一种基于玻璃微球的微流控芯片及其应用
阅读说明：本技术 一种基于玻璃微球的微流控芯片及其应用 (Micro-fluidic chip based on glass microspheres and application thereof ) 是由 杜鲁涛 黄晓文 王传新 杨雪梅 李娟� 陈嘉词 张太毅 于 2021-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于外泌体捕获的基于玻璃微球的微流控芯片,该芯片在基础研究和临床疾病诊断、病情监测、预后判断及治疗等方面具有广泛的应用前景。本发明的微流控控芯片由玻璃载玻片、微通道、聚二甲基硅氧烷组成,在聚二甲基硅氧烷上蚀刻一个进样通道、一个出样通道和与两者相连的微通道,微通道内由紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球填充组成微混合器,同时在玻璃微球上修饰特定抗体以特异性捕获外泌体。本发明的微流控芯片因独特的微通道设计和特异性抗体识别,可实现对细胞培养液上清和人体液中外泌体的高效捕获,具有集成度高、操作便捷、无污染、能耗低等优点。(The invention discloses a micro-fluidic chip based on glass microspheres for exosome capture, which has wide application prospect in the aspects of basic research, clinical disease diagnosis, disease monitoring, prognosis judgment, treatment and the like. The micro-fluidic control chip consists of a glass slide, a micro-channel and polydimethylsiloxane, wherein a sample inlet channel, a sample outlet channel and the micro-channel connected with the sample inlet channel and the sample outlet channel are etched on the polydimethylsiloxane, a micro-mixer is formed by filling glass microspheres which are tightly arranged into a face-centered cubic structure in the micro-channel, and specific antibodies are modified on the glass microspheres to specifically capture exosomes. The micro-fluidic chip can realize high-efficiency capture of cell culture solution supernatant and exosomes in human body liquid due to unique micro-channel design and specific antibody recognition, and has the advantages of high integration level, convenience in operation, no pollution, low energy consumption and the like.)
技术领域
本发明属于生物医用设备
技术领域
，涉及一种基于玻璃微球的微流控芯片及其应用。背景技术
外泌体是由细胞分泌的直径在30 nm - 150 nm的微小囊泡，广泛存在于人体血液、尿液、脑脊液、胸腹水等体液中。外泌体外层为磷脂双分子膜，内部含有大量来自亲代细胞的蛋白、核酸等生物分子，能够较反应亲代细胞的代谢和病理等状态，因此外泌体具有作为疾病诊断、病情监测和预后判断新型生物标志物的巨大潜能。目前外泌体捕获分离方法众多，常见有密度梯度离心法、超速离心法、免疫亲和捕获法及聚乙二醇等沉降剂介导的沉降法，但以上方法由于仪器昂贵、操作复杂、耗时长、所得外泌体纯度和浓度低等局限，难以满足基础研究及临床检测的要求。因此，开发可高效率、高质量捕获外泌体的新技术及设备已成为外泌体研究领域亟待解决的难题与热点。
微流控芯片被称为“芯片实验室（lab-on-a-chip）”或“微整合分析芯片（micrototal analytical systems）”，是微流控技术实现的主要平台，可将分析过程涉及的样品制备、反应、分离、检测等操作单元通过微电子、微加工等技术，集成到一块微米尺度的芯片上，并自动完成分析全过程。由于微流控芯片中容纳流体的结构是微米级（至少一个维度），因此使用该芯片的仪器设备不仅体积大大减小，其分析效率也显著提升，同时样品和试剂的耗损量也相应降低，充分体现了目前实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势，在生物、化学和医学等领域得到广泛应用。近年来，基于微流控芯片的外泌体分离分析技术倍受关注。堪萨斯大学的研究人员于2014年开发出一种通过CD63标记的磁性微球捕获外泌体的集成微流控芯片，但磁性微球的团聚现象易导致各微球信号相互干扰，影响检测结果的精确度。
发明内容
本发明针对传统外泌体捕获中存在的问题提出一种新型的基于玻璃微球的微流控芯片及其应用。
为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
一种基于玻璃微球的微流控芯片，以玻璃载玻片为基底，以聚二甲基硅氧烷为主体，并在聚二甲基硅氧烷上蚀刻微通道，微通道内含多个面心立方体结构且进行抗体修饰的玻璃微球，微通道两侧分别设置进样孔和出样孔。
作为优选，玻璃微球直径为540-960nm，进样孔和出样孔直径为0.8-1.2mm。
作为优选，所述微通道中部宽度为0.3-0.5cm，微通道由中部逐渐变窄过渡至进样孔和出样孔宽度。
上述基于玻璃微球的微流控芯片在细胞培养液上清或血清样本、全血样本、尿液样本、脑脊液样本、胸腹水样本任意一项外泌体捕获中的应用。
基于玻璃微球的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
（1）利用光刻技术与等离子刻蚀方法在聚二甲基硅氧烷上蚀刻出进样孔、出样孔和与两者相连的微通道；
（2）二甲基硅氧烷与固化剂混合均匀,除去混合物中气泡，浇注在模具上，加热固化后剥离模具与固化物，得到聚二甲基硅氧烷层；
（3）等离子体处理聚二甲基硅氧烷层，GPTMS无水乙醇溶液对聚二甲基硅氧烷层进行表面硅烷化修饰，将紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球周期性排列填充微通道中；将上层聚二甲基硅氧烷和下层玻璃载玻片进行不可逆键合,用打孔针在上层聚二甲基硅氧烷上打进样孔和出样孔得到制备完成的微流控芯片。
作为优选，步骤（2）中聚二甲基硅氧烷与固化剂质量比为10:1，固化温度为80℃-90℃。
基于玻璃微球的微流控芯片的使用方法，步骤如下：
A. 芯片内玻璃微球的PDA预处理，NaOH溶液清洗芯片微通道后注入APTES溶液，孵育后用无水乙醇冲洗微通道，干燥后烘烤，在热板上，将多巴胺溶液注入芯片微通道中，随后用Tris-HCL缓冲液冲洗；
B. 特异性抗体及包被，将抗体修饰后的芯片微通道中，室温下进行抗体固定化，用反应缓冲液冲洗芯片微通道；特异性识别分子为特异性识别外泌体膜表面标记的抗体的一种；
C.样本外泌体捕获，将原始溶液注入芯片中进行外泌体捕获，然后用缓冲液洗脱，收集各自洗脱液。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
①样本消耗少：由于反应只在微通道进行，样本充满微通道只需要20 μl，避免了外接管路产生的样本死体积，有效减少了样本上样量。
②准确度高：本发明采用玻璃微球填充微通道中形成微混合器，由于玻璃微球不具有磁性，因此该芯片克服了磁性微球因团聚而使信号相互干扰的局限，极大提高检测的准确度。
③可扩展性高：本发明由于采用微流控芯片的形式，因此可以将该外泌体捕获系统与样本预处理等微流控芯片集成，推动外泌体分离-检测-分析系统的微型化发展。
④操作简便：本发明的微流控芯片靶向外泌体特异性膜蛋白如CD9、CD63、CD81、GPC-1等，可直接将外泌体从样本中分离出来，较目前外泌体分离的金标准（超速离心法）操作步骤简便且耗时短。
附图说明
图1-图4为芯片结构示意图。
图5为洗脱液中粒子的粒径分布图。
图6为初始溶液和洗脱液中物质含量对比图。
图7为洗脱液Western Blot图。
各附图标记为：1.玻璃载玻片2.聚二甲基硅氧烷；3.进样孔、4.出样孔 5.微通道；6.微混合器7.玻璃微球。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例1
本实施例提供基于玻璃微球的微流控芯片制备过程和使用过程。
如图1-4所示，微流控芯片包括下层的玻璃载玻片1和上层的聚二甲基硅氧烷2；在所述上层聚二甲基硅氧烷2上蚀刻有进样孔3、出样孔4和与两者相连的微通道5；所述微通道5内为紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球7填充成的微混合器6。
1.基于玻璃微球的微流控芯片制备：
准备一块玻璃载玻片和一片硅片，经清洗硅片、烘干、匀胶（SU-8光刻胶）、甩胶、前烘、曝光、厚烘和显影等步骤制作模具（模具用来制作微通道）。
按聚二甲基硅氧烷：固化剂（医用液体硅胶灌封胶RTV615）=10:1的质量比混合均匀,除去混合物中气泡后浇注在模具上，80 ℃-90 ℃加热固化1小时，固化完成后，小心剥离模具与固化物，所得即为微流控芯片的上层聚二甲基硅氧烷。
等离子体处理微流控芯片的上层聚二甲基硅氧烷（仪器内压强为－98Kpa，紫外灯射频功率90W，处理15s），GPTMS（5%，无水乙醇）溶液室温反应1 h对微流控芯片的上层聚二甲基硅氧烷进行表面硅烷化修饰，将紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球填充微通道中。将芯片上层聚二甲基硅氧烷和下层玻璃载玻片进行不可逆键合(使用Plasma cleaner仪器完成),用打孔针在上层聚二甲基硅氧烷上打进样孔和出样孔得到制备完成的微流控芯片。
通过聚多巴胺（PDA）修饰对玻璃微球进行预处理，经PDA修饰后的玻璃微球可进行后续抗体固化。预处理方案具体为：用1 M NaOH溶液清洗芯片微通道，随后注入10 %（v/v）3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液500ul，并将反应器置于50 ℃孵育3 h进行胺功能化；孵育后用无水乙醇冲洗APTES处理后的芯片微通道，干燥后在125 ℃烘烤1 h；在50 ℃热板上，将1.5 ml多巴胺溶液（1 mg/ml）以2.5 μl/min的流速注入芯片微通道中，随后用10 mMTris-HCL缓冲液（PH 8.8）进行冲洗，完成对芯片微通道内玻璃微球的PDA修饰。
本实施例芯片是由下半部分的玻璃载玻片和上半部分的聚二甲基硅氧烷组成。具体为：玻璃载玻片长度为6.5-7.6 cm，宽度为2.0-2.5 cm，厚度为2 mm左右；聚二甲基硅氧烷长度为3.5-4.6 cm，宽度为1.0-1.5 cm。
在聚二甲基硅氧烷层上蚀刻一个进样通道、一个出样通道和与两者相连的微通道。具体为：通过光刻技术与等离子刻蚀方法（可以是但不局限于这一种方法）构筑微通道，进样孔和出样孔直径为0.8-1.2 mm；微通道总体长度为1.2-1.5 cm，微通道最宽处约为0.3-0.5cm，最窄处约为0.8-1.2mm，玻璃微球7直径960 nm。
微通道内分布多个按“斑马线”周期性排列的微混合器(不局限于这一种结构，也可以是其他排列方式），每个微混合器均由紧密排列成面心立方体结构的玻璃微球填充组成微混合器，如图1-4所示。
2.基于玻璃微球的微流控芯片在外泌体捕获中的应用：
①在芯片微通道玻璃微球上包被捕获抗体。具体为：将一定量（20ug/ml-100ug/ml）抗体注入PDA修饰后的芯片微通道中，在室温下保存4h-6 h进行抗体的固定化，随后使用注射泵以1 -2.5 μl/min的流速用反应缓冲液冲洗芯片微通道40-60min，完成抗体固定化。
②利用上述修饰特定抗体的微流控芯片捕获外泌体的方法。具体为：以0.5 -1 μl/min流速将细胞培养液上清或体液样本注入芯片中进行外泌体捕获，然后用10 mM Tris-HCL缓冲液（PH 8.8）以1 - 2.5 μl/min的流速洗脱，收集洗脱液。
实施例2
本实施例中芯片的制作与实施例1保持一致。
胰腺癌细胞培养液上清中外泌体的捕获，具体步骤如下：
①芯片内玻璃微球的PDA预处理：1 M NaOH溶液清洗芯片微通道，注入10 %（v/v）APTES溶液，将反应器置于50 ℃孵育3 h进行胺功能化，孵育后用无水乙醇冲洗芯片微通道，干燥后在125℃烘烤1h，在50℃热板上，将1.5 ml多巴胺溶液（1 mg/ml）以2.5 μl/min的流速注入芯片微通道中，随后用10 mM Tris-HCL缓冲液（PH 8.8）冲洗。
②特异性GPC-1抗体及BSA包被：将GPC-1抗体（50 μg/ml）注入一张PDA修饰后的芯片微通道中，在室温下保存6 h进行抗体的固定化，随后使用注射泵以2.5 μl/min的流速用反应缓冲液冲洗芯片微通道40 min，完成抗体固定化。相应地，将BSA（50 μg/ml）注入另一张PDA修饰后的芯片微通道中，在室温下保存6 h进行BSA的固定化，随后使用注射泵以2.5μl/min的流速用反应缓冲液冲洗芯片微通道40 min，完成BSA固定化。
③样本外泌体检测：以1 μl/min流速将胰腺癌PANC-1细胞系培养液上清（原始溶液）分别注入GPC-1及BSA包被的芯片中进行外泌体捕获，然后用10 mM Tris-HCL缓冲液（PH8.8）以2.5 μl/min的流速洗脱，收集各自洗脱液。纳米颗粒跟踪技术分析外泌体分离效果，免疫印迹实验对洗脱液中的外泌体进行表征，纳米颗粒跟踪技术分析GPC-1包被组及BSA包被组原始溶液及洗脱液中粒子数，检测芯片捕获效率。
图5为洗脱液中粒子的粒径分布图。从图中可以看出，纳米颗粒跟踪分析发现洗脱液中粒子平均粒径及其主峰均在外泌体的粒径范围内。
图6为初始溶液和洗脱液中物质含量对比图，纳米颗粒跟踪分析发现GPC-1抗体包被组洗脱液中外泌体粒子数大约占初始溶液的80%左右，表明外泌体捕获效率可达80%，而BSA包被组洗脱液中外泌体粒子数不足5%，表明该芯片的非特异性捕获率极低。
图7为洗脱液Western Blot图，Western Blot结果表明洗脱液中含有GPC-1、CD9和TSG101等外泌体特异性标志物，证明使用该种芯片分离捕获的粒子确为外泌体。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：十字流动聚焦型液滴微流控芯片的制备方法及应用