阅读说明：本技术 基于静电纺丝的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架 (Silk fibroin/pancreatic acellular matrix mixed scaffold based on electrostatic spinning ) 是由 朱逸 郭益冰 王东芝 陆玉华 姚曦浩 邱洪权 黄* 李晓红 缪海燕 吴迪 王志伟 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：基于静电纺丝的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架,属于纳米生物医用材料及胰腺组织工程领域；丝素蛋白溶解于六氟异丙醇(HFIP),配制浓度为20％(w/v)的丝素蛋白溶液(溶液A)；胰腺脱细胞基质溶解于HFIP,配制浓度为0.4％(w/v)的胰腺脱细胞基质溶液(溶液B)。将溶液A、B混合制备静电纺丝溶液,通过调整静电纺丝参数：混合液中A和B的比例、电压、接收距离、注射器推进速度等获得纤维尺度近似与在体细胞外基质(ECM)纳米结构的薄膜支架,能够为胶原酶分离提取过程导致的细胞外基质破坏的胰岛提供理想的ECM微环境,促进其存活及功能的发挥。(A silk fibroin/pancreatic acellular matrix mixed scaffold based on electrostatic spinning belongs to the field of nano biomedical materials and pancreatic tissue engineering; dissolving silk fibroin in Hexafluoroisopropanol (HFIP) to prepare a silk fibroin solution (solution A) with the concentration of 20% (w/v); the pancreatic acellular matrix was dissolved in HFIP to prepare a pancreatic acellular matrix solution (solution B) having a concentration of 0.4% (w/v). Mixing the solution A, B to prepare an electrostatic spinning solution, and adjusting electrostatic spinning parameters: the membrane scaffold with the fiber size similar to that of an extracellular matrix (ECM) nanostructure is obtained by the proportion, voltage, receiving distance, injector propulsion speed and the like of A and B in the mixed solution, an ideal ECM microenvironment can be provided for pancreatic islets damaged by the extracellular matrix caused by the collagenase separation and extraction process, and survival and function of the pancreatic islets are promoted.)

基于静电纺丝的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架

技术领域

本发明属于纳米生物医用材料及胰腺组织工程领域，具体为一种可用于通过模拟体内细胞外基质微环境，保护经胶原酶及其他酶应用于分离提取胰岛过程中胰岛功能长期稳定发挥的，基于静电纺丝技术的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架制备方法。

背景技术

糖尿病是一组具有遗传倾向的、由于胰岛素分泌不足或缺陷引起的以血糖升高为特征的代谢病群。根据国际糖尿病联盟(IDF)第8版糖尿病地图集2017年报道，全世界有近5亿人罹患糖尿病，给低收入及中等收入国家和民众造成了较大的经济负担。我国人口众多，随着生活水平的提高和生活方式的多样化，糖尿病发病率及并发症发生率逐年增高。寻找有效、经济的治疗手段，对于健康中国战略的实施和破除因病返贫实现全面小康意义深远。

目前常用的治疗糖尿病的药物主要包括磺脲类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素敏感性增强剂类、胰岛素类。

然而，长期服药病人依从性差、且不可避免的导致各种并发症的发生、且不能精准的进行血糖调控而常常导致低血糖症的发生，因此药物治疗往往为治标之法。最为理想的手段仍为胰岛移植，然而供体来源短缺且分离、提取过程中使用的酶会引起细胞外基质损失和微血管破坏，导致胰岛功能受损或死亡，进一步加剧了供体短缺。因此，在获取胰岛后，保证胰岛稳定存活及功能的持续发挥是提高胰岛移植效率和移植成功的关键性限制条件。近年来，基于水凝胶用于胰岛功能保护的材料取得了较快进展，但是水凝胶材料在结构上并不能很好的模拟天然体内细胞外基质的纳米结构，而静电纺丝技术可生产与体内细胞外基质微环境相近的纳米结构纤维，且操作方便，可规模化量产。天然聚合物、合成聚合物和脱细胞基质都可单独或混合用于静电纺丝制备。天然聚合物与合成聚合物组成单一，即使通过多元复合仍然不能高仿真的模拟细胞外基质的生理组成。而特定组织器官的细胞外基质具有相对应细胞生长、增殖、分化等功能发挥的最佳组成、结构和理化性能。因此，本发明专利结合了丝素蛋白提供理想的力学支撑，同时结合胰岛在体微环境组成——胰腺特异性细胞外基质，形成性能稳定、实现高仿真的胰岛微环境构建，为胰岛功能的长期、稳定发挥及临床应用效率提高，产生积极的促进作用。天然生物材料与特异性脱细胞基质相结合通过优势叠加、缺点互补，成功开发出一种新型的仿胰岛细胞细胞外基质成分和结构的静电纺丝复合支架产品，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明主要是解决上述现有技术所存在的技术问题，提供基于静电纺丝的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：基于静电纺丝技术的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架，所述混合支架由胰腺脱细胞基质与丝素蛋白二元复合而成。

作为优选，所述混合支架的制备方法为：

步骤1、蚕丝经Na₂CO₃溶液脱除丝胶，溶于EtOH-CaCl₂-H₂O三元混合溶液中，后装载于截留分子量为8-14kD的透析袋，用电导率低于0.8μs/cm的去离子水透析3天，冷冻干燥，称取一定质量溶解于六氟异丙醇中制备成溶液A；

步骤2、经1％TritonX-100/0.1％氨水对新鲜猪胰腺进行振荡脱细胞，PBS溶液洗涤去除残余溶剂，冷冻干燥，液氮研磨成粉，称取一定质量溶解于六氟异丙醇中制备成溶液B；

步骤3、将上述溶液A和溶液B按照一定比例混合，制备获得静电纺丝液。

作为优选，所述溶液A与溶液B的混合比例为60：1～20：1(w/w)，最佳混合比例为30：1。

作为优选，所述静电纺丝液制备过程参数特征由如下方法制备得到：将溶液A和溶液B混合，混合后的溶液A和溶液B加入到通过注射泵控制的微量注射器中，设定高压发生器电压为15～25Kv，最佳为25Kv，收集距离为10～20cm，最佳为15cm，给液速率为1～7ml/h，最佳为4ml/h，用粘在锡箔纸上的小圆玻片接收获得纳米尺度的纤维，然后将小圆玻片置于无水乙醇中处理使其发生β折叠，最后置于空气中自然干燥后待用。

作为优选，所述混合支架能作为胰岛功能保护、胰腺类器官构建中生物纳米材料的理想来源。

本发明具有的有益效果：

(1)本发明制备的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架具有高仿真胰岛细胞细胞外基质成分及结构，制备方法简单、可即用即纺、耗时短、成本低，可为有限来源的胰岛供体的应用发挥最大的价值，具有较好的临床转化应用前景。

(2)所制备混合支架能显著提高胰岛细胞存活和促进其功能发挥。

附图说明

图1是丝素支架和混合支架的一种纳米纤维结构图；

图2是本发明的一种活死细胞染色对照图；

图3是本发明葡萄糖刺激的胰岛素释放实验的一种实验对比图。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：基于静电纺丝的丝素蛋白/胰腺脱细胞基质混合支架，所述混合支架由胰腺脱细胞基质与丝素蛋白二元复合而成。

所述混合支架的制备方法为：

步骤1、蚕丝经Na₂CO₃溶液脱除丝胶，溶于EtOH-CaCl₂-H₂O三元混合溶液中，后装载于截留分子量为8-14kD的透析袋，用电导率低于0.8μs/cm的去离子水透析3天，冷冻干燥，称取一定质量溶解于六氟异丙醇中制备成溶液A；

步骤2、经1％TritonX-100/0.1％氨水对新鲜猪胰腺进行振荡脱细胞，PBS溶液洗涤去除残余溶剂，冷冻干燥，液氮研磨成粉，称取一定质量溶解于六氟异丙醇中制备成溶液B；

步骤3、将上述溶液A和溶液B按照一定比例混合，制备获得静电纺丝液。

所述溶液A与溶液B的混合比例为60：1～20：1(w/w)，最佳混合比例为30：1。

所述静电纺丝液制备过程参数特征由如下方法制备得到：将溶液A和溶液B混合，混合后的溶液A和溶液B加入到通过注射泵控制的微量注射器中，设定高压发生器电压为15～25Kv，最佳为25Kv，收集距离为10～20cm，最佳为15cm，给液速率为1～7ml/h，最佳为4ml/h，用粘在锡箔纸上的小圆玻片接收获得纳米尺度的纤维，然后将小圆玻片置于无水乙醇中处理使其发生β折叠，最后置于空气中自然干燥后待用。

所述混合支架能作为胰岛功能保护、胰腺类器官构建中生物纳米材料的理想来源。

具体步骤如下：

(1)胰腺脱细胞基质与丝素蛋白混合支架的制备

蚕丝经Na₂CO₃溶液脱除丝胶，溶于EtOH-CaCl₂-H₂O三元溶液中，装载于截留分子量为8-14kD的透析袋，用电导率低于0.8μs/cm的去离子水透析3d，冷冻干燥，称取一定质量溶解于六氟异丙醇(HFIP)中制备成溶液A。将新鲜猪胰腺切成2*2*2的颗粒大小，经1％TritonX-100/0.1％氨水对新鲜猪胰腺进行振荡脱细胞，PBS溶液洗涤去除残余溶剂，冷冻干燥，液氮研磨成粉,称取一定质量溶解于六氟异丙醇(HFIP)中制备成溶液B。将混合物溶液加入到通过注射泵控制的静电纺丝注射器中，设定高压发生器电压为25Kv，收集距离为15cm，推速为4ml/h。用粘在锡箔纸上的小圆玻片接收纤维，获得纳米尺度的纤维，然后将小圆玻片放入无水乙醇中处理使其发生β折叠，置于空气中自然干燥后待用。

(2)扫描电镜下观察纺丝纤维

检测结果如下：

如图1所示，扫描电镜：支架纤维通过喷金处理，利用扫描电镜(日本日立S-3400N)对纤维表面形态进行观察并通过Image J软件对50根纤维直径进行统计。

扫面电镜结果及两种支架的直径统计结果表明，丝素支架与混合支架均具有纳米纤维结构，说明胰腺脱细胞基质粉末的加入并没有非常大的改变支架的直径。

(3)活死细胞染色

检测结果如下：

如图2所示，活死细胞染色：将分离提取的胰岛种植于混合支架上培养36h，后吸去培养基。然后以1：1(v/v)的比例添加基础培养基和配好的活死细胞染色剂。培养箱内避光孵育30min。最后在荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

活死细胞染色显示，对照组中有大量的死细胞，而丝素支架和混合支架中几乎没有死细胞，表明两种纳米纤维支架均改善了分离提取后胰岛细胞的存活。

(4)葡萄糖刺激的胰岛素释放实验

检测结果如下：

如图3所示，葡萄糖刺激的胰岛素释放实验：每组种10个直径约为150μm的胰岛，培养36h后用PBS洗涤3次。加入KRB缓冲液孵育2h。吸去KRB缓冲液后加入2.8mM的利用KRB缓冲液的配制的葡萄糖溶液并孵育30min；收集缓冲液，再加入28mM浓度的溶液孵育30min。同样收集缓冲液。最后利用胰岛素Elisa试剂盒测定胰岛素释放。

葡萄糖刺激的胰岛素释放实验表明，在低糖刺激下(2.8mM)，两种支架组与对照组没有差异，但在高糖刺激下(28mM)，混合支架具有更好的促进胰岛细胞胰岛素的释放能力，说明混合支架能改善分离提取后胰岛细胞的葡萄糖响应能力。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明不限于上述实施例，还可以有许多变形。凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均应认为属于本发明的保护范围。