等鳞翅目幼虫，并在其尸体上大量快速繁殖，从而进一步加强杀灭效果；线虫寄生昆虫时候多酚氧化酶PO起最主要的抵御作用(免疫反应)，本发明采用干扰草地贪夜蛾多酚氧化酶PO基因表达的dsRNA，从而抑制其体液免疫发应。本发明创造性地从引诱、加dsRNA抑制免疫发应、侵染、腐生等多方面入手，共同作用，有效地提高了线虫对草地贪夜蛾的杀灭效果。

本发明制备方法简单，操作简便，易于推广应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。

实施例1

本实施例提供了本发明的寄生性小杆线虫制剂的成分含量表及制法，具体见表1。

表1

采用表1中的原料制备本发明的寄生性小杆线虫制剂的制法如下：

步骤1.寄生性小杆线虫的扩繁培养：

寄生性小杆线虫经草地贪夜蛾的5-6龄期幼虫侵染扩繁；繁殖的寄生性小杆线虫三龄幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于4℃冰箱内2周后使用；

步骤2.按比例称取各原料组分：

用静沉法将步骤1收集到的寄生性小杆线虫悬浮液浓缩，加入dsRNA样品，加入蒸馏水补充至1000mL，室温混匀，4℃冰箱内储存，备用。

本实施例中dsRNA的具体序列为：

A组：正向序列(5'-3')如SEQ.ID1所示：CCAUGGAGCUGCCCUAUAA；反向序列(5'-3')如SEQ.ID2所示：UUAUAGGGCAGCUCCAUGG；

B组：正向序列(5'-3')如SEQ.ID3所示：GGAAACGUUGAUAGGAGAU；反向序列(5'-3')如SEQ.ID4所示：AUCUCCUAUCAACGUUUCC；

C组：正向序列(5'-3')如SEQ.ID5所示：CCUUCCUUCUGCCAUAUAU；反向序列(5'-3')如SEQ.ID6所示：AUAUAUGGCAGAAGGAAGG。

实施例2

本实施例提供了本发明的寄生性小杆线虫制剂的成分含量表，具体见表2。

表2

采用表2中的原料制备本发明的寄生性小杆线虫制剂的制法如下：

步骤1.寄生性小杆线虫的扩繁培养：

寄生性小杆线虫经草地贪夜蛾的5-6龄期幼虫侵染扩繁；寄生性小杆线虫三龄幼虫(IJs)采用White trap法收集到蒸馏水中，储存于4℃冰箱内2周后使用；

步骤2.按比例称取害虫诱食剂基质、保湿剂、共生菌养分至同一容器中，加蒸馏水补充至900mL，混匀后装入三角瓶，加盖封口膜后放入高压灭菌锅内，在压力为1.0MPa，温度为121℃条件下，灭菌(融化)20min～40min，得到的产物、冷却后取出备用；

步骤3.用静沉法将步骤1收集到的寄生性小杆线虫悬浮液浓缩至100mL(内含线虫数量不变)，加入dsRNA样品，以及步骤2得到的产物，室温混匀，4℃冰箱内储存，备用。

实施例3

本实施例提供了本发明制剂防治草地贪夜蛾的应用。

具体应用为：

1.室内生物活性测定：

将面积约10cm²玉米叶片表面75％酒精消毒，自然晾干后置于垫有2层滤纸的培养皿(直径9cm)中常规培养。每皿接入草地贪夜蛾5龄幼虫10头。将不同的小杆线虫制剂稀释10倍后加入培养皿滤纸上，每个培养皿加入0.25ml小杆线虫制剂(合稀释制剂2.5ml/皿)，每处理重复3次，以清水处理作为空白对照。分别于接草地贪夜蛾幼虫8h、16h、24h、32h后观察、统计各处理的死亡虫数。

存活率＝(存活数/供试虫数)×100％；校正死亡率＝[(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)]×100％；

实验处理1组：采用实施例1中表1中编号为3所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂A。

实验处理2组：采用实施例1中表1中编号为7所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂B。

实验处理3组：采用实施例1中表1中编号为11所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂C

实验处理4组：采用实施例2中表2中编号为3所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂D。

实验处理5组：采用实施例2中表2中编号为13所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂E。

实验处理6组：采用实施例2中表2中编号为14所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂F。

实施例7组：采用实施例2中表2中编号为15所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂G。

实验处理8组：仅施用寄生性小杆线虫，不施用RNA片段。与实验处理1组的寄生性小杆线虫制剂A相比，不含dsRNA，其余均一致。

空白对照组：清水处理。

结果见表1。

表1

2.田间防治效果测定:

田间防治试验在四川中江县永太镇玉米试验基地中进行，共8个处理，每个处理设置3个重复，共计24个小区，每个小区50m²(10m*5m)小区采用随机区组分布。在玉米小喇叭口期，取寄生性小杆线虫制剂，稀释10倍后用30ml～100ml容量的注射器(无针头)画圈式施入玉米根际范围20cm～30cm直径内，5cm～10cm深度的土壤中，再用表层土覆盖好，并浇入适当的水保湿。这样主要利用草地贪夜蛾的幼虫化蛹特性：幼虫于土壤深处化蛹，深度为2cm～8cm。其中深度会受土壤质地、温度与湿度影响，蛹期为7天～37天。湿度越高化蛹越缓慢，长老熟幼虫的时间，有便于线虫寄生幼虫。寄生性小杆线虫制剂用量是6L/亩～10L/亩(12～20m10倍稀释液l/穴玉米)，每亩玉米浇水约50L～80L(10～16ml/穴玉米)，保持湿度。调查采用5点取样法。每个试验小区调查玉米15株。施药前调查虫口基数，虫龄均以3龄为主，一部分为4～6龄。分别于药后第10天调查玉米新叶受害程度并进行分级。分级标准：0级，新叶未受该虫为害；1级，新叶上有较小为害斑；3级，为害斑点连成片，并出现透明膜；5级，为害已导致新叶出现缺口；7级，为害导致新叶出现较大、较多的缺口；9级，为害已造成新叶断裂。同时剥查、记录样点玉米上的草地贪夜蛾活虫数。计算受害指数、保叶效果和虫口防效。试验期间观察各药剂处理对作物及对非标靶生物的影响。

受害指数＝[Σ(各级受害株数×相对受害级代表值)/(调查总株数×最高级值)]×100

保叶效果(％)＝[(对照区受害指数－处理区受害指数)/对照区受害指数]×100

虫口防效(％)＝[1-(处理区药后活虫数×对照区药前活虫数)/(处理区药前活虫数×对照区药后活虫数)]×100

实验处理1组：采用实施例1中表1中编号为3所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂A。

实验处理2组：采用实施例1中表1中编号为7所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂B。

实验处理3组：采用实施例1中表1中编号为11所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂C

实验处理4组：采用实施例2中表2中编号为3所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂D。

实验处理5组：采用实施例2中表2中编号为13所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂E。

实验处理6组：采用实施例2中表2中编号为14所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂F。

实施例7组：采用实施例2中表2中编号为15所列举原料配比按照实施例1所述步骤制备的寄生性小杆线虫制剂G。

实验处理8组：仅施用寄生性小杆线虫，不施用RNA片段。与实验处理1组的寄生性小杆线虫制剂A相比，不含dsRNA，其余均一致。

空白对照组：清水处理。

结果见表2。

表2

注：本表中字母a、b、c、d、e、f、g、h不相同表示有显著性差异，P＜0.05。

结果显示，本发明的制剂对草地贪夜蛾具有良好的防治效果。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种寄生性小杆线虫制剂及制备方法和应用

<130> 20200320

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccauggagcu gcccuauaa 19

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<211> 19

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 2

uuauagggca gcuccaugg 19

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<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggaaacguug auaggagau 19

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<211> 19

<212> RNA

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<400> 4

aucuccuauc aacguuucc 19

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<212> RNA

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<400> 5

ccuuccuucu gccauauau 19

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<211> 19

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 6

auauauggca gaaggaagg 19