阅读说明：本技术 CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用 (CRISPR/RfxCas13d plant RNA virus resistant vector and construction method and application thereof ) 是由 李方方 曹永森 周雪平 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用,包括pCambia1300-RfxCas13d重组载体,构成如下：CaMV 35S启动子,潮霉素基因,CaMV poly(A)信号终止子,pVS1 RepA,pVS1复制起点,CaMV 35S启动子,RfxCas13d基因,NOS终止子；其中,RfxCas13d基因序列如SEQ ID No.1所示,NOS终止子序列如SEQ ID No.2所示。本发明利用带有GFP荧光标签的芜菁花叶病毒(TuMV-GFP)侵染性克隆来指示RNA病毒自然侵害植物,利用RfxCas13d蛋白和sgRNA结合可以定向特定位置切割RNA。本发明构建的载体能够有效抑制TuMV的侵染,为植物病毒病的防控提供新的策略,具有重要的生产意义。(The invention discloses a CRISPR/RfxCas13d plant RNA virus-resistant vector, a construction method and application thereof, wherein the CRISPR/RfxCas13d plant RNA virus-resistant vector comprises a pCambia1300-RfxCas13d recombinant vector, and comprises the following components: CaMV 35S promoter, hygromycin gene, CaMV poly (a) signal terminator, pVS1 RepA, pVS1 origin of replication, CaMV 35S promoter, RfxCas13d gene, NOS terminator; wherein, the RfxCas13d gene sequence is shown in SEQ ID No.1, and the NOS terminator sequence is shown in SEQ ID No. 2. The invention utilizes turnip mosaic virus (TuMV-GFP) infectious clone with a GFP fluorescent label to indicate that RNA viruses naturally invade plants, and utilizes the combination of RfxCas13d protein and sgRNA to directionally cut RNA at a specific position. The vector constructed by the invention can effectively inhibit TuMV infection, provides a new strategy for preventing and controlling plant virus diseases, and has important production significance.)

CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高效定点编辑的CRISPR/RfxCas13d抗植物病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

基因组定点编辑技术是一种有效高质技术手段，可以用于植物功能基因组研究和作物分子遗传育种。基因组编辑技术主要通过以下三种人工内切核酸酶分别为：锌指核酸酶ZFNs、类转录激活因子效应物核酸酶TALENs和基于CRISPR/Cas系统的由RNA引导的内切酶。针对DNA的基因编辑过程是在基因组靶位点处产生双链DNA断裂(DSBs)，DSBs可以通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)进行修复。在CRISPR-Cas系统的RNA引导内切核酸酶系统中的内切核酸酶，如SpCas9和LbCpf1，已被证明是用于植物基因编辑和调控的多功能工具酶。RNA基因编辑是近些年在发现新型Cas蛋白(主要是Cas13蛋白)发展起来的。RNA一旦被切割之后，直接被降解。

在自然界中，植物病毒侵染植物的现象相当普遍。植物病毒可以感染许多重要的农作物，是影响农业生产的重要因素之一。植物病毒在世界各地广泛分布，除一小部分是DNA病毒外，大部分的植物病毒基因组是单链RNA(ssRNA)病毒。其中，芜菁花叶病毒(Turnipmosaic virus,TuMV)是单链、正义的植物RNA病毒，属于马铃薯Y病毒科病毒。TuMV能够侵染十子花科多种蔬菜作物与油料作物，是我国及世界农业生产上重要的病原物。目前，无有效的手段防治TuMV的侵染。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用。

本发明利用基因编辑技术直接靶向TuMV的RNA序列，导致目标RNA的切割和降解，实现抗病毒应用。本发明使用了来自Ruminococcus flavefaciens菌株strain XPD3002的细菌蛋白RfxCas13d蛋白，开发了基于RfxCas13d系统的CRISPR植物基因组编辑工具。这种工具可以更高效切割RNA、更广泛地识别特异基因组序列，是一种高效地抗植物RNA病毒的工具。

一种CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体，包括pCambia1300-RfxCas13d重组载体，构成如下：CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，CaMV 35S启动子，RfxCas13d基因，NOS终止子；

其中，RfxCas13d基因序列如SEQ ID No.1所示，NOS终止子序列如SEQ ID No.2所示；RfxCas13d编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

pCambia1300-RfxCas13d重组载体的构建方法具体为，人工合成3003bp的RfxCas13d基因片段，并将其克隆至pUC57上，命名为pUC57：RfxCas13d；利用BamHI和NcoI对质粒pUC57：RfxCas13d和pCambia1300-spCas9进行双酶切，分别回收3003bp RfxCas13d基因片段和约10kb的pCambia1300载体骨架，利用T4 DNA连接酶将3003bp的RfxCas13d片段连接至pCambia1300载体骨架，质粒命名为pCambia-RfxCas13d；质粒测序后保存，验证成功后转农杆菌保存。

质粒pCambia1300-RfxCas13d-crRNA的构成如下：CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，CaMV 35S启动子，RfxCas13d基因，NOS终止子，AtU6启动子，crRNA重复前导序列，含有两个BsaI酶切位点的spacer核苷酸序列，(T)8终止序列。

pCambia1300-RfxCas13d-crRNA重组载体的构建方法具体为，人工合成377bp的AtU6-crRNA基因片段，如SEQ ID No.4所示，并将其克隆至pUC57上，命名为pUC57：AtU6-crRNA；首先用HindIII和SbfI对pUC57：AtU6-crRNA和pCambia1300-RfxCas13d进行双酶切，分别回收377bp的片段和12.5kb的线性化载体骨架，利用T4 DNA连接酶将3003bp的crRNA片段连接至pCambia1300-RfxCas13d，命名为pCambia1300-RfxCas13d-crRNA。

CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体的应用，pCambia1300-RfxCas13d-crRNA根据目标进行设计靶标。以crGFP为例，引物crGFP-F1(如SEQ ID No.5所示)与crGFP-R1(如SEQ ID No.6所示)磷酸化后退火连接到pCambia1300-RfxCas13d-crRNA，命名为pCambia1300-RfxCas13d-crGFP。

CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体在用于将本氏烟基因组，和/或植物RNA病毒基因组中的内源基因沉默，RNA病毒外源RNA沉默中的至少一种的应用。

进一步的，CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体在抵抗芜菁花叶病毒中的应用。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

TuMV是严重危害农业生产的病原物，目前无有效的防治手段。本发明利用侵染性克隆TuMV-GFP来指示RNA病毒自然侵害植物，利用RfxCas13d蛋白和sgRNA表达载体能够结合并切割特定位置的病毒RNA。本发明所构建的载体能够有效抑制TuMV的侵染，为植物病毒病的防控提供新的策略，具有重要的生产意义。

本发明构建出的重组载体pCambia1300-RfxCas13d具有以下特征和优势：

(1)细菌蛋白RfxCas13d不会影响植物正常生理活动；

(2)能够表达出特异的Cas13d蛋白与sgRNA结合，可用于切割某些特定的RNA上的序列，实现精准打靶；

(3)Cas13d可以切割RNA，因而不仅仅是植物内源产生的mRNA还是病毒基因组RNA都能实现定点切割。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用作进一步说明。

附图说明

图1为pCambia1300-RfxCas13d(Cas13d)的载体示意图。

图2为pCambia1300-RfxCas13d-crRNA(Cas13d-crRNA)的载体示意图。

图3为TuMV-GFP侵染性克隆的病毒基因组，其中深灰色框为绿色荧光蛋白GFP。

图4为利用pCambia1300-RfxCas13d-crGFP进行抑制TuMV-GFP的侵染与TuMV衣壳蛋白(CP)蛋白积累量的分析。

(A)共接种TuMV-GFP侵染性克隆与pCambia1300-RfxCas13d-crGFP(简称Cas13d-crGFP，下同)或与Cas13d到本氏烟植物上，使用手提式紫外灯拍摄接种本氏烟植物10天后的照片。

(B)利用Western blot分析Cas13d-crGFP相比Cas13d对TuMV中CP蛋白积累量的分析情况，丽春红染色的Rubisco大亚基作为上样对照，表明Cas13d-crGFP能够有效降低TuMV中CP的积累量。

具体实施方式

实施例1CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体的构建

构建载体的技术路线如下：

1、pCambia1300-RfxCas13d重组质粒构建

人工合成3003bp的RfxCas13d基因片段，并将其克隆至pUC57上，命名为pUC57：RfxCas13d(生工生物工程(上海)股份有限公司)。利用BamHI和NcoI对质粒pUC57：RfxCas13d和pCambia1300-spCas9(购自杭州百格生物技术有限公司)进行双酶切，分别回收3003bp RfxCas13d基因片段和约10kb的pCambia1300载体骨架，利用T4 DNA连接酶(Thermo Cat#EL0011)将3003bp的RfxCas13d片段连接至pCambia1300载体骨架，质粒命名为pCambia-RfxCas13d。质粒测序后保存，验证成功以后转农杆菌保存。

如图1所示，质粒pCambia1300-RfxCas13d的构成如下：CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，CaMV 35S启动子，RfxCas13d基因(如SEQ ID No.1所示)，NOS终止子(如SEQ ID No.2所示)。其中，RfxCas13d编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2、pCambia1300-RfxCas13d-crRNA重组质粒构建

人工合成377bp的AtU6-crRNA(如SEQ ID No.4所示)基因片段，并将其克隆至pUC57上，命名为pUC57：AtU6-crRNA(生工生物工程(上海)股份有限公司)。首先用HindIII和SbfI对pUC57：AtU6-crRNA和pCambia1300-RfxCas13d进行双酶切，分别回收377bp的片段和12.5kb的线性化载体骨架，利用T4 DNA连接酶(Thermo Cat#EL0011)将3003bp的crRNA片段连接至pCambia1300-RfxCas13d，命名为pCambia1300-RfxCas13d-crRNA。

如图2所示，质粒pCambia1300-RfxCas13d-crRNA的构成如下：CaMV 35S启动子，潮霉素基因，CaMV poly(A)信号终止子，pVS1 RepA，pVS1复制起点，CaMV 35S启动子，RfxCas13d基因，NOS终止子，AtU6启动子，crRNA重复前导序列，含有两个BsaI酶切位点的spacer核苷酸序列，(T)8终止序列。

以crGFP为例，引物crGFP-F1(如SEQ ID No.5所示)与crGFP-R1(如SEQ ID No.6所示)磷酸化后退火连接到pCambia1300-RfxCas13d-crRNA，命名为pCambia1300-RfxCas13d-crGFP。质粒测序后保存，验证成功以后转农杆菌保存。

其中，实施例1中的载体2是在载体1CRISPR/RfxCas13d的系统中加入sgRNA，即在pCambia1300-RfxCas13d载体骨架中加入sgRNA表达框，只有有了sgRNA的指导作用，Cas13d蛋白才能正确识别指定位点RNA发挥功能。

实施例2：利用pCambia1300-RfxCas13d-crGFP能抑制TuMV-GFP的侵染

1、农杆菌植物侵染及接种

(1)活化农杆菌，接种含有pCambia1300-RfxCas13d(简称Cas13d)，pCambia1300-RfxCas13d-crGFP(简称Cas13d-crGFP)，TuMV-GFP质粒的农杆菌菌液培养至OD₆₀₀约为1.5时，4,000rpm离心12min收集菌体，用含终浓度为10mM氯化镁，10mM MES(pH5.6)和100mM乙酰丁香酮的双蒸水溶液(浸润缓冲液)重悬菌体，调整菌液浓度使其OD₆₀₀约为1.0左右，室温下放置3小时。同时注射Cas13d-crGFP与TuMV-GFP农杆菌的侵染性克隆，或Cas13d-crGFP与TuMV-GFP农杆菌的侵染性克隆(图3为TuMV-GFP的载体示意图)，菌液浓度不能过高，OD₆₀₀在0.4至0.6为宜；

(2)注射接种，用1ml的注射器刺到本氏烟叶片背面2-4个小孔，一手按住叶面小孔处，一手用无针头的针管将菌液沿小孔慢慢注入叶片组织空隙处，至整个叶片全部被浸满；

(3)浸润后的植物于25℃温室中培养，光照周期为16/8小时(光照/黑暗)。观察植物症状，确定TuMV-GFP发病情况，手持UV灯下观察，接种对照组Cas13d(非靶标载体对照)与TuMV-GFP的绿色荧光蛋白表达情况。结果如图3所示。

2、紫外灯拍照观察，结果如图4所示。

以上结果说明Cas13d-crGFP能够对TuMV-GFP有效干扰，阻遏RNA病毒的扩增，抑制病毒的侵染和病毒蛋白的积累。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> CRISPR/RfxCas13d抗植物RNA病毒载体及其构建方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3003

<212> DNA

<213> NLS-RfxCas13d-NLS(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctccga aaaaaaaaag gaaggtcgag gcgagcattg agaaaaagaa gagctttgct 60

aaaggtatgg gggttaagag tacattggtg tccggttcca aagtgtatat gactacattt 120

gcggaaggca gcgacgcaag gctggagaaa atagttgaag gcgattcaat aagatcggtg 180

aatgaaggag aagccttctc cgctgaaatg gccgacaaaa atgccggtta taagattggt 240

aacgctaagt tctcgcaccc aaagggttat gcagtcgtgg cgaacaatcc actgtacaca 300

ggtcctgtgc agcaggatat gcttggtttg aaggaaacgt tggaaaagcg gtacttcggt 360

gagtccgctg acggcaatga taatatatgt attcaggtga tacacaacat cctcgatata 420

gaaaaaatcc tcgctgagta cattacaaat gccgcctacg cggtcaataa catatccggt 480

ttggacaaag acatcatagg atttggaaaa ttctctacag tgtacacgta cgatgaattt 540

aaagacccgg agcatcacag agcagctttc aacaacaatg ataagctcat aaatgcaata 600

aaagcgcaat atgatgaatt tgacaacttt cttgataacc cgaggctggg ctattttggt 660

caggctttct tcagcaaaga agggcgcaac tatattataa attacggcaa tgagtgctat 720

gatattttgg cattgttgtc cggactgcgg cattgggttg ttcataataa cgaggaagag 780

agtaggatca gtcgcacatg gctgtataac cttgataaga atctcgataa tgagtatatt 840

tcgactttga actacttgta tgatcgcatt actaacgaac tcaccaacag cttttcgaag 900

aactcggcag ccaacgtgaa ttatatagcg gaaaccttgg ggattaaccc agcagaattc 960

gcagaacagt actttcgctt cagcataatg aaggaacaaa agaacctcgg ttttaacatc 1020

acaaaactca gagaggttat gctggataga aaagacatgt cagaaattcg gaaaaatcat 1080

aaagtgttcg attccatcag gacgaaggtc tacacaatga tggatttcgt catctacaga 1140

tattatattg aggaggatgc aaaagtcgca gcggccaaca aaagcctccc tgacaatgaa 1200

aagtcgctct ctgaaaagga catctttgtc ataaaccttc ggggcagttt taacgatgac 1260

caaaaggacg ccttgtacta cgatgaagca aatcgcatct ggaggaaact tgagaacata 1320

atgcataaca taaaggagtt tcgggggaac aagacgagag aatacaaaaa gaaggacgcg 1380

ccaagacttc ctagaattct cccagcgggg cgcgacgtct cagcgttctc caagctcatg 1440

tacgcgctta ccatgttcct cgatggaaaa gagataaatg atcttttgac tacgctcatt 1500

aacaagttcg acaacattca atctttcctg aaagtgatgc ctctcatagg ggtcaacgca 1560

aagttcgttg aagaatacgc ctttttcaag gactctgcga agatagccga tgaactccgc 1620

ctcataaaga gctttgcgcg gatgggtgaa cctattgctg acgcccggag ggcaatgtat 1680

attgacgcga tcaggattct tggaactaat ctctcctacg acgaacttaa ggctcttgct 1740

gatacctttt ctcttgatga aaacgggaac aaactcaaga agggaaaaca cggtatgcgg 1800

aatttcatca taaataacgt tatttcaaac aagagattcc attacctgat aagatacgga 1860

gatccagccc atctgcacga aatcgcgaaa aacgaggctg ttgttaaatt cgttttgggg 1920

agaatcgctg acatacaaaa aaagcagggg caaaacggga agaaccagat cgaccggtac 1980

tacgaaacct gtatcggtaa ggacaaaggg aagagtgtgt ccgaaaaggt tgacgccctt 2040

acaaaaatca tcaccggtat gaactatgac caattcgaca agaaaagaag tgttatagaa 2100

gatacgggaa gagagaatgc ggagcgggaa aaatttaaaa agatcatatc gctctatctg 2160

accgttatct atcatatcct taaaaacata gtcaacatca acgcacggta cgtgataggc 2220

ttccattgtg tggaacggga cgcccagttg tacaaagaga aaggatacga cataaacctc 2280

aagaagctcg aagagaaggg ttttagctct gttacgaaac tttgtgcggg tatcgatgaa 2340

accgcgcctg acaaacggaa agacgttgaa aaggagatgg cagaacgcgc taaagagtct 2400

atagacagtc ttgagtcagc aaatcccaag ctctacgcga actacataaa atattctgac 2460

gaaaaaaaag ctgaagaatt taccagacaa ataaacagag agaaggctaa gactgcgttg 2520

aatgcctatc tgcggaacac taaatggaat gtcataattc gggaagacct tctgcggatc 2580

gacaataaaa cctgcaccct ctttagaaat aaggctgtcc acctggaagt tgctcgctat 2640

gtgcatgcgt atattaacga cattgctgag gttaacagct actttcagct gtatcattac 2700

atcatgcaga ggattattat gaacgagcgc tacgagaagt cctccgggaa ggtttcagag 2760

tattttgacg cagtcaacga tgagaaaaag tacaacgatc ggctgctgaa actcctgtgt 2820

gtcccattcg ggtattgtat accgcgcttc aagaacctct caatagaggc gctctttgac 2880

cgcaacgagg ccgcaaagtt tgataaagaa aaaaagaaag ttagtgggaa tagtggctca 2940

ggaccaaaga agaaaagaaa ggttgcagcg gcatatccgt acgatgtgcc ggattatgcg 3000

tga 3003

<210> 2

<211> 225

<212> DNA

<213> NOS terminator(Artificial Sequence)

<400> 2

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcg 225

<210> 3

<211> 1000

<212> PRT

<213> NLS-RfxCas13d-NLS(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Ala Ser Ile Glu Lys Lys

1 5 10 15

Lys Ser Phe Ala Lys Gly Met Gly Val Lys Ser Thr Leu Val Ser Gly

20 25 30

Ser Lys Val Tyr Met Thr Thr Phe Ala Glu Gly Ser Asp Ala Arg Leu

35 40 45

Glu Lys Ile Val Glu Gly Asp Ser Ile Arg Ser Val Asn Glu Gly Glu

50 55 60

Ala Phe Ser Ala Glu Met Ala Asp Lys Asn Ala Gly Tyr Lys Ile Gly

65 70 75 80

Asn Ala Lys Phe Ser His Pro Lys Gly Tyr Ala Val Val Ala Asn Asn

85 90 95

Pro Leu Tyr Thr Gly Pro Val Gln Gln Asp Met Leu Gly Leu Lys Glu

100 105 110

Thr Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Gly Glu Ser Ala Asp Gly Asn Asp Asn

115 120 125

Ile Cys Ile Gln Val Ile His Asn Ile Leu Asp Ile Glu Lys Ile Leu

130 135 140

Ala Glu Tyr Ile Thr Asn Ala Ala Tyr Ala Val Asn Asn Ile Ser Gly

145 150 155 160

Leu Asp Lys Asp Ile Ile Gly Phe Gly Lys Phe Ser Thr Val Tyr Thr

165 170 175

Tyr Asp Glu Phe Lys Asp Pro Glu His His Arg Ala Ala Phe Asn Asn

180 185 190

Asn Asp Lys Leu Ile Asn Ala Ile Lys Ala Gln Tyr Asp Glu Phe Asp

195 200 205

Asn Phe Leu Asp Asn Pro Arg Leu Gly Tyr Phe Gly Gln Ala Phe Phe

210 215 220

Ser Lys Glu Gly Arg Asn Tyr Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Glu Cys Tyr

225 230 235 240

Asp Ile Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu Arg His Trp Val Val His Asn

245 250 255

Asn Glu Glu Glu Ser Arg Ile Ser Arg Thr Trp Leu Tyr Asn Leu Asp

260 265 270

Lys Asn Leu Asp Asn Glu Tyr Ile Ser Thr Leu Asn Tyr Leu Tyr Asp

275 280 285

Arg Ile Thr Asn Glu Leu Thr Asn Ser Phe Ser Lys Asn Ser Ala Ala

290 295 300

Asn Val Asn Tyr Ile Ala Glu Thr Leu Gly Ile Asn Pro Ala Glu Phe

305 310 315 320

Ala Glu Gln Tyr Phe Arg Phe Ser Ile Met Lys Glu Gln Lys Asn Leu

325 330 335

Gly Phe Asn Ile Thr Lys Leu Arg Glu Val Met Leu Asp Arg Lys Asp

340 345 350

Met Ser Glu Ile Arg Lys Asn His Lys Val Phe Asp Ser Ile Arg Thr

355 360 365

Lys Val Tyr Thr Met Met Asp Phe Val Ile Tyr Arg Tyr Tyr Ile Glu

370 375 380

Glu Asp Ala Lys Val Ala Ala Ala Asn Lys Ser Leu Pro Asp Asn Glu

385 390 395 400

Lys Ser Leu Ser Glu Lys Asp Ile Phe Val Ile Asn Leu Arg Gly Ser

405 410 415

Phe Asn Asp Asp Gln Lys Asp Ala Leu Tyr Tyr Asp Glu Ala Asn Arg

420 425 430

Ile Trp Arg Lys Leu Glu Asn Ile Met His Asn Ile Lys Glu Phe Arg

435 440 445

Gly Asn Lys Thr Arg Glu Tyr Lys Lys Lys Asp Ala Pro Arg Leu Pro

450 455 460

Arg Ile Leu Pro Ala Gly Arg Asp Val Ser Ala Phe Ser Lys Leu Met

465 470 475 480

Tyr Ala Leu Thr Met Phe Leu Asp Gly Lys Glu Ile Asn Asp Leu Leu

485 490 495

Thr Thr Leu Ile Asn Lys Phe Asp Asn Ile Gln Ser Phe Leu Lys Val

500 505 510

Met Pro Leu Ile Gly Val Asn Ala Lys Phe Val Glu Glu Tyr Ala Phe

515 520 525

Phe Lys Asp Ser Ala Lys Ile Ala Asp Glu Leu Arg Leu Ile Lys Ser

530 535 540

Phe Ala Arg Met Gly Glu Pro Ile Ala Asp Ala Arg Arg Ala Met Tyr

545 550 555 560

Ile Asp Ala Ile Arg Ile Leu Gly Thr Asn Leu Ser Tyr Asp Glu Leu

565 570 575

Lys Ala Leu Ala Asp Thr Phe Ser Leu Asp Glu Asn Gly Asn Lys Leu

580 585 590

Lys Lys Gly Lys His Gly Met Arg Asn Phe Ile Ile Asn Asn Val Ile

595 600 605

Ser Asn Lys Arg Phe His Tyr Leu Ile Arg Tyr Gly Asp Pro Ala His

610 615 620

Leu His Glu Ile Ala Lys Asn Glu Ala Val Val Lys Phe Val Leu Gly

625 630 635 640

Arg Ile Ala Asp Ile Gln Lys Lys Gln Gly Gln Asn Gly Lys Asn Gln

645 650 655

Ile Asp Arg Tyr Tyr Glu Thr Cys Ile Gly Lys Asp Lys Gly Lys Ser

660 665 670

Val Ser Glu Lys Val Asp Ala Leu Thr Lys Ile Ile Thr Gly Met Asn

675 680 685

Tyr Asp Gln Phe Asp Lys Lys Arg Ser Val Ile Glu Asp Thr Gly Arg

690 695 700

Glu Asn Ala Glu Arg Glu Lys Phe Lys Lys Ile Ile Ser Leu Tyr Leu

705 710 715 720

Thr Val Ile Tyr His Ile Leu Lys Asn Ile Val Asn Ile Asn Ala Arg

725 730 735

Tyr Val Ile Gly Phe His Cys Val Glu Arg Asp Ala Gln Leu Tyr Lys

740 745 750

Glu Lys Gly Tyr Asp Ile Asn Leu Lys Lys Leu Glu Glu Lys Gly Phe

755 760 765

Ser Ser Val Thr Lys Leu Cys Ala Gly Ile Asp Glu Thr Ala Pro Asp

770 775 780

Lys Arg Lys Asp Val Glu Lys Glu Met Ala Glu Arg Ala Lys Glu Ser

785 790 795 800

Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ala Asn Pro Lys Leu Tyr Ala Asn Tyr Ile

805 810 815

Lys Tyr Ser Asp Glu Lys Lys Ala Glu Glu Phe Thr Arg Gln Ile Asn

820 825 830

Arg Glu Lys Ala Lys Thr Ala Leu Asn Ala Tyr Leu Arg Asn Thr Lys

835 840 845

Trp Asn Val Ile Ile Arg Glu Asp Leu Leu Arg Ile Asp Asn Lys Thr

850 855 860

Cys Thr Leu Phe Arg Asn Lys Ala Val His Leu Glu Val Ala Arg Tyr

865 870 875 880

Val His Ala Tyr Ile Asn Asp Ile Ala Glu Val Asn Ser Tyr Phe Gln

885 890 895

Leu Tyr His Tyr Ile Met Gln Arg Ile Ile Met Asn Glu Arg Tyr Glu

900 905 910

Lys Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Tyr Phe Asp Ala Val Asn Asp Glu

915 920 925

Lys Lys Tyr Asn Asp Arg Leu Leu Lys Leu Leu Cys Val Pro Phe Gly

930 935 940

Tyr Cys Ile Pro Arg Phe Lys Asn Leu Ser Ile Glu Ala Leu Phe Asp

945 950 955 960

Arg Asn Glu Ala Ala Lys Phe Asp Lys Glu Lys Lys Lys Val Ser Gly

965 970 975

Asn Ser Gly Ser Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Ala Ala Tyr

980 985 990

Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

995 1000

<210> 4

<211> 380

<212> DNA

<213> AtU6-crRNA(Artificial Sequence)

<400> 4

aagcttcatt cggagttttt gtatcttgtt tcatagtttg tcccaggatt agaatgatta 60

ggcatcgaac cttcaagaat ttgattgaat aaaacatctt cattcttaag atatgaagat 120

aatcttcaaa aggcccctgg gaatctgaaa gaagagaagc aggcccattt atatgggaaa 180

gaacaatagt atttcttata taggcccatt taagttgaaa acaatcttca aaagtcccac 240

atcgcttaga taagaaaacg aagctgagtt tatatacagc tagagtcgaa gtagtgattg 300

aacccctacc aactggtcgg ggtttgaaac agagaccaga attcggtctc attttttttt 360

ggatccacta gtcctgcagg 380

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacaacagg tagttttcca gtagtg 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaaacactac tggaaaacta cctgtt 26