来源于新疆野苹果的与植物抗水分胁迫相关蛋白及编码基因的应用
阅读说明：本技术 来源于新疆野苹果的与植物抗水分胁迫相关蛋白及编码基因的应用 (Protein derived from Malus sieversii and related to water stress resistance of plants and application of coding gene ) 是由 李天红 王彦涛 彭翔 申晓帅 李舰 黄学旺 朱圣娇 于 2020-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了来源于新疆野苹果的与植物抗水分胁迫相关蛋白及编码基因的应用。该蛋白质的名称为MsSCL26蛋白,其可为氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质。实验证明,与未转MsSCL26基因的植株相比,MsSCL26过表达转基因植株具有显著的抗水分胁迫性,说明蛋白MsSCL26能够提高植物的抗逆性。(The invention discloses a protein derived from Malus sieversii and related to water stress resistance of plants and application of a coding gene. The protein is named MsSCL26 protein, and can be a protein with an amino acid sequence of SEQ ID No.1 in a sequence table. Experiments prove that compared with plants without transgenic MsSCL26 genes, MsSCL26 overexpression transgenic plants have obvious water stress resistance, and the protein MsSCL26 can improve the stress resistance of plants.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于新疆野苹果的与植物抗水分胁迫相关蛋白及其编码基因的应用。
背景技术
苹果位列世界四大水果之首。截至2017年，我国苹果种植总面积3300万亩、总产量4139万吨，均占世界苹果栽培面积和产量的50％以上，居世界第一(《中国苹果产业发展报告(2017)》)。苹果矮砧集约栽培模式是现代苹果产业发展的方向，在苹果矮砧密植栽培模式的推广过程中，引自国外的矮化砧木普遍存在适应性差、抗逆性弱等问题。干旱胁迫影响果树生长发育，严重时导致树体矮小、早衰，叶片过早脱落，进而造成苹果产量和品质下降。因此，揭示苹果响应干旱胁迫的分子机理，利用现代生物技术挖掘传统乔化砧木资源中的优势抗逆基因，改良、培育出综合抗性强的矮化砧木是目前苹果砧木抗逆育种的主要目标之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性或如何改良苹果的抗旱性或如何培育抗逆性强的苹果砧木。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质的下述任一种应用：
P1、所述蛋白质在调控植物抗逆性中的应用，
P2、所述蛋白质在制备提高植物抗逆性的产品中的应用，
P3、所述蛋白质在培育抗逆性植物中的应用，
P4、所述蛋白质在制备植物抗逆性产品中的应用，
P5、所述蛋白质在植物育种中的应用。
所述蛋白质是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物抗逆或抗水分胁迫相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，序列表中SEQ ID No.1由513个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述应用中的所述抗逆性可为抗水分胁迫和/或抗渗透胁迫和/或抗盐胁迫和/或抗旱胁迫。
上述应用中所述植物为下述任一种：
C1)单子叶植物，
C2)木本植物，
C3)双子叶植物，
C4)蔷薇目植物，
C5)蔷薇科植物，
C6)苹果属植物，
C7)苹果。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述应用中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一种应用：
Q1、所述生物材料在调控植物抗逆性中的应用，
Q2、所述生物材料在制备提高植物抗逆性的产品中的应用，
Q3、所述生物材料在培育抗逆性植物中的应用，
Q4、所述生物材料在制备植物抗逆性产品中的应用，
Q5、所述生物材料在植物育种中的应用；
上述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)编码上述应用中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)降低上述应用中所述蛋白质表达的核酸分子；
B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子具体可为如下b1)b2)或b3)所示的所述蛋白质的编码基因：
b1)编码链的编码序列(ORF)是序列表中SEQ ID No.2的第1-1542位核苷酸的DNA分子；
b2)编码链的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子；
b3)在严格条件下与2)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。
上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述生物材料中，B2)所述的含有核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述应用中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白编码基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
上述应用中，所述植物为下述任一种：
C1)单子叶植物，
C2)木本植物，
C3)双子叶植物，
C4)蔷薇目植物，
C5)蔷薇科植物，
C6)苹果属植物，
C7)苹果。
上文中，所述提高植物抗逆性的产品和所述植物抗逆性产品均可为植物抗逆剂。所述植物抗逆剂可含有所述蛋白质或/和所述生物材料。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗逆植物的方法。
本发明所提供的培育抗逆植物的方法，包括提高目的植物中所述蛋白质或其编码基因的表达量，得到抗逆植物；所述抗逆植物的抗逆性高于所述目的植物的抗逆性。
上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质或其编码基因的表达量可通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。
上述方法中，其中所述蛋白质的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：
1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述蛋白质的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。
上述方法中，所述抗逆植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上文中，所述抗逆性可为抗水分胁迫和/或抗渗透胁迫和/或抗盐胁迫和/或抗旱胁迫，或/和所述目的植物为下述任一种：
C1)双子叶植物或单子叶植物，
C2)木本植物，
C3)双子叶植物，
C4)蔷薇目植物，
C5)蔷薇科植物，
C6)苹果属植物，
C7)苹果。
本发明将来自新疆野苹果中的MsSCL26基因，导入苹果组培苗‘GL-3’中得到过表达MsSCL26基因的转基因植株；与未转化的苹果组培苗‘GL-3’对照植株相比，过表达MsSCL26基因则提高了转基因植株‘GL-3’对水分胁迫等逆境胁迫的耐受性。说明蛋白MsSCL26参与植物对水分胁迫相关逆境胁迫的调控与适应利用该蛋白能够改良苹果抗旱性，对培育抗逆性强的苹果砧木具有重要意义。
附图说明
图1为20％PEG 6000处理下MsSCL26的表达水平变化。
图2为pMDC83-MsSCL26重组质粒酶切验证及转基因植株‘GL-3’的PCR鉴定。左图为pMDC83-MsSCL26重组质粒酶切验证，泳道M为Marker，1号泳道是未经双酶切处理的pMDC83空载体，2和4号泳道是内切酶Pac I/Kpn I酶切后的pMDC83-MsSCL26重组质粒,3号泳道是未经双酶切处理的pMDC83-MsSCL26重组质粒；右图为转基因植株‘GL-3’的PCR鉴定，泳道M为Marker，1-8分别为8个PCR阳性植株。
图3为转基因‘GL-3’株系中SCL26表达水平。
图4为培养基中各株系抗性鉴定及生理指标检测。
图5为土壤中各株系抗旱性鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中使用的表达载体，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、蛋白MsSCL26及编码基因在调控植物抗旱性中的应用
新疆野苹果蛋白MsSCL26的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1；编码蛋白MsSCL26的基因(MsSCL26)的编码链的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。蛋白MsSCL26的基因克隆自新疆野苹果(Malus Sieversii(ledeb.)Roem.)‘新源1号’，由新疆农业大学廖康教授于2007年5月惠赠，本实验室保存，廖康教授邮箱：[email protected]。
一、新疆野苹果MsSCL26基因受水分胁迫诱导表达的分析
首先，采用20％聚乙二醇6000对新疆野苹果组培生根苗进行模拟水分胁迫处理0h、2h、4h、12h、24h，将处理后的植物根、茎、叶用液氮速冻后保存，每个处理三次重复。其次，使用植物RNA提取试剂盒(艾德莱，RN40)提取各组织总RNA，以Oligo d(T)为反转录引物，得到cDNA，并以上游引物F：GGTTGTGAGTTTCGTAGGCG和下游引物R:GCAGAAGAAGGAACAGAAGAGAAA组成的引物，实时荧光定量检测新疆野苹果MsSCL26基因在水分胁迫下的表达变化。结果如图1所示，正常条件下，新疆野苹果MsSCL26主要在根中富集表达，同时在根、茎、叶三种组织的表达水平均受水分胁迫诱导影响。
二、培育抗逆苹果
克隆新疆野苹果的SEQ ID No.2所示的DNA分子构建过表达载体并转化‘GL-3’，验证蛋白MsSCL26及编码基因在调控植物抗旱性的功能，具体方法如下：
1、构建MsSCL26过表达的重组载体
以20％PEG 6000处理24h模拟水分胁迫生长的新疆野苹果叶片为试材，提取叶片的总RNA，反转录为cDNA，然后以cDNA为模板，利用上游引物F:TTAATTAAATGACCCAGTTGCTGTTGAA，和下游引物R:GGTACCGGATTGACAACATCAGATT组成的引物对，进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物含有序列表中的SEQ ID No.2所示的MsSCL26。
通过酶切连接的方式将得到的PCR产物插入PacI/KpnI双酶切处理后的植物表达载体pMDC83(武汉淼灵生物科技有限公司，P2023)，得到重组载体pMDC83-MsSCL26。
经测序确认pMDC83-MsSCL26是将pMDC83的限制性内切酶PacI的识别位点和限制性内切酶KpnI的识别位点之间的片段(小片段)替换为编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2的核苷酸序列所示的双链DNA分子(MsSCL26)，保持pMDC83的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体。
将pMDC83-MsSCL26重组质粒的大肠杆菌扩大培养，使用质粒小提试剂盒(天根，DP103-03)提取重组质粒，取6μl质粒，内切酶PacI/KpnI各1μl，酶切缓冲液2μl，加双蒸水补充至20μl体系，37℃孵育3-4h后，使用琼脂糖凝胶分离条带。结果如图2中左图所示，泳道M为Marker，1和3号泳道是未经双酶切处理的pMDC83空载体和pMDC83-MsSCL26重组质粒，均为单一条带；而2和4号泳道是内切酶Pac I/Kpn I处理后的pMDC83-MsSCL26重组质粒,均含有两个条带，其中小片段条带约长1.5kb为SEQ ID No.2的核苷酸序列所示的基因的双链DNA分子，即目的条带MsSCL26，表明重组载体构建成功。
2、重组菌的获得
将上述pMDC83-MsSCL26导入根癌农杆菌EHA105中，PCR鉴定得到阳性重组菌(导入pMDC83-MsSCL26的重组菌)，进行苹果组培苗‘GL-3’遗传转化。
3、苹果组培苗‘GL-3’遗传转化
采用叶盘法将过表达MsSCL26的重组菌转化苹果组培苗‘GL-3’，具体方法如下：
1)农杆菌侵染液的准备
将步骤2的阳性重组菌加入含有利福平(50ng/L)和卡那霉素(50ng/L)的LB液体培养基，28℃，200rpm，过夜培养。期间检测菌液浓度，在OD600值达到1.2-1.5时，5000rpm，离心10min，收集菌体，重悬于液体MS侵染缓冲液，调整OD600至0.6左右，得到菌体重悬液，备用。
2)苹果组培苗‘GL-3’的准备
选择继代培养(MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L)上生长的在30d内的完全展开的苹果组培苗‘GL-3’(沈阳农业大学张志宏教授惠赠，本实验室保存，GL-3为下述文献第18页中的“GL-3”(Chen K,Song M,Guo Y,Liu L,Xue H,Dai H,Zhang Z.MdMYB46couldenhance salt and osmotic stress tolerance in apple by directly activatingstress-responsive signals.Plant Biotechnol J.2019 17(12):2341-2355.))。幼嫩叶片作为叶盘法的主要材料；
3)苹果组培苗‘GL-3’侵染过程
用灭菌后的手术刀垂直切断叶片主脉，并以叶片大小切2-4次，不要伤及叶缘。将切割后的叶片，放置到重悬菌液中，并不断震荡使叶片充分接触菌液。待15min后，沥干菌液，将叶片远轴端(叶片背面)向下放置到已铺好无菌滤纸的培养基上，并用封口膜封闭培养皿。暗处共培养3-5d。共培养结束后，将褐化严重的叶片剔除，再将状况良好的叶片用无菌水清洗2次，再用液体MS+300mg/L Cef清洗叶片三次，随后沥干水分，将叶背面向下放置于含潮霉素的筛选培养基(MS+6-BA 4mg/L+IBA 0.4mg/L+3mg/L潮霉素)中，用封口膜封闭培养皿。暗培养2-3周(暗培养期间如果农杆菌爆发，要拿出来及时转板并且多加Cef)。暗培养结束后，按照上述步骤换一次培养基。此后每3周换一次培养基(一般3周后就可移去再生)，并将再生芽及时移出至继代培养基(添加潮霉素)(MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IBA0.5mg/L+3mg/L潮霉素)中壮芽生长。将生长至3-4cm的再生芽转移至生根培养基(MS培养基+IBA 0.5mg/L)中培养，20d左右即可生根。一个月之后即可炼苗移出。
4)苹果‘GL-3’阳性植株的鉴定
对在含有潮霉素的培养基中正常生长的苹果‘GL-3’转基因株系，提取其基因组DNA，以MsSCL26-F和MsSCL26-R为引物，进行PCR扩增检测是否得到转入MsSCL26基因的植株，结果得到8个PCR阳性植株(即PCR产物有约1500bp片段的转MsSCL26基因植株，以下简称转MsSCL26基因阳性植株)(图2中右图)。取这8个PCR阳性植株中编号分别为OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的3个PCR阳性植株，分别提取根和叶片的总RNA，反转录为cDNA，利用组成性表达的MdACT基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后以cDNA为模板，以MsSCL26-F和MsSCL26-R为引物进行实时荧光定量检测MsSCL26基因表达水平。以苹果‘GL-3’(野生型植株，又称受体植株)的MsSCL26基因表达水平为1，结果如图3所示，与野生型植株相比，OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8中的MsSCL26的表达量均显著升高，其中叶片的表达水平更明显。说明OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8这三个植株为MsSCL26基因过表达植株。
表1荧光定量引物序列
4、转基因植株的抗水分胁迫性验证
对过表达MsSCL26转基因苹果‘GL-3’组培苗OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8进行200mM盐和300mM甘露醇的水分胁迫处理实验，同时，采用土壤干旱的方式处理过表达MsSCL26转基因苹果‘GL-3’株系进行土壤干旱处理实验。具体方法如下：
水分胁迫处理实验：同时设置两个实验组(200mM NaCl处理组和300mM甘露醇处理组)和对照组(Control)进行平行实验，实验重复三次，每次实验方法如下：
200mM NaCl处理组：将在正常的继代培养基(MS培养基+6-BA 0.5mg/L+IBA0.5mg/L)上生长30d的苹果转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的无根组培苗和非转基因株系即苹果‘GL-3’(野生型植株，又称受体植株，对照组)的无根组培苗，每个株系均3株，分别转移至含有200mM盐的胁迫继代培养基(又称盐胁迫继代培养基，该盐胁迫继代培养基是在上述正常的继代培养基中加入NaCl至NaCl的含量为200mM得到的固体培养基)中，正常培养(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)10d，观察表型变化。并取植株叶片测定植物抗逆性正相关的渗透调节物质脯氨酸含量和作为植物细胞膜损伤指标的丙二醛含量，以及植物抗逆性正相关的降低水分胁迫损伤的抗氧化酶SOD和CAT酶活性。
300mM甘露醇处理组：将在上述正常的继代培养基上生长30d的苹果转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的无根组培苗和非转基因株系即苹果‘GL-3’(野生型植株，又称受体植株，对照组)的无根组培苗，每个株系均3株，分别转移至含有300mM甘露醇的水分胁迫继代培养基(又称干旱胁迫继代培养基，该干旱胁迫继代培养基是在上述正常的继代培养基中加入甘露醇至甘露醇的含量为300mM得到的固体培养基)中，正常培养(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)10d，观察表型变化。并取植株叶片测定植物抗逆性正相关的渗透调节物质脯氨酸含量和作为植物细胞膜损伤指标的丙二醛含量，以及植物抗逆性正相关的降低水分胁迫损伤的抗氧化酶SOD和CAT酶活性。
对照组：将在上述正常的继代培养基上生长30d的苹果转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的无根组培苗和非转基因株系即苹果‘GL-3’(野生型植株，又称受体植株，对照组)的无根组培苗，每个株系均3株，分别转移至上述正常的继代培养基中，正常培养(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)10d，观察表型变化。并取植株叶片测定植物抗逆性正相关的渗透调节物质脯氨酸含量和作为植物细胞膜损伤指标的丙二醛含量，以及植物抗逆性正相关的降低水分胁迫损伤的抗氧化酶SOD和CAT酶活性。
其中，脯氨酸含量测定方法如下：
称取0.5g处理叶片，加入3％磺基水杨酸5ml，加热煮沸15min，冷却后取2ml上清液，加入2ml冰乙酸、3ml 2.5％酸性茚三酮显色液，加热煮沸40min，然后加5ml甲苯，充分振荡，取上清液采用UV-2000型紫外分光光度计测定520nm波长下的吸光度，根据标准曲线计算叶片脯氨酸含量。三次重复。
游离脯氨酸标准曲线(叶片)：y＝0.024x-0.010 R2＝0.997
x：脯氨酸含量(μg)
y：520nm吸光度
叶片脯氨酸含量(μg/g)：
丙二醛含量测定方法如下：
采用硫代巴比妥酸法进行测定，称取不同处理的叶片约1g，剪碎混匀，加入2ml10％三氯乙酸和少量石英研磨至匀浆，再加8ml 10％三氯乙酸进一步研磨，离心取2ml上清液，加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸，混匀后沸水浴15min，迅速冷却后离心。取上清采用UV-2000型紫外分光光度计测定532nm、600nm、450nm波长下的吸光度。三次重复。
丙二醛浓度(MDA)C(μmol/L)＝6.45×(D532-D600)-0.56×D450
叶片丙二醛含量(μmol/g)
SOD酶活性测定方法如下：
采用氮蓝四唑光还原法测定。称取0.5g处理叶片，剪碎混匀，加入5ml磷酸缓冲液，冰浴研磨后于10000r/min离心10min；取7支透明玻璃试管，分别加入4.05ml50mM磷酸缓冲液、0.3ml 220mM甲硫氨酸溶液、0.3ml 1.25mM氮蓝四唑、0.3ml0.033mM核黄素，3支加入酶液(3个重复)，4支加入磷酸缓冲液作为对照组，4000lx日光灯下反应30min，采用UV-2000型紫外分光光度计测定A560吸光值；以SOD抑制剂氮蓝四唑在光下还原程度确定SOD的活性大小，活性单位以抑制氮蓝四唑光化还原的50％为一个酶活性单位表示。对照为磷酸缓冲液。
SOD总活性(U/g FW)：
CAT酶活性测定方法如下：
采用紫外吸收法测定。称取0.5g处理叶片，剪碎混匀，加入5ml磷酸缓冲液，冰浴研磨后定容至10ml容量瓶，并取5ml提取液于4℃，10000r/min离心10min，取2ml离心酶液，加热煮死，保存备用；取四支试管于25℃预热3min,均加入Tris-HCl 1ml、蒸馏水1.7ml，三支加入未煮沸酶液0.1ml，最后一支加煮沸酶液0.1ml；逐管加0.2ml 0.2mol/L H2O2，采用UV-2000型紫外分光光度计立即测定A240的吸光值，30s读数一次，共测3min。对照为蒸馏水。以1min内A240降低0.1(三次测定平均值)为一个酶活单位(U)，计算CAT酶活性。
CAT活性(U/gFW/min)：
水分胁迫处理实验结果如图4所示，非转基因株系即苹果‘GL-3’在盐胁迫环境下叶片失绿、干枯，在干旱胁迫环境中叶片卷曲，变褐色，而在正常环境中叶片鲜绿，无萎蔫；转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8在盐胁迫环境和干旱胁迫环境中与正常环境中在叶片表型一致，均叶片鲜绿，无萎蔫。非转基因株系即苹果‘GL-3’，与正常环境的脯氨酸含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的脯氨酸含量分别提高了74.94％和61.36％；转基因株系OE-MsSCL26-3与正常环境的脯氨酸含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的脯氨酸含量分别提高了130.11％和94.21％；转基因株系OE-MsSCL26-5与正常环境的脯氨酸含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的脯氨酸含量分别提高了148.31％和107.34％；转基因株系OE-MsSCL26-8与正常环境的脯氨酸含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的脯氨酸含量分别提高了121.61％和79.10％；说明在盐胁迫环境和干旱胁迫环境这两种逆境条件下，转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的植物抗逆性正相关的渗透调节物质脯氨酸含量提高幅度显著高于非转基因株系即苹果‘GL-3’(图4)。
非转基因株系即苹果‘GL-3’，与正常环境的丙二醛含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的丙二醛含量分别提高了209.93％和110.25％；转基因株系OE-MsSCL26-3与正常环境的丙二醛含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的丙二醛含量分别提高了84.97％和38.36％；转基因株系OE-MsSCL26-5与正常环境的丙二醛含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的丙二醛含量分别提高了85.16％和34.47％；转基因株系OE-MsSCL26-8与正常环境的丙二醛含量相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的丙二醛含量分别提高了59.02％和41.82％；说明在盐胁迫环境和干旱胁迫环境这两种逆境条件下，作为植物细胞膜损伤指标的丙二醛含量在转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8中的提高幅度显著低于非转基因株系即苹果‘GL-3’(图4)。
非转基因株系即苹果‘GL-3’，与正常环境下的超氧化物歧化酶SOD相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中SOD酶活性分别提高了94.31％和87.68％；转基因株系OE-MsSCL26-3与正常环境的SOD酶活性相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中SOD酶活性分别提高了314.29％和234.46％；转基因株系OE-MsSCL26-5与正常环境的SOD酶活性相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中SOD酶活性分别提高了294.82％和225.92％；转基因株系OE-MsSCL26-8与正常环境的SOD酶活性相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中SOD酶活性分别提高了323.35％和233.92％；说明在盐胁迫环境和干旱胁迫环境这两种逆境条件下，作为与植物抗逆性正相关的降低水分胁迫损伤的抗氧化酶的SOD酶活性在转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的每克鲜重中酶活提高幅度显著高于非转基因株系即苹果‘GL-3’(图4)。
非转基因株系即苹果‘GL-3’，与正常环境的过氧化氢酶CAT相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中CAT酶活性分别提高了98.20％和58.88％；转基因株系OE-MsSCL26-3与正常环境的CAT酶活性相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中CAT酶活性分别提高了291.66％和110.10％；转基因株系OE-MsSCL26-5与正常环境的CAT酶活性相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中CAT酶活性分别提高了253.57％和98.80％；转基因株系OE-MsSCL26-8与正常环境的CAT酶活性相比，在盐胁迫环境和干旱胁迫环境的每克鲜重中CAT酶活性分别提高了274.65％和122.72％；说明在盐胁迫环境和干旱胁迫环境这两种逆境条件下，作为与植物抗逆性正相关的降低水分胁迫损伤的抗氧化酶的CAT酶活性在转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的每克鲜重中酶活提高幅度显著高于非转基因株系即苹果‘GL-3’(图4)。
综上，相比对照组，处理组过表达株系叶片中与植物抗逆性正相关的渗透调节物质脯氨酸积累显著增多，具体增高了28.92％-97.91％；与植物抗逆性正相关的降低水分胁迫损伤的抗氧化酶超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT的显著增加，具体SOD酶活性增加了157.66％-242.85％，CAT酶活性增加了67.81％-197.00％；作为植物细胞膜损伤指标的丙二醛的积累显著降低，具体降低了59.43％-71.89％；说明实验组过表达MsSCL26转基因株系表现出较强的水分胁迫耐受性。
土壤干旱处理实验：将苹果‘GL-3’野生型植株与转基因过表达植株同时进行土壤干旱处理实验，实验过程中，野生型植株和转基因植株处理水分条件相同。实验重复三次，每次实验方法如下：
将在上述正常的继代培养基上生长30d的苹果转基因株系OE-MsSCL26-3、OE-MsSCL26-5和OE-MsSCL26-8的无根组培苗和非转基因株系即对照苹果‘GL-3’(野生型植株，又称受体植株)的无根组培苗，每个株系均3-4株，分别转移至生根培养基(MS培养基+IBA0.5mg/L)培养(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)20d得到生根的组培苗，进行炼苗，然后再分别转移至同一花盆中的左、中、右三个位置(见图5)生长60d后进行干旱处理：干旱处理前浇透水，放置于温室内(温度24℃，相对湿度45％，昼夜周期为16h光/8h暗)自然干旱，处理期间不再补充水分，不进行复水处理。在干旱处理0d(Control)、15d、20d时，分别拍照观察野生型植株和转基因过表达植株的表型变化，测定叶片相对含水量；同时在0d(Control)、20d时分别测量野生型植株和转基因过表达植株的植株高度和基部直径，以分析干旱胁迫对植株生长造成的差异。同时，分别于干旱处理第0d、7d、15d和20d测定花盆的左、中、右三个位置的土壤含水量，以观察土壤干旱胁迫的胁迫程度以及同一花盆不同位置的干旱胁迫程度是否均一。土壤干旱处理实验结果如图5所示，其中图5上面的图显示的是苹果转基因株系OE-MsSCL26-3(L3)、OE-MsSCL26-5(L5)和OE-MsSCL26-8(L8)与野生型苹果‘GL-3’在干旱处理0d、15d和20d的表型差异。结果显示，在第0d(Control)时，转基因和野生型植株表型无显著差异；在干旱处理第15d时，苹果‘GL-3’植株叶片失水、萎蔫，而苹果转基因株系叶片仍保持正常状态；直至干旱处理第20d时，苹果转基因株系叶片也逐渐开始失水、萎蔫,但失水萎蔫程度低于苹果‘GL-3’。说明转基因株系比野生型苹果‘GL-3’具有更强的耐旱能力。
图5左下折线图表示干旱处理第0d、7d、15d和20d的花盆内从左到右三个位置(“左、中、右”)的土壤含水量变化，数据显示花盆内不同位置的土壤水分含量均随干旱处理逐渐下降，且没有显著差异，说明苹果转基因株系与野生型苹果‘GL-3’处于相似的土壤环境中。
图5下面中间图片表示干旱处理第0d(Control)、15d和20d的叶片相对含水量测定。其中干旱处理第0d(Control)苹果转基因株系OE-L3(OE-MsSCL26-3)、OE-L5(OE-MsSCL26-5)、OE-L8(OE-MsSCL26-8)与野生型苹果‘GL-3’的叶片相对含水量无显著差异；而干旱处理15d和20d时，相似的土壤水分条件下，苹果转基因株系叶片相对含水量显著高于野生型苹果‘GL-3’。具体为干旱处理15d野生型苹果‘GL-3’的叶片含水量为23.22±2.56％，苹果转基因株系OE-L3、OE–L5和OE–L8的叶片含水量分别为55.48±1.93％、55.27±1.73％和57.38±5.41％，转基因过表达株系叶片相对含水量是野生型苹果‘GL-3’叶片含水量的2.41倍；干旱处理20d野生型苹果‘GL-3’的叶片含水量为16.18±3.05％，苹果转基因株系OE-L3、OE–L5和OE–L8的叶片含水量分别为48.18±3.28％、49.52±1.86％和50.26±0.84％，转基因过表达株系叶片相对含水量是野生型苹果‘GL-3’叶片含水量的3.05倍。说明苹果转基因株系叶片失水能力显著低于野生型，因此抗旱能力显著强于野生型苹果‘GL-3’。
图5右下方柱状图显示的是干旱处理0d(Control)和20d的植株高度和基部直径的测定比较。其中干旱处理第0d(Control)苹果转基因株系OE-L3(OE-MsSCL26-3)、OE-L5(OE-MsSCL26-5)、OE-L8(OE-MsSCL26-8)与野生型苹果‘GL-3’相比，植株高度和基部直径均无显著差异。而干旱处理20d转基因株系OE-L3(OE-MsSCL26-3)、OE-L5(OE-MsSCL26-5)、OE-L8(OE-MsSCL26-8)的植株高度和基部直径均高于野生型苹果‘GL-3’。其中野生型苹果‘GL-3’的植株高度为30.63±0.35cm，苹果转基因株系OE-L3、OE-L5和OE-L8的植株高度分别为43.20±0.80cm、38.67±0.21cm和46.40±0.20cm，转基因过表达株系的植株高度是野生型苹果‘GL-3’植株高度的1.40倍。干旱处理20d时，各转基因株系的基部直径也均高于野生型植株，其中干旱处理20d野生型苹果‘GL-3’的植株基部直径为3.07±0.07mm，苹果转基因株系OE-L3、OE-L5和OE-L8的基部直径分别为3.56±0.33mm、3.38±0.08mm和3.59±0.01mm，转基因过表达株系的基部直径是野生型苹果‘GL-3’基部直径的1.14倍。
上述实验结果说明过表达MsSCL26转基因株系在土壤干旱处理过程中，能够维持较高的叶片相对含水量，保持较高的植株高度和基部直径生长速度，表现出较强的水分胁迫耐受性，MsSCL26基因的过表达可以提高苹果植株的抗旱性。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 来源于新疆野苹果的与植物抗水分胁迫相关蛋白及编码基因的应用
<130> GNCSQ201367
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 513
<212> PRT
<213> 新疆野苹果(Malus Sieversii (ledeb.) Roem.）
<400> 1
Met Thr Gln Leu Leu Leu Asn Ser Val Met Ala Met Ala Ile Asp Gly
1 5 10 15
His Asp Asp Pro Asp Leu Asp Leu Ser Gly Cys Ser Pro Thr Thr Thr
20 25 30
Ser Thr Asn Thr Val Ser Thr Asp His Trp Tyr Ala Trp Ser Pro Leu
35 40 45
Val Asp Trp Glu Ala Leu Ala Pro Ile Asp Gln Leu Ala Gly Asp Asp
50 55 60
Phe His Gly Leu Ile Glu Ser Met Val Glu Asp Gln Asp Gly Ser Thr
65 70 75 80
Glu Leu Asn Ser Ser Ser Ala Gln Asp Glu Pro Leu Glu Leu Glu Ala
85 90 95
Ser Asn Asp Thr Thr Thr Leu Gly Glu Met Met Thr Leu Thr Asp Glu
100 105 110
Asp Gly Cys Ala Asn Gly Glu Asp Leu Lys Gly Leu Arg Leu Val His
115 120 125
Leu Leu Ile Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Gly Ala Tyr Lys Ser Arg
130 135 140
Asp Leu Ala Arg Val Ile Leu Val Arg Leu Lys Glu Leu Val Ser Pro
145 150 155 160
Thr Asp Gly Ser Asn Met Glu Arg Leu Ala Ala Tyr Tyr Thr Glu Ala
165 170 175
Leu Gln Gly Leu Leu Glu Gly Thr Gly Gly Leu Leu Gly Lys His Leu
180 185 190
Ile Gly Ser Gly Ala His Arg Asn His Gly His His Pro Met Asp Val
195 200 205
Thr Val Ala Phe Gln Leu Leu Gln Asp Met Ser Pro Tyr Val Lys Phe
210 215 220
Gly His Phe Thr Ala Asn Gln Ala Ile Leu Glu Ala Val Val His Glu
225 230 235 240
Arg Arg Ile His Val Val Asp Tyr Asp Ile Met Glu Gly Ile Gln Trp
245 250 255
Ala Ser Leu Met Gln Ala Leu Val Ser Arg Lys Glu Gly Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Leu Leu Arg Ile Thr Ala Leu Ser Arg Gly Gly Ser Arg Arg Gln
275 280 285
Ser Ile Gly Thr Val Gln Glu Thr Gly Arg Arg Leu Thr Glu Phe Ala
290 295 300
Ala Ser Ile Gly Gln Pro Phe Ser Phe His Gln Cys Arg Leu Gly Ser
305 310 315 320
Asp Glu Thr Phe Gln Pro Ser Ala Leu Lys Leu Ile Lys Gly Glu Thr
325 330 335
Leu Val Ile Asn Cys Met Leu Asn Leu Pro His Phe Ser Tyr Arg Ser
340 345 350
Pro Asp Ser Ile Ala Ser Phe Leu Ser Gly Ala Lys Thr Leu Ser Pro
355 360 365
Arg Leu Val Thr Leu Val Glu Glu Asp Val Arg Ser Thr Trp Asp Gly
370 375 380
Gly Phe Val Ala Arg Phe Met Asp Ser Leu Tyr His Tyr Ser Ala Val
385 390 395 400
Tyr Asp Ser Leu Glu Ala Gly Phe Pro Met Gln Ser Arg Ala Arg Ala
405 410 415
Leu Val Glu Arg Val Phe Leu Gly Pro Arg Ile Val Gly Ser Leu Ala
420 425 430
His Ile Tyr Arg Ala His Gly Glu Val Gly His Ser Trp Arg Glu Arg
435 440 445
Leu Gly Ala Val Gly Phe Lys Pro Ile Pro Ile Ser Phe Ala Asn His
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Leu Leu Ser Ala Ser Ile Trp Thr Ser Pro Leu Glu Ser Asp Val Val
500 505 510
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<210> 2
<211> 1542
<212> DNA
<213> 新疆野苹果(Malus Sieversii (ledeb.) Roem.）
<400> 2
atgacccagt tgctgttgaa ctcagttatg gctatggcca ttgatgggca tgatgaccct 60
gatcttgatt tatccggctg cagccccaca accacaagca ccaacaccgt ttccaccgat 120
cactggtacg cctggtctcc gctggtcgac tgggaagcgc tggcaccgat agaccagctc 180
gccggagacg actttcatgg gctcattgag tcgatggtgg aagaccaaga tggcagcact 240
gagctgaact cgtcgtcggc ccaggacgag cctctagagt tagaagcgtc aaacgatacg 300
acgacgttgg gagaaatgat gacgttgacg gatgaagacg gctgcgctaa cggtgaggac 360
ttgaaggggt tgaggctggt ccatttattg attgcggcgg cggaggcgct gacgggcgca 420
tacaagagcc gagatctggc tcgggtgata ttggttcggc tcaaggagtt ggtctctcca 480
actgacggtt ctaacatgga gaggctggcg gcgtattata ccgaggccct ccagggtttg 540
ctagaaggca ccgggggttt gcttggtaag catttgattg ggagtggggc gcaccgcaat 600
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gaggaggtga ccaatcatcg gctggtttta ggttggaagt ctcgttgttt actctcagct 1500
tccatttgga cgtcaccctt agaatctgat gttgtcaatt ag 1542