阅读说明：本技术 一种高通量筛选真核生物细胞响应环境极端pH的靶点基因的方法 (Method for high-throughput screening of target genes of eukaryotic cells responding to extreme pH of environment ) 是由 马三垣 常珈菘 夏庆友 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高通量筛选真核生物细胞响应环境极端pH的靶点基因的方法,首先构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库,然后将该载体库稳定整合到真核生物细胞,构建真核生物全基因组编辑细胞文库。然后取该细胞文库,均匀的分成5部分,在不同的pH条件下培养,收集并且抽提基因组DNA,分别用高通量测序法检测各组细胞的sgRNA丰度,筛选真核生物细胞响应环境极端pH的靶点基因。本发明在全基因组范围内筛选真核生物响应环境极端pH的靶点基因,能够最大限度的筛选真核生物响应环境极端pH的靶点基因,成本低,效率高,范围广。对筛选真核生物响应环境极端pH的靶点基因和研究真核生物与环境互作具有极大地意义。(The invention relates to a method for screening target genes of eukaryotic cells responding to extreme pH of environment in a high-throughput manner. Then the cell library is uniformly divided into 5 parts, the 5 parts are cultured under different pH conditions, genomic DNA is collected and extracted, the sgRNA abundance of each group of cells is detected by a high-throughput sequencing method respectively, and target genes of eukaryotic cells responding to extreme pH of the environment are screened. The method screens the target gene of the eukaryotic organism responding to the extreme pH value of the environment in the whole genome range, can screen the target gene of the eukaryotic organism responding to the extreme pH value of the environment to the maximum extent, and has the advantages of low cost, high efficiency and wide range. Has great significance for screening target genes of eukaryotic organisms responding to extreme pH value of environment and researching interaction between the eukaryotic organisms and the environment.)

一种高通量筛选真核生物细胞响应环境极端pH的靶点基因的 方法

技术领域

本发明属于基因编辑和高通量测序技术领域，涉及一种高通量筛选真核生物细胞响应环境极端pH的靶点基因的方法。

背景技术

细胞的生存环境对细胞完成正常的生命活动至关重要，细胞的生存环境主要有渗透压、温度、pH等。许多环境刺激，如温度、酸刺激和振动等可以改变细胞所处状态。其中，酸碱平衡稳态对细胞的代谢十分重要。pH降低时，相关酶的活性、蛋白质和DNA合成等都会受到影响。pH异常在很多病变组织中都会出现，例如炎症局部位置的特点是局部酸中毒，肿瘤和脓肿组织液的pH值也较小。其中，肿瘤组织一般有明显的pH异常。肿瘤组织的细胞外 pH一般比正常组织的细胞外要低，目前认为这种现象主要是由于肿瘤细胞多执行糖酵解代谢，导致细胞内pH降低，肿瘤细胞膜上的离子转运蛋白可以维持细胞内的pH而降低肿瘤组织细胞外的pH。肿瘤组织细胞外较低的pH对于肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭等过程有重要的作用。此外，有报道认为，肿瘤组织较低的pH值还能促进肿瘤形成新的血管，改变肿瘤细胞的生物活性。基于肿瘤组织细胞外pH较低的现象，有学者提出通过抑制肿瘤细胞膜上离子转运蛋白的活性来改变肿瘤组织微酸的环境，抑制肿瘤的发张，目前已经取得了初步的成果。总之，细胞外pH值对于细胞完成正常的生命活动具有重大意义，细胞外pH的异常变化会影响细胞的正常生命活动。研究细胞响应极端环境pH的靶标基因无论是在基础科学研究领域还是在生物医药领域都具有重要意义。但是细胞响应环境极端pH的研究还很少，其机制并不清楚。

基因编辑是研究功能基因组的重要遗传操作技术，目前应用最广泛的是CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统是来源于细菌获得性免疫系统的一种基因编辑技术。目前已经在人、果蝇、拟南芥等物种中成功实现了基因编辑。因为设计构建简单，成本低廉，编辑效率高，目前CRISPR/Cas9系统的应用范围已经不限于单基因编辑，其应用已经扩展到多基因编辑甚至是全基因组编辑。目前已经在人、小鼠、果蝇等物种的细胞中实现了CRISPR/Cas9系统介导的全基因组编辑。CRISPR/Cas9系统介导的全基因组编辑已经在病毒与宿主互作、药物靶点基因筛选、肿瘤发生等研究领域取得了重要成果。

综合运用CRISPR/Cas9介导的全基因组编辑手段，对探究真核生物响应环境pH刺激的靶标基因具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量筛选真核生物细胞响应环境极端pH的靶点基因的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种高通量筛选真核生物细胞响应环境极端pH靶点基因的方法，具体步骤如下：

(1)构建转基因系统递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；

(2)将步骤(1)所构建的细胞文库均匀分成五份，其中四份用不同的极端pH培养基培养用作为实验组，另一份用正常pH培养基培养作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；

(3)以步骤(2)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞响应环境极端pH的靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法如下：

(1-1)构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库

(1-2)将步骤(1-1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。

作为优选的技术方案之一，所述真核生物为家蚕、果蝇、人等，所述极端pH为影响细胞正常生长的pH。

作为优选的技术方案之一，步骤(1-2)的具体方法是：将步骤(1-1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。

作为进一步优选的技术方案之一，设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；

作为进一步优选的技术方案之一，将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。

作为进一步优选的技术方案之一，按照Cas作用规律，在真核生物全基因组水平设计所有编码蛋白的基因的编辑位点，其打靶位点有如下规律： 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，设计的sgRNA序列与其在基因组上的打靶位点序列一致，并有如下规律：5’-G-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；根据以上规律设计真核生物全部编码蛋白的基因的打靶位点。

作为进一步优选的技术方案之一，设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；

作为进一步优选的技术方案之一，将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。

作为进一步优选的技术方案之一，载体文库稳定整合到真核生物细胞的基因组上。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)所构建的细胞文库均匀分成五份，其中四份用不同极端pH的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用正常pH的培养基培养相同时间，然后同时将五组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。

作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或消耗的基因即为真核生物细胞响应环境极端pH的候选靶点基因。

本发明的有益效果在于：

本发明首先构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库，然后将该载体库稳定转染真核生物细胞系，构建真核生物全基因组编辑突变体细胞文库。然后取该细胞文库，均匀的分成五部分，其中四份用不同极端pH的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用正常pH的培养基培养相同时间。将两组实验的细胞同时收集并且抽提基因组DNA，分别用高通量测序法检测其sgRNA丰度，筛选真核生物响应环境极端pH的靶点基因。本发明的最大优点是在不设前提条件的情况下，在全基因组范围内筛选真核生物响应极端环境pH的靶点基因。与传统的研究真核生物响应环境极端pH的靶点基因的方法相比，本发明能够最大限度的筛选真核生物响应环境极端pH的靶点基因，成本低，效率高，范围广。对筛选真核生物响应环境极端pH的靶点基因具有极大地意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的工作流程图；

图2为极端pH培养基培养的细胞sgRNA显著消耗的基因维恩图

图3为极端pH培养基培养的细胞sgRNA富集消耗的基因维恩图

图4为KEGG通路富集分析家蚕BmE细胞在极端低pH(5.0)条件下靶点基因富集情况；

图5为KEGG通路富集分析家蚕BmE细胞在极端低pH(5.5)条件下靶点基因富集情况；

图6为KEGG通路富集分析家蚕BmE细胞在极端高pH(6.6)条件下靶点基因富集情况；

图7为KEGG通路富集分析家蚕BmE细胞在极端高pH(6.95)条件下靶点基因富集情况。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

以下以家蚕细胞为例说明本发明，但本发明并不局限于家蚕细胞。

以下凡是未注明的具体实验方法，都按照公认的实验方法与条件实施，例如，按照试剂耗材厂商提供的说明书操作，或者按照经典实验书籍《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克等著)来完成实验。

实施例：

本实施例中所用到的家蚕胚胎细胞系(The Bombyx mori embryonic cell line,BmE)为生物实验中常用细胞系(PMID:17570024)。

具体工作流程见图1。

1、家蚕胚胎细胞系BmE全基因组编辑细胞文库。

1)构建一个piggyBac转座子系统介导的家蚕CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库，绝大多数基因都设计了6个打靶位点，构建了6个基因编辑载体；总计设计并构建94000个基因编辑载体。

2)将步骤1)构建的家蚕全基因组编辑突变体库与piggyBac transposase表达载体 A3-helper(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1)按照摩尔比1:1转染家蚕胚胎细胞系BmE，转染方法包括但不限于脂质体转染法、电穿孔转染法等。然后用包含Zeocin的完全培养基筛选2 个月，构建成家蚕BmE细胞全基因组编辑细胞文库。细胞完全培养基为包含体积浓度10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS，赛默飞世尔公司)和青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin， 20万单位/升，赛默飞世尔公司)的Grace昆虫培养基(Grace's Insect Medium，赛默飞世尔公司)。培养条件为27℃，Zeocin购买自赛默飞世尔公司，工作浓度为200μg/ml。

2、将步骤(1)所构建的细胞文库均匀分成五份，其中四份用不同极端pH的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用正常pH的培养基培养相同时间，然后同时将五组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。

3、根据步骤1中构建的piggyBac转座子系统介导的家蚕CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库，设计一对引物用于扩增sgRNA片段。

正向引物>gD-F，5-NNNNNNNNNNNNTAAATCACGCTTTCAATA，N表示碱基A、T、 G或C，如SEQ ID NO.2所示；

反向引物>gD-R，5-NNNNNNNNNNNNCGACTCGGTGCCACTTT，N表示碱基A、T、G或C，如SEQID NO.3所示。

4、以步骤4抽提的两组基因组作为模板，用步骤3描述的引物对gD-F/gD-R扩增sgRNA 片段，然后执行高通量测序，步骤2所得的全部基因组都要用于PCR扩增。

5、通过分析步骤4的高通量测序数据，统计两组细胞sgRNA的丰度，分析筛选家蚕细胞响应环境极端pH的靶点基因，其中，与对照组相比，实验组sgRNA显著富集或消耗的基因为家蚕细胞响应环境极端pH的靶点基因。

8、家蚕细胞响应环境极端pH的靶点基因的筛选结果

1)家蚕细胞响应环境极端pH的必须基因(sgRNA消耗)的维恩图，见图2。

2)家蚕细胞响应环境极端pH的生长抑制基因(sgRNA富集)的维恩图，见图3。

3)家蚕细胞在培养基pH为5.0是富集基因的KEGG pathway富集分析显示，见图4。

4)家蚕细胞在培养基pH为5.5是富集基因的KEGG pathway富集分析显示，见图5。

5)家蚕细胞在培养基pH为6.6是富集基因的KEGG pathway富集分析显示，见图6。

6)家蚕细胞在培养基pH为6.95是富集基因的KEGG pathway富集分析显示，见图7。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种高通量筛选真核生物细胞响应环境极端PH的靶点基因的方法

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6161

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

aaatcaactt gtgttatagt cacggatttg ccgtccaacg tgttcctcaa aaagttgaag 60

accaacaagt ttacggacac tattaattat ttgattttgc cccacttcat tttgtgggat 120

cacaattttg ttatattttt aaacaaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 180

actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 240

gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 300

atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 360

gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 420

acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 480

gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 540

aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 600

taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 660

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 720

tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 780

ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 840

taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 900

gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 960

aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 1020

gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 1080

ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 1140

ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 1200

acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 1260

taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 1320

tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 1380

cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 1440

ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 1500

gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 1560

gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 1620

aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 1680

aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 1740

actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 1800

gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 1860

atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 1920

atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 1980

ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 2040

gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 2100

cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 2160

tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 2220

cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 2280

ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 2340

gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 2400

tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 2460

ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 2520

gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 2580

cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 2640

gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 2700

ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 2760

acagctatga catgattacg aattcgaatt cccatccccc tagaatccca aaacaaactg 2820

gttattgtgg taggtcattt gtttggcaga aagaaaactc gagaaatttc tctggccgtt 2880

attcgttatt ctctcttttc tttttgggtc tctccctctc tgcactaatg ctctctcact 2940

ctgtcacaca gtaaacggca tactgctctc gttggttcga gagagcgcgc ctcgaatgtt 3000

cgcgaaaaga gcgccggagt ataaatagag gcgcttcgtc tacggagcga caattcaatt 3060

caaacaagca aagtgaacac gtcgctaagc gaaagctaag caaataaaca agcgcagctg 3120

aacaagctaa acaatctgca gtaaagtgca agttaaagtg aatcaattaa aagtaaccag 3180

caaccaagta aatcaactgc aactactgaa atctgccaag aagtaattat tgaatacaag 3240

aagagaactc tgggggatcc ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt 3300

ttgaactata acgaccgcgt gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta 3360

agatttaact catacgataa ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat 3420

tatatatata ttttcttgtt atagatatcg tgactaatat ataataaaat gggtagttct 3480

ttagacgatg agcatatcct ctctgctctt ctgcaaagcg atgacgagct tgttggtgag 3540

gattctgaca gtgaaatatc agatcacgta agtgaagatg acgtccagag cgatacagaa 3600

gaagcgttta tagatgaggt acatgaagtg cagccaacgt caagcggtag tgaaatatta 3660

gacgaacaaa atgttattga acaaccaggt tcttcattgg cttctaacag aatcttgacc 3720

ttgccacaga ggactattag aggtaagaat aaacattgtt ggtcaacttc aaagtccacg 3780

aggcgtagcc gagtctctgc actgaacatt gtcagatctc aaagaggtcc gacgcgtatg 3840

tgccgcaata tatatgaccc acttttatgc ttcaaactat tttttactga tgagataatt 3900

tcggaaattg taaaatggac aaatgctgag atatcattga aacgtcggga atctatgaca 3960

ggtgctacat ttcgtgacac gaatgaagat gaaatctatg ctttctttgg tattctggta 4020

atgacagcag tgagaaaaga taaccacatg tccacagatg acctctttga tcgatctttg 4080

tcaatggtgt acgtctctgt aatgagtcgt gatcgttttg attttttgat acgatgtctt 4140

agaatggatg acaaaagtat acggcccaca cttcgagaaa acgatgtatt tactcctgtt 4200

agaaaaatat gggatctctt tatccatcag tgcatacaaa attacactcc aggggctcat 4260

ttgaccatag atgaacagtt acttggtttt agaggacggt gtccgtttag gatgtatatc 4320

ccaaacaagc caagtaagta tggaataaaa atcctcatga tgtgtgacag tggtacgaag 4380

tatatgataa atggaatgcc ttatttggga agaggaacac agaccaacgg agtaccactc 4440

ggtgaatact acgtgaagga gttatcaaag cctgtgcacg gtagttgtcg taatattacg 4500

tgtgacaatt ggttcacctc aatccctttg gcaaaaaact tactacaaga accgtataag 4560

ttaaccattg tgggaaccgt gcgatcaaac aaacgcgaga taccggaagt actgaaaaac 4620

agtcgctcca ggccagtggg aacatcgatg ttttgttttg acggacccct tactctcgtc 4680

tcatataaac cgaagccagc taagatggta tacttattat catcttgtga tgaggatgct 4740

tctatcaacg aaagtaccgg taaaccgcaa atggttatgt attataatca aactaaaggc 4800

ggagtggaca cgctagacca aatgtgttct gtgatgacct gcagtaggaa gacgaatagg 4860

tggcctatgg cattattgta cggaatgata aacattgcct gcataaattc ttttattata 4920

tacagccata atgtcagtag caagggagaa aaggttcaaa gtcgcaaaaa atttatgaga 4980

aacctttaca tgagcctgac gtcatcgttt atgcgtaagc gtttagaagc tcctactttg 5040

aagagatatt tgcgcgataa tatctctaat attttgccaa atgaagtgcc tggtacatca 5100

gatgacagta ctgaagagcc agtaatgaaa aaacgtactt actgtactta ctgcccctct 5160

aaaataaggc gaaaggcaaa tgcatcgtgc aaaaaatgca aaaaagttat ttgtcgagag 5220

cataatattg atatgtgcca aagttgtttc tgactgacta ataagtataa tttgtttcta 5280

ttatgtataa gttaagctaa ttacttattt tataatacaa catgactgtt tttaaagtac 5340

aaaataagtt tatttttgta aaagagagaa tgtttaaaag ttttgttact ttatagaaga 5400

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taaacctcga tatacagacc gataaaacac atgcgtcaat tttacgcatg attatcttta 5580

acgtacgtca caatatgatt atctttctag ggttaaataa tagtttctaa tttttttatt 5640

attcagcctg ctgtcgtgaa taccgtatat ctcaacgctg tctgtgagat tgtcgtattc 5700

tagccttttt agtttttcgc tcatcgactt gatattgtcc gacacatttt cgtcgatttg 5760

cgttttgatc aaagacttga gcagagacac gttaatcaac tgttcaaatt gatccatatt 5820

aacgatatca acccgatgcg tatatggtgc gtaaaatata ttttttaacc ctcttatact 5880

ttgcactctg cgttaatacg cgttcgtgta cagacgtaat catgttttct tttttggata 5940

aaactcctac tgagtttgac ctcatattag accctcacaa gttgcaaaac gtggcatttt 6000

ttaccaatga agaatttaaa gttattttaa aaaatttcat cacagattta aagaagaacc 6060

aaaaattaaa ttatttcaac agtttaatcg accagttaat caacgtgtac acagacgcgt 6120

cggcaaaaaa cacgcagccc gacgtgttgg ctaaaattat t 6161

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

nnnnnnnnnn nntaaatcac gctttcaata 30

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

nnnnnnnnnn nncgactcgg tgccacttt 29