Tpl2基因敲除hek293t细胞系及其构建方法和应用

文档序号：1388839 发布日期：2020-08-18 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 Tpl2基因敲除hek293t细胞系及其构建方法和应用 (TPL 2gene knockout HEK293T cell line and construction method and application thereof ) 是由郑海学张克山闫鸣昊郝军红申超超朱紫祥李丹 �田宏茹毅杨帆曹伟军于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种TPL2基因敲除的HEK293T细胞系及其构建方法和应用。本发明提供TPL2基因敲除HEK293T细胞系的构建方法,将人TPL2基因的第二外显子区域作为靶序列,具体的,将SEQ ID NO:1的TPL2等位基因1和等位基因2第二外显子的第390～459bp序列或第391～448bp序列作为靶序列。本发明提供TPL2基因敲除HEK293T细胞系HEK293T-KO-TPL2,其保藏编号为CCTCC NO:C2019328。本发明获得的敲除细胞系形态、增殖速度等方面均与对照细胞无明显差异,是较为理想的TPL2敲除细胞模型；改造后细胞系稳定,为探究TPL2蛋白抑制病毒复制的方式及病毒致病机理提供关键的生物材料,也可用于分离和培养SVA以及在SVA疫苗株的大规模细胞化培养和生产中进行应用。(The invention relates to a TPL 2gene knockout HEK293T cell line and a construction method and application thereof. The invention provides a construction method of a TPL 2gene knockout HEK293T cell line, which takes a second exon region of a human TPL 2gene as a target sequence, and concretely takes a 390 th to 459 th bp sequence or a 391 th to 448 th bp sequence of a TPL2 allele 1 and a second exon of an allele 2 of SEQ ID NO:1 as the target sequence. The invention provides a TPL 2gene knockout HEK293T cell line HEK293T-KO-TPL2 with a preservation number of CCTCC NO: C2019328. The morphology, proliferation speed and other aspects of the knockout cell line obtained by the invention have no obvious difference from those of a control cell, and the knockout cell line is an ideal TPL2 knockout cell model; the modified cell line is stable, provides a key biological material for researching the mode of inhibiting virus replication by TPL2 protein and the pathogenic mechanism of the virus, and can be used for separating and culturing SVA and applied to large-scale cell culture and production of SVA vaccine strains.)

TPL2基因敲除HEK293T细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及TPL2基因敲除HEK293T细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

HEK293细胞系是转染腺病毒E1A基因的人胚肾上皮细胞。HEK293T细胞是HEK293细胞中转入SV40T-antigen基因形成的高转衍生株，能够表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。该细胞除了可用于各类基因表达及蛋白生产，还可用于高滴度逆转录病毒及其他病毒生产，如腺病毒及其他哺乳动物病毒。

TPL2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也被称为COT或MAP3K8，在未受刺激时TPL2与p105和ABIN2形成复合物以保持非活性状态（GANTKE T, SRISKANTHARAJAH S, LEY S C.Regulation and function of TPL-2, an IkappaB kinase-regulated MAP kinasekinasekinase [J]. Cell Res, 2011, 21(1): 131-45.）。TLR，TNFR和IL1R等多种受体受到刺激后，能够通过TPL2介导的信号转导调控下游ERK、JNK、p38和NF-κB等多种信号蛋白的激活；还能刺激巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞等多种先天性免疫细胞产生I型干扰素，肿瘤坏死因子等大量细胞因子（GANTKE T, SRISKANTHARAJAH S, SADOWSKI M, et al.IκB kinase regulation of the TPL-2/ERK MAPK pathway. [J]. Immunol Rev, 2012,246(1): 168-82.）。TPL2在调节CD4+T细胞分化产生不同Th细胞谱系的过程中也是必不可少的（ZHU J, PAUL W E. CD4 T cells: fates, functions, and faults [J]. Blood,2008, 112(5): 1557-69.），是先天性免疫、炎症和肿瘤的重要参与者，在天然免疫和获得性免疫过程中都发挥着重要的作用。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因组编辑技术。该技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas获得性免疫系统，后经人工改造而逐渐发展起来（四川农业大学李沛哲. CRISPR/Cas9技术的发展与应用[N]. 科学导报，2019-08-20(B02).）。细菌在CRISPR和Cas9的帮助下，可以经由小RNA分子的引导，靶标和沉默入侵者遗传信息的关键部分。CRISPR/Cas9基因组编辑技术是通过一段gRNA特异性识别靶基因序列，并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA，随后，细胞的非同源末端连接修复机制（NHEJ）重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变（CONG L, F Z. Genome engineering using CRISPR/Cas9system [J]. Methods MolBio, 2015, 1239: 197-217.）。目前ZNF、TALEN和CRISPR/Cas9三种基因编辑核酸内切酶已经应用于临床。其中，CRISPR/Cas9系统以其高效、快速、多功能、易用、低成本等优点，成为该领域应用最广泛的基因编辑技术，并已应用在各物种中（MEMI F, NTOKOU A, PAPANGELII. CRISPR/Cas9 gene-editing: Research technologies, clinical applications andethical considerations [J]. SeminPerinatol, 2018, 42(8): 487-500.）。

公开号为CN 110862968 A的中国发明专利公开了MAP3K8基因敲除PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8及其构建方法和应用。该细胞系能够促进FMDV和SVV增殖，提高病毒产量，可用于FMDV和SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产，并可为研究MAP3K8在病毒感染过程中的作用机制提供有力工具。但在后期实践中发现，该细胞系在细胞形态和增殖速度方面与野生细胞系相比不够稳定，不利于在基础研究应用。

发明内容

本发明为解决敲除TPL2基因的细胞系在细胞形态和增殖速度等方面稳定性不好的问题，提供一种TPL2基因敲除HEK293T细胞系HEK293T-KO-TPL2。细胞系HEK293T-KO-TPL2的生长速度、细胞形态和增殖速度与野生的HEK293T细胞系相比无差异，是较为理想的TPL2敲除细胞模型，为探究TPL2蛋白抑制病毒复制的方式及病毒致病机理积累关键的生物材料。

本发明具体采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供TPL2基因敲除HEK293T细胞系的构建方法，将人TPL2基因的第二外显子区域作为靶序列，具体的，将SEQ ID NO:1所示的TPL2等位基因1和等位基因2第二外显子的第390～459bp序列或第391～448bp作为靶序列。

作为优选的方案，在等位基因1和等位基因2的靶序列中敲入外源序列或者敲除靶序列。

作为优选的方案，在SEQ ID NO:1所示的TPL2等位基因1的第390～391bp之间插入外源序列，且敲除第449bp处碱基“G”，敲除等位基因2的第391～448bp共58bp；

或者敲除SEQ ID NO:1所示的TPL2等位基因1的第393bp的“C”碱基，且敲除第442～459bp共18bp，敲除等位基因2第391～448bp共58bp。

更为优选的，TPL2等位基因1在第390～391bp之间插入外源序列如SEQ ID NO:6所示。

上述TPL2基因敲除HEK293T细胞系的构建方法，具体包括如下步骤：

步骤1：sgRNA oligo序列的设计：根据人源TPL2基因序列构建两对特异性靶向人TPL2基因的sgRNA：sgRNA1和sgRNA2；

具体的，所述的sgRNA靶向人TPL2基因的第二外显子区域。

进一步的，所述sgRNA1由下述序列合成：

H-TPL2-sgRNA1Forward：5’-TCCTCGGGGCGCCTTTGGAA-3’；

H-TPL2-sgRNA1Reverse：5’-TTCCAAAGGCGCCCCGAGGA-3’；

所述sgRNA2由下述序列合成：

H-TPL2-sgRNA2Forward：5’-CCGATGTTCTCCTGATCCCC-3’；

H-TPL2-sgRNA2Reverse：5’-GGGGATCAGGAGAACATCGG-3’；

步骤2：pX-EZ-TPL2-sgRNA重组质粒的构建：将构建的特异性靶向敲除人TPL2基因的两条sgRNA克隆至同一CRISPR/Cas9载体质粒pX459上，获得重组质粒pX-EZ-TPL2-sgRNA；

具体的，利用EZ-GuideXH辅助质粒将两条sgRNA克隆至同一CRISPR/Cas9载体质粒pX459上。

步骤3：质粒转染：将pX-EZ-TPL2-sgRNA重组质粒和pX-EZ空载质粒分别转染至HEK293T细胞中；

具体的，所述转染过程按照HighGene转染试剂说明书进行。

转染前，HEK293T细胞用添加10%的胎牛血清和1%青霉素链霉素的DMEM培养基进行培养。

步骤4：药物筛选单克隆细胞系：利用CRISPR/Cas9系统达到基因沉默的目的，通过药物筛选杀死阴性细胞，随后通过有限稀释法分选获得阳性单克隆细胞系；

具体的，所述筛选药物为嘌罗霉素（puromycin）抗生素。

步骤5：基因敲除细胞系的鉴定：将分选得到的单克隆细胞系进行扩大培养并首先通过genetyping PCR测序鉴定阳性单克隆细胞系基因的敲除情况，随后通过Westernblotting对测序筛选出的纯合敲除细胞系进行进一步鉴定，验证细胞系中TPL2蛋白的敲除情况。

具体的，所述扩大培养为：将分选得到的单克隆细胞接种至96孔板中，长满后传代至48孔板，并依次扩大培养传至24孔板、12孔板、6孔板和T25培养瓶中。

进一步的，所述genetyping PCR检测引物序列为：

H-TPL2 genetyping Forward：5’-GACCAGGCACCTGCATCTGTT-3’，

H-TPL2 genetyping Reverse：5’-TGAGGCAGTGCACCCTCAGA-3’。

第二方面，本发明提供上述的TPL2基因敲除HEK293T细胞系的构建方法构建的细胞系。

进一步的，本发明提供TPL2基因敲除HEK293T细胞系HEK293T-KO-TPL2，其保藏编号为CCTCC NO: C2019328。

第三方面，本发明提供了TPL2基因敲除HEK293T细胞系在研究TPL2抑制病毒复制的方式及病毒致病机理中的应用。

进一步的，所述病毒为SVA。

第四方面，本发明提供了TPL2基因敲除HEK293T细胞系在分离和培养SVA中的应用。

第五方面，本发明提供了TPL2基因敲除HEK293T细胞系在SVA疫苗株的大规模细胞化培养和生产中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明利用CRISPR/Cas9系统构建了TPL2基因敲除HEK293T细胞系HEK293T-KO-TPL2，该细胞系经改造后细胞系稳定，细胞形态、增殖速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的TPL2敲除细胞模型，为探究TPL2蛋白抑制病毒复制的方式及病毒致病机理提供关键的生物材料。

2、TPL2基因敲除HEK293T细胞系HEK293T-KO-TPL2，由于缺失某些片段改变了TPL2编码蛋白质的开放阅读框造成移码突变，故不能正确的表达TPL2蛋白，继而达到基因敲除的目的。由于TPL2蛋白具有抗病毒作用，故SVA病毒在野生型HEK293T细胞中的增值会受到抑制，而TPL2基因敲除HEK293T细胞系HEK293T-KO-TPL2由于不能正确的表达TPL2蛋白，故有利于SVA病毒在该细胞系中增殖，获得更大量高滴度的病毒，证明了CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑疫苗生产用工程细胞系是提高病毒产量的一种可行性策略，对将来SVA疫苗株的大规模细胞化培养和生产具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中构建的pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重组质粒测序验证结果图。

图2为本发明实施例中构建的pX-EZ-TPL2-sgRNA重组质粒PCR鉴定结果图，图中第1～4泳道依次为Marker DL2000、重组质粒pX-EZ-TPL2-sgRNA、空白泳道、重组质粒pX-EZ-TPL2-sgRNA。

图3为本发明实施例中TPL2基因敲除细胞系基因组PCR鉴定结果图，泳道1为Marker DL2000，泳道2为HEK293T-WT-TPL2细胞系，泳道3为HEK293T-KO-TPL2-A2细胞系，泳道5为HEK293T-KO-TPL2-B1细胞系，其它泳道为非阳性克隆。

图4为本发明实施例中TPL2基因敲除细胞系HEK293T-KO-TPL2-A2和HEK293T-KO-TPL2-B1基因型比对的测序结果图。

图5为本发明实施例中Western blotting检测HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞中TPL2蛋白丰度图。

图6为本发明实施例中HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞在倒置显微镜下的细胞形态图。

图7为本发明实施例中HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞形成细胞单层时间图。

图8为本发明实施例中荧光显微镜下观察HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞中SVA的荧光表达量。

图9为本发明实施例中绝对定量检测SVA在HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞中复制的病毒拷贝数图。

图10为本发明实施例中相对定量检测SVA在HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞中复制的病毒转录水平图。

图11为本发明实施例中Western blotting检测SVA在HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞中复制的病毒结构蛋白丰度图。

图12为本发明实施例中HEK293T-WT-TPL2和HEK293T-KO-TPL2细胞扩增的SVATCID₅₀滴度图。

附图中*，p < 0.05表示统计学差异显著；**，p < 0.01表示统计学差异极显著。

保藏信息：

保藏时间：2019年11月29日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:C2019328；

保藏单位地址：中国武汉大学；

分类命名：人胚肾细胞HEK293T-KO-TPL2。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所用材料来源：

细胞、质粒与病毒：人胚肾293T细胞(HEK293T)由ABclonal公司提供。CRISPR/Cas9载体质粒pX459 pSpCas9-2A-puro-MCS和辅助载体质粒EZ-GuideXH由ABclonal公司提供。大肠杆菌Trans5α感受态细胞购自全式金公司。塞内卡病毒(Seneca Valley virus，SVA)毒株由兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队保存。

试剂和抗体：0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM、DMEM培养基、青链霉素及热灭活胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司；T4 DNA连接酶（Quick）、HighGene转染试剂均购自ABclonal公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、RNA抽提试剂Trizol、5×First buffer、0.1M DTT、RNA酶抑制剂（RRI）和反转录酶M-MLV均购自Invitrogen公司；Oligo(dT)引物、Random随机引物、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、2×one step RT-PCR Buffer Ⅲ、TaKaPa EX Taq HS和PrimerScript RT Enzyme mix II均购自Takara公司；磷酸盐缓冲液（PBS溶液pH7.4，0.0067M）购自Hyclone公司；RAPI细胞裂解液和PMSF均购自碧云天公司；限制性核酸内切酶Bbs1、Spe1、Kpn1、蛋白预染Marker、ECL显色液均购自Thermo Fisher Scientific公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自Pall公司；50×TAE、DEPC水、30%聚丙烯酰胺均购自索宝莱公司；TB Green™Premix Ex Taq™ II (TliRNaseH Plus)、LA Taq DNA聚合酶、核酸Marker购自宝生物工程大连有限公司；Tween20、琼脂糖均购自罗氏公司。本发明使用的商业抗体包括：HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（Proteintech）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（Proteintech）、鼠抗TPL2单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology）、鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（Santa CruzBiotechnology）；羊抗兔荧光二抗（CST）。兔抗SVA多克隆抗体由兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队提供，Western blotting检测可显示出VP0、VP1和VP3三个蛋白条带。

仪器：核酸电泳槽、转膜仪和高分辨图像采集系统均购自BIO-RAD公司；CO₂恒温培养箱、4℃展示柜、-20 ℃冰箱、-80 ℃超低温冰箱和荧光定量PCR仪均购自ThermoScientific公司；激光扫描共聚焦显微镜购自德国Leica公司；倒置光学显微镜购自Nikon公司；电热恒温水浴锅购自上海申安公司；涡旋振荡器、制冰机和水平摇床均购自北京六一公司；PCR仪、小型常温离心机、低温冷冻超速离心机和pH测定计均购自Eppendorf公司。

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

1、sgRNA oligo序列的设计

根据NCBI数据库公布的人TPL2基因序列（Gene ID：1326，如SEQ ID NO:1所示），通过在线CRISPR设计工具（http://crispr.mit.edu/）设计了两对特异性sgRNA序列，靶向人TPL2第二外显子。设计的寡核苷酸序列见表1。

表1 人TPL2 sgRNA oligo序列

引物名称	引物序列（5' - 3'）	序列编号
			H-TPL2-sgRNA1Forward	TCCTCGGGGCGCCTTTGGAA	SEQ ID NO:2
H-TPL2-sgRNA1 Reverse	TTCCAAAGGCGCCCCGAGGA	SEQ ID NO:3
			H-TPL2-sgRNA2Forward	CCGATGTTCTCCTGATCCCC	SEQ ID NO:4
H-TPL2-sgRNA2 Reverse	GGGGATCAGGAGAACATCGG	SEQ ID NO:5

2、pX-EZ-TPL2-sgRNA重组质粒的构建

将合成的两条单链sgRNAoligoDNA退火形成双链，CRISPR/Cas9载体pX459 pSpCas9-2A-puro-MCS和辅助载体EZ-GuideXH经Bbs1酶切后回收线性化的载体。用T4 DNA 快速连接酶将退火后的sgRNA1和sgRNA2双链DNA分别与线性化的pX459 pSpCas9-2A-puro-MCS和EZ-GuideXH在室温（25 ℃）连接5min获得pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重组质粒，随后对重组质粒进行测序鉴定，结果如图1所示，由图1可以看出，sgRNA1和sgRNA2双链DNA已成功连接到pX459 pSpCas9-2A-puro-MCS和EZ-GuideXH中。以Spe1、Kpn1对获得的两个重组质粒进行双酶切，回收后利用T4 DNA 快速连接酶将线性化酶切产物室温（25 ℃）连接5 min，最终获得pX-EZ-TPL2-sgRNA重组质粒。质粒转化至Trans5α感受态细胞中，随后涂布于氨苄抗性平板，37 ℃过夜。次日挑取单克隆菌，加入具有氨苄抗性的 LB 培养基，37 ℃恒温箱震荡培养，12～16 h后按照质粒小提试剂盒说明书抽提质粒进行菌落PCR筛选，扩增的阳性克隆PCR产物正确大小约为520bp，与预期大小一致，如图2所示。随后将筛选到的阳性克隆质粒用U6通用引物进行进一步测序验证。

3、细胞培养与转染

将HEK293T细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素的 DMEM 培养基中，并置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。转染前将生长状态良好的对数生长期HEK293T细胞接种至6孔细胞培养板中培养，当细胞密度达到70%～80%时，按照HighGene转染试剂说明书将4 μg上述构建好的pX-EZ-TPL2-sgRNA重组质粒转染至细胞中（转染试剂HighGene与重组质粒按照2∶1浓度混合），同时转染等量的pX-EZ空载体作为阴性对照。

4、药物筛选单克隆细胞系

细胞转染24～48 h后更换含有1.3 μg/mL puromycin抗生素的新鲜DMEM完全培养基进行药物筛选，两天后更换为含有0.65μg/mL puromycin抗生素的新鲜DMEM完全培养基继续筛选7天左右，观察到阴性对照组细胞全部死亡。将得到的阳性细胞消化成单个细胞，并使用有限稀释法稀释细胞至96孔板中，培养一周后观察单克隆生长情况，约两周后挑选出生长状态良好的单克隆进行鉴定。

5、TPL2基因敲除HEK293T细胞系的鉴定

将96孔板中挑选出的单克隆细胞接种至48孔板，待细胞长满后依次扩大培养至24孔板、12孔板、6孔板和T25培养瓶中。期间取部分细胞提取细胞总RNA并反转录为cDNA模板，使用针对敲除靶点设计的高特异性引物（见表2）进行PCR扩增和核酸电泳检测，结果如图3所示。随后对疑似阳性克隆进行genetyping PCR测序鉴定并与原基因组进行比对，检测靶向敲除TPL2基因是否成功，检测引物序列见表2。序列对比分析结果显示，挑选的HEK293T-KO-TPL2-A2细胞系TPL2等位基因1在第390～391bp之间被敲入54bp（如SEQ ID NO.6所示），且第449bp处碱基“G”被敲除；等位基因2的第391～448bp共58bp（如SEQ ID NO.7所示）被敲除；HEK293T-KO-TPL2-B1细胞系TPL2等位基因1的第393bp的“C”碱基被敲除，且第442～459bp共18bp（如SEQ ID NO.8所示）被敲除，等位基因2第391～448bp（如SEQ ID NO.7所示）共58bp被敲除，如图4所示。由此可知HEK293T-KO-TPL2-A2和HEK293T-KO-TPL2-B1细胞系都为纯合敲除。将测序正确的单克隆细胞和对照细胞提取蛋白，通过Western blotting检测TPL2蛋白水平的表达，对TPL2基因的敲除效果进行进一步验证，所述Western blotting实验方法见下文第10部分“Western blotting验证SVA在HEK293T-KO-TPL2细胞上的复制情况”。结果显示对照细胞HEK293T-WT-TPL2中TPL2蛋白表达正常，而TPL2敲除的单克隆细胞系HEK293T-KO-TPL2-A2和HEK293T-KO-TPL2-B1中并未检测到TPL2蛋白的表达，内参β-actin表达量正常且基本一致，结果如图5所示，说明本发明成功建立了TPL2敲除细胞系。在两种敲除细胞系中随机选取HEK293T-KO-TPL2-B1细胞系进行后续功能评价，并将该细胞系命名为HEK293T-KO-TPL2。

表2genetypingPCR检测引物序列

引物名称	引物序列（5' - 3'）
		H-TPL2 genetyping Forward	GACCAGGCACCTGCATCTGTT
H-TPL2 genetyping Reverse	TGAGGCAGTGCACCCTCAGA

6、TPL2基因敲除HEK293T细胞系的细胞形态学观察和增殖速度分析

培养HEK293T-KO-TPL2和HEK293T-WT-TPL2细胞至融合度为80%～90%时，加入0.25%胰蛋白酶进行消化，待细胞变为悬浮状态加入新鲜DMEM完全培养基终止消化。细胞悬液1200r/min离心5 min后弃上清保留沉淀，加入培养基重悬细胞，并按1∶4的比例进行细胞传代。细胞接种于6孔板中，将生长至单层的HEK293T-KO-TPL2细胞用倒置显微镜随机选取视野进行观察并拍照，将其细胞形态与HEK293T-WT-TPL2细胞进行比较，发现HEK293T-KO-TPL2和HEK293T-WT-TPL2细胞形态一致，均为贴壁、上皮样细胞形态，如图6所示。因此，在本实验条件下TPL2的敲除没有导致细胞形态的明显改变。HEK293T-KO-TPL2和HEK293T-WT-TPL2细胞在6孔板中继续连续传代，每隔2代观察两组细胞形成细胞单层的时间，并做3个复孔重复，对细胞的增值速度进行统计分析。结果显示第2代、第4代、第6代、第8代、第10代HEK293T-KO-TPL2与HEK293T-WT-TPL2细胞系形成细胞单层的时间几乎没有差异，均为约36h，如图7所示。这说明两种细胞具有相同的增殖速度。

7、病毒感染

将HEK293T-KO-TPL2和HEK293T-WT-TPL2细胞自复苏后传代2～3代，待细胞状态稳定后消化接种至6孔板中，每孔5×10⁵个细胞，并置于37 ℃、5%CO₂培养箱中。待细胞长至80%～90%时，用无血清的DMEM将细胞清洗一遍以去除细胞中残留的血清，随后用1个多重感染复数（MOI）的SVA病毒分别感染两组细胞，并置于37 ℃、5%CO₂培养箱吸附1 h。吸附结束后弃去接种物，更换为含有2%FBS的DMEM维持液继续培养并于指定时间点收取细胞。收取的细胞样品用PBS清洗两次以除去附着的病毒，进行后续实验。

8、间接免疫荧光观察SVA病毒粒子在HEK293T-KO-TPL2细胞上的荧光表达量

将HEK293T-KO-TPL2和HEK293T-WT-TPL2细胞分别铺于20 mm的玻璃小皿中，待细胞长至60%～70%时，用SVA病毒按上述感染方法和剂量感染两组细胞；感染后0 h、8 h、16 h收取细胞，用1×PBS清洗3次；加入4%多聚甲醛（每皿1 mL）过夜避光固定；弃上清，用1×PBS清洗3次，5 min/次（轻加1×PBS，防止细胞被冲起来）；加入0.2%Triton X-100（0.2% Triton X-100：100 mL PBS+200 μLTritonX-100）室温通透1 h；，弃上清，用1×PBS洗涤3次，5 min/次；用5%BSA（5%BSA：10 mL +0.5 g BSA）37 ℃封闭1.5 h；弃去封闭液，加入用5%BSA稀释的SVA病毒一抗，4℃过夜孵育；用1×PBST（1×PBST：100 mL 1×PBS+50 μL Tween20）清洗三次，10 min/次，加入用1×PBST稀释的荧光素标记二抗（免疫荧光兔二抗），37 ℃孵育1.5h；用1×PBST清洗三次，10 min/次，每皿加100 μL抗荧光衰减封片剂封片（含DAPI）；使用激光共聚焦仪器观察荧光，并保存图片。结果如图所示，在感染后8 h、16 h收取的样品中，HEK293T-KO-TPL2细胞中SVA病毒粒子的荧光表达量显著高于HEK293T-WT-TPL2细胞，如图8所示。

9、RT-qPCR验证SVA在HEK293T-KO-TPL2细胞中的复制情况

SVA感染后0 h，8 h，16 h收取细胞，用Triozl裂解法提取细胞总RNA，然后利用扩增SVA3D蛋白保守区域的绝对定量引物SVA-3D-F/R，以及SVA3D蛋白的特异性探针对提取的全基因组RNA进行绝对定量分析，测定SVA的拷贝数，引物序列详见表3。结果显示，感染后8 h、16 h收取的样品中，HEK293T-KO-TPL2细胞中SVA病毒SVA3D的拷贝数显著高于HEK293T-WT-TPL2细胞，如图9所示。将提取的部分总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用扩增SVA的相对定量引物SVA-F/R，采用Mx3005P-QPCR系统和TB Green™ Premix Ex Taq™ II(TliRNaseH Plus)试剂对SVA 的转录水平进行相对定量分析。GAPDH mRNA表达水平为内参值，通过2^-△△CT方法计算SVA mRNA的表达水平，引物序列详见表3。结果如图所示，在感染后8h、16 h收取的样品中，与HEK293T-WT-TPL2细胞相比，HEK293T-KO-TPL2细胞中SVA mRNA表达量明显增加，如图10所示。

表3RT-qPCR引物序列

引物名称	引物序列（5' - 3'）
		SVA-3D Forward	AGAATTTGGAAGCCATGCTCT
SVA-3DReverse	GAGCCAACATAGARACAGATTGC
		SVA3D探针	TTCAAACCAGGAACACTACTCGAGA
SVA Forward	AGAATTTGGAAGCCATGCTCT
		SVA Reverse	GAGCCAACATAGARACAGATTGC
H-GAPDH Forward	GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
		H-GAPDH Reverse	GAGTCAACGGATTTGGTGGT

10、Western blotting验证SVA在HEK293T-KO-TPL2细胞上的复制情况

SVA感染后0 h，8 h，16 h收取细胞，加入含PMSF的RAPI细胞裂解液以及5×蛋白上样缓冲液，将细胞刮下后置于100 °C金属浴煮沸12 min使蛋白变性，随后10000 r/min离心10min以去除细胞碎片。目的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上；NC膜用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～1.5 h；分别加入TPL2抗体(1：1000稀释)，SVA抗体(1：1000稀释)和β-actin抗体(1：5000稀释)，４℃摇床孵育过夜；用1×TBST洗膜4次 (8 min/次)；加入HRP标记的山羊抗兔IgG (1：5000稀释) 和山羊抗小鼠IgG (1：5000稀释) 抗体室温孵育1.5 h；用1×TBST洗膜4次(8 min/次)；使用全自动化学发光成像分析系统对电泳结果进行拍照及分析。结果如图11所示，在接毒后8 h、16 h收取的样品中，HEK293T-KO-TPL2细胞中SVA蛋白VP0，VP1和VP3的丰度显著高于HEK293T-WT-TPL2细胞。这些结果表明敲除TPL2能够促进SVA病毒在HEK293T细胞中复制。这是由于TPL2蛋白具有抗病毒作用，HEK293T-KO-TPL2由于不能正确的表达TPL2蛋白，故而有利于SVA病毒的复制。

11、SVA病毒感染力（TCID₅₀）的测定

用MOI=1的SVA分别感染HEK293T-KO-TPL2和HEK293T-WT-TPL2细胞，待细胞病变量达到50%～60%时收取病毒毒液。-80 ℃冰箱中反复冻融三次后，吸出培养基加入15 mL离心管，5000 r/min离心5 min后吸取上清液用野生型HEK293T细胞进行病毒感染力测定。用无血清的DMEM将获得的两组SVA病毒进行10^-3～10^-10倍梯度稀释，用各稀释度毒液分别接种96孔细胞培养板中长满单层的HEK293T细胞，每个稀释度接种8个孔，每孔0.1 mL。置于37 ℃、5%CO₂恒温培养箱中培养并观察4天，每隔半日观察记录细胞病变（CPE）情况，根据各孔的细胞病变情况按照Reed-Muench 法计算扩增病毒的TCID₅₀。结果显示SVA在HEK293T-WT-TPL2细胞复制后上清病毒的TCID₅₀滴度测定结果为10^5.7TCID₅₀ . 0.1 mL^-1，而在HEK293T-KO-TPL2细胞复制后上清病毒的TCID₅₀滴度测定结果为10^6.9TCID₅₀ . 0.1 mL^-1，如图12所示，增加了约16倍。由此可见敲除TPL2能够促进SVA感染后子代病毒的增殖，同等条件下使用HEK293T-KO-TPL2细胞能够获得更高滴度的SVA，使SVA病毒产量增加。

以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> TPL2基因敲除HEK293T细胞系及其构建方法和应用

<130> 无

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

atggagtaca tgagcactgg aagtgacaat aaagaagaga ttgatttatt aattaaacat 60

ttaaatgtgt ctgatgtaat agacattatg gaaaatcttt atgcaagtga agagccagca 120

gtttatgaac ccagtctaat gaccatgtgt caagacagta atcaaaacga tgagcgttct 180

aagtctctgc tgcttagtgg ccaagaggta ccatggttgt catcagtcag atatggaact 240

gtggaggatt tgcttgcttt tgcaaaccat atatccaaca ctgcaaagca tttttatgga 300

caacgaccac aggaatctgg aattttatta aacatggtca tcactcccca aaatggacgt 360

taccaaatag attccgatgt tctcctgatc ccctggaagc tgacttacag gaatattggt 420

tctgatttta ttcctcgggg cgcctttgga aaggtatact tggcacaaga tataaagacg 480

aagaaaagaa tggcgtgtaa actgatccca gtagatcaat ttaagccatc tgatgtggaa 540

atccaggctt gcttccggca cgagaacatc gcagagctgt atggcgcagt cctgtggggt 600

gaaactgtcc atctctttat ggaagcaggc gagggagggt ctgttctgga gaaactggag 660

agctgtggac caatgagaga atttgaaatt atttgggtga caaagcatgt tctcaaggga 720

cttgattttc tacactcaaa gaaagtgatc catcatgata ttaaacctag caacattgtt 780

ttcatgtcca caaaagctgt tttggtggat tttggcctaa gtgttcaaat gaccgaagat 840

gtctattttc ctaaggacct ccgaggaaca gagatttaca tgagcccaga ggtcatcctg 900

tgcaggggcc attcaaccaa agcagacatc tacagcctgg gggccacgct catccacatg 960

cagacgggca ccccaccctg ggtgaagcgc taccctcgct cagcctatcc ctcctacctg 1020

tacataatcc acaagcaagc acctccactg gaagacattg cagatgactg cagtccaggg 1080

atgagagagc tgatagaagc ttccctggag agaaacccca atcaccgccc aagagccgca 1140

gacctactaa aacatgaggc cctgaacccg cccagagagg atcagccacg ctgtcagagt 1200

ctggactctg ccctcttgga gcgcaagagg ctgctgagta ggaaggagct ggaacttcct 1260

gagaacattg ctgattcttc gtgcacagga agcaccgagg aatctgagat gctcaagagg 1320

caacgctctc tctacatcga cctcggcgct ctggctggct acttcaatct tgttcgggga 1380

ccaccaacgc ttgaatatgg ctga 1404

<210> 2

<211> 20

<212> DNA