阅读说明：本技术 一种egfr激酶抑制剂及其制备方法和应用 (EGFR kinase inhibitor and preparation method and application thereof ) 是由 罗会兵 李庆 周华勇 于 2018-08-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种式(Ⅰ)所示EGFR激酶抑制剂化合物,式中环A、R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>、R<Sub>3</Sub>、R<Sub>4</Sub>、R<Sub>5</Sub>、R<Sub>6</Sub>和m如说明书所定义。本发明还涉及所述激酶抑制剂化合物盐、制备方法、药物组合物及其在治疗由EGFR介导的疾病特别是癌症方面的应用。<Image he="128" wi="299" file="849285DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The present invention relates to an EGFR kinase inhibitor compound represented by formula (I), wherein the ring A, R is cyclic 1 、R 2 、R 3 、R 4 、R 5 、R 6 And m is as defined in the specification. The invention also relates to the kinase inhibitor compound salts, the preparation method, the pharmaceutical composition and the application thereof in treating diseases mediated by the EGFR, particularly cancers.)

一种EGFR激酶抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种选择性抑制突变形态的表皮生长因子受体（EGFR）激酶抑制剂及其制备方法，包含所述激酶抑制剂及其药物组合物，以及所述激酶抑制剂在治疗由某些突变形态的EGFR介导的疾病以及制备用于治疗由某些突变形态的EGFR介导的疾病的药物方面的应用。

背景技术

表皮生长因子受体（EGFR）属于蛋白酪氨酸激酶（PTK）家族，由EGFR（Erb-B1）、Erb-B2（HER-2/neu）、Erb-B3和Erb-B4组成，被确认为是在细胞生长和增值过程中至关重要的驱动因素。EGFR的过度表达和突变已被明确证实将导致不可控的细胞生长，与大部分癌症疾病进程有关，如肺癌、结肠癌、乳腺癌等。

作为潜在的抗癌治疗药物的特异性PTK抑制剂备受关注。第一代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）包括吉非替尼（Gefitinib）、埃罗替尼（Erlotinib）和拉帕替尼（Lapatinib），对EGFR野生型和激活型突变（例如19号外显子缺失激活突变、或L858R激活突变）均有抑制作用，分别用于非小细胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌的治疗。然而，患者在接受治疗后产生耐药而导致肿瘤产生继发性生长，使得此类抑制剂在临床上的进一步应用受到限制。研究表明，50%的吉非替尼、埃罗替尼治疗后耐药性的产生与EGFR 790号位的苏氨酸置换为蛋氨酸（T790M）发生二次突变相关（Pao W.等，Plos Med.，2:1-11,2005）。

与第一代EGFR-TKI相比，第二代EGFR-TKI如阿法替尼(Afatinib)和达克替尼（dacomitinib）具有非常突出的优点，它们可以通过麦克尔加成反应不可逆的与EGFR上半胱氨酸残基（Cys797）共价结合，使EGFR抑制剂与ATP结合位点扩大，从而在一定程度上克服T790M突变引起的耐药性（Li D等，Oncogene，27:4702-4711,2008）。然而Cys797存在于所有形式的EGFR中，因此第二代EGFR-TKI，不仅对激活性突变和耐药型突变的EGFR有活性，而且对野生型的EGFR也具有活性，从而导致皮疹、腹泻、恶心、厌食，虚弱无力等毒副作用(Curr.Med .Chem .2006 ,13 ,3483-3492)，最终限制了其临床给药剂量及有效血药浓度，在克服T790M耐药突变方面未能取得令人瞩目的效果。

第三代EGFR-TKI如：AZD9291,CO-1686和HM61713,它们是一类具有特异选择性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，相较于第一代、第二代EGFR-TKI而言，它们对激活性突变和耐药型突变的EGFR有较强抑制活性，而对野生型EGFR抑制作用较弱。它们在T790M阳性肿瘤中有高效，但他们仍然存在一定的毒性，像依然会产生腹泻，皮疹，恶心甚至高血糖等临床副作用((J Clin Oncol 2014；32:abstr 8009；J Clin Oncol 2014；32:abstr 8010)。很显然，一个具有更高活性和低毒性的化合物会带来更大好处。

阿斯利康AZD9291是一种口服的小分子第三代表皮生长因子络氨酸激酶抑制剂，AZD9291针对耐药突变T790M和敏感突变位点(19Del和L858R)的特异性结合能力较强，因此对于一线TKI治疗后耐药的非小细胞肺癌患者具有很好的治疗效果，但由于其对EGFR野生型也有一定的抑制，因此临床上会产生腹泻、皮疹等副作用，

（AZD9291）。

为克服临床中常见的EGFR耐药性突变（例如T790M突变）以及现有EGFR抑制剂的毒副作用问题，即开发更多的对某些激活突变体和耐药型突变体形式的EGFR显示较高的抑制同时对野生型EGFR显示相对较低的抑制的小分子抑制剂已经是当前抗肿瘤领域的迫切需要。本发明人在研究EGFR抑制剂的过程中，惊喜地发现了一种对EGFR激活型突变（如19号外显子缺失激活突变、或L858R激活突变）和T790M耐药型突变具有很好的抑制活性，而对野生型EGFR（WT EGFR）的抑制活性较弱的EGFR激酶抑制剂，且毒副作用较低，安全性好。预期此类抑制剂将会有好的疗效，有望克服耐药性问题及毒副作用问题，具有良好的开发前景。

发明内容

本发明提供如下式（I）化合物，或其药学上可接受的盐：

式中：

环A为杂芳基；

R₁选自氢、卤素、C₁-C₄烷基或卤代C₁-C₄烷基；

R₂为卤代C₁-C₄烷基；

R₃选自氢、C₁-C₄烷基或卤代C₁-C₄烷基；

R₄选自氢、C₁-C₄烷基或卤代C₁-C₄烷基；

R₅选自

或

；

每个R₆独立的选自氢、卤素、-CN、C₁-C₄烷基或卤代C₁-C₄烷基；

R₇选自氢、C₁-C₄烷基或卤代C₁-C₄烷基；

m为1、2或3。

本发明提供式（I）化合物，其能够抑制一种或多种EGFR激活型或耐药型突变，例如L858R激活突变体、19号外显子缺失激活突变体、T790M耐药型突变体。有利地，这种化合物可用于对基于EGFR抑制剂的现有疗法已产生一定程度的耐药性患者的癌症治疗。

本发明提供式（I）化合物，其对激活或耐药型突变体形式的EGFR显示比野生型EGFR更高的抑制。由于与野生型EGFR抑制相关的毒性降低，因而预期这种化合物更适于用作治疗剂，尤其适用于癌症的治疗。

本发明还提供了式（I）化合物的制备方法。

本发明还提供药物组合物，它含有上述本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可以接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明还提供式（I）化合物或其药学上可接受的盐在治疗由EGFR激活型或耐药型突变体介导的疾病、特别是癌症方面的应用。

本发明还提供本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗由EGFR激活型或耐药型突变体介导的疾病、特别是癌症的药物中的应用。

本发明还提供一种治疗由EGFR激活型或耐药型突变体介导的疾病、特别是癌症的方法，所述方法包括对患者施用式（I）化合物或其药学上可接受的盐，或对患者施用含有治疗有效量的式（I）化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明还提供一种治疗哺乳动物尤其人类由EGFR激活型或耐药型突变体介导的疾病、特别是癌症的方法，所述方法包括对患者施用通式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或包括治疗有效量的通式(I)化合物和药物可接受载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

本发明还提供一种相比于野生型EGFR（WT EGFR）选择性地抑制EGFR激活型或耐药型突变的方法，所述方法包括使生物样品接触或向患者投与式（I）化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物。

本发明所提及癌症，包括肺癌、卵巢癌、***、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、胃肠道基质瘤（GIST）、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病（AML）、多发性骨髓瘤、间皮瘤。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案中，环A为吲哚基、吲唑基、吡咯[2，3-c]骈吡啶基、吡咯[3，2-c]骈吡啶基、吡咯[2，3-b]骈吡啶基、吡咯[3，2-b]骈吡啶基、吡咯[2，3-b]骈吡嗪基、吲哚啉-2-酮基、吡啶基、吡唑基或嘧啶基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个更优选实施方案中，环A为吲哚基、吡咯[2，3-c]骈吡啶基、吡咯[3，2-c]骈吡啶基、吡咯[2，3-b]骈吡啶基、吡咯[3，2-b]骈吡啶基、吡唑基或嘧啶基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个最优选实施方案中，环A为吲哚基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案中，R₁为氢或卤素。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个更优选实施方案中，R₁为氢。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案中，R₂为三氟甲基、一氟甲基、二氟甲基或2,2,2-三氟乙基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个更优选实施方案中，R₂为2,2,2-三氟乙基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案中，R₃为C₁-C₄烷基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个更优选实施方案中，R₃为甲基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案中，R₄为C₁-C₄基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个更优选实施方案中，R₄为甲基。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案中，R₅为

。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个更优选实施方案中，R₅为。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个优选实施方案中，每个R₆独立的为卤素或C₁-C₄烷基，m为1、2或3。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个更优选实施方案中，每个R₆独立的为C₁-C₄烷基，m为1、2或3。

在本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐的一个最优选实施方案中，R₆为甲基，m为1。

在本发明中，具体优选的式(Ⅰ)化合物或其药学上可接受的盐为N-(2-(甲基(2-(甲基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3-基)丙烯酰胺，结构如下所示：

。

在本发明中，具体优选的式(Ⅰ)化合物药学上可接受的盐为N-(2-(甲基(2-(甲基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3-基)丙烯酰胺甲磺酸盐。

本发明还提供制备式（I）化合物的方法，它包括以下步骤：

其中，环A、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和m与上述式（I）中的含义相同；X、Y分别为卤素，具体的包括氟、氯、溴、碘，优选氯或溴。

碱存在下，式a化合物与醇R₂OH经醚化反应得到式b化合物；式b化合物经硝基还原得到式c化合物；碱存在下，式c化合物经酰化反应得到式d化合物；式d化合物经硝化反应得到式e化合物；酸存在下，式e化合物经水解反应得到中间体1；酸存在下，中间体1与式f化合物经取代反应得到式g化合物或其盐；碱存在下，式g化合物与式h化合物经取代反应得到式i化合物；式i化合物在催化剂存在下经Boc保护得到式j化合物；式j化合物经硝基还原得到式k化合物；碱存在下，式k化合物经酰胺化得到式m化合物；最后，酸存在下，式m化合物脱Boc得到式（Ⅰ）化合物。

在本发明通式（Ⅰ）化合物的制备方法中，均可按照常规方法使用常规试剂制备，其中醚化反应所述碱为无机强碱包括但不限于NaH、LiHMDS、NaHMDS或KHMDS；式b化合物、式j化合物硝基还原所述还原剂为常规还原剂，包括但不限于保险粉、钯碳/氢气或三氯化铁/水合肼，还原反应中可进一步的加入酸，所述酸为有机酸或无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸或乙酸；式c化合物酰胺化反应中所述碱为有机碱或是无机碱包括但不限于三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钾或叔丁醇钠；所述酰化试剂包括但不限于三氟乙酸酐或三氟乙酰氯；式d化合物硝化反应中，所述硝化剂为常规硝化剂包括但不限于HNO₃/H₂SO₄、KNO₃/ H₂SO₄或发烟硝酸；式e化合物水解反应中，所述酸为无机酸或是有机酸包括但不限于盐酸、三氟乙酸、TsOH.H₂O或TsOH；式f化合物与中间体1的取代反应中所述酸为有机酸包括但不限于一水对甲苯磺酸或对甲苯磺酸；式g化合物与胺的取代反应中，所述碱为无机碱或有机碱包括但不限于碳酸钾、碳酸氢钠、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺；式i化合物Boc保护反应中所述催化剂为常规催化剂包括但不限于4-二甲氨基吡啶（DMAP）；式k化合物酰胺化反应所述碱为有机碱或无机碱包括但不限于三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、碳酸氢钠、碳酸钾；式m化合物脱Boc保护反应中所述酸为无机酸或有机酸包括但不限于盐酸、三氟乙酸。

在本发明中，卤素是指氟、氯、溴、碘等，优选氟、氯、溴。

在本发明中，C₁-C₄烷基是指含有1～4个碳原子的直链或支链烷基，烷基指饱和的脂肪族烃基团，具体包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，优选甲基、乙基或异丙基，更优选甲基。

在本发明中，卤代C₁-C₄烷基是指被一个或多个卤素，优选一至五个卤原子取代的如本文定义的C₁-C₄烷基，具体包括但不限于三氟甲基、一氟甲基、二氟甲基、2,2,2-三氟乙基、2-氟乙基或1-氯-2-氟乙基，优选三氟甲基、一氟甲基、二氟甲基或2,2,2-三氟乙基，更优选2,2,2-三氟乙基。

在本发明中，杂芳基是指含有1至4个选自N、S或O的杂原子的5至6元单环杂芳基或其与苯环、吡啶环或吡咯环稠而成的双环式杂芳基，它可以是部分饱和的。所述杂芳基包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、***基、四唑基、噻二唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、1，2，3，4-四氢异喹啉基、吡咯[2,3-c]骈吡啶基、吡咯[3,2-c]骈吡啶基、吡咯[2,3-b]骈吡啶基、吡咯[3,2-b]骈吡啶基、吡咯[2,3-b]骈吡嗪基、吲哚啉-2-酮基，优选吲哚基、吲唑基、吡咯[2,3-c]骈吡啶基、吡咯[3,2-c]骈吡啶基、吡咯[2,3-b]骈吡啶基、吡咯[3,2-b]骈吡啶基、吡咯[2,3-b]骈吡嗪基、吲哚啉-2-酮基、吡啶基、吡唑基或嘧啶基、咪唑基、吡嗪基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基或1，2，3，4-四氢异喹啉基，更优选吲哚基、吲唑基、吡咯[2,3-c]骈吡啶基、吡咯[3,2-c]骈吡啶基、吡咯[2,3-b]骈吡啶基、吡咯[3,2-b]骈吡啶基、吡咯[2,3-b]骈吡嗪基、吲哚啉-2-酮基、吡啶基、吡唑基或嘧啶基，最优选吲哚基、吡咯[2，3-c]骈吡啶基、吡咯[3，2-c]骈吡啶基、吡咯[2，3-b]骈吡啶基、吡咯[3，2-b]骈吡啶基、吡唑基或嘧啶基。

本发明还包含式（I）化合物在药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指相对无毒的本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。所述酸加成盐为本发明式（I）化合物与合适的无机酸或者有机酸形成的盐，这些盐可在化合物最后的分离和提纯过程中制备，或者可用过使纯化的式（I）化合物以其游离碱形式与适宜的有机酸或无机酸进行反应来制备。代表性酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月硅酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐、甲苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。所述碱加成盐为式（I）化合物与合适的无机碱或者有机碱形成的盐，包括例如与碱金属、碱土金属、季铵阳离子形成的盐，例如钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐、四甲基季铵盐、四乙基季铵盐等；胺盐，包括与氨（NH₃）、伯胺、仲胺或叔胺形成的盐，如甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、三乙胺盐、乙胺盐等。

本发明的化合物或其药学上可接受的盐可给药于哺乳动物包括人，可以口服、直肠、肠胃外（静脉内、肌肉内或皮下）、局部给药（粉剂、软膏剂或滴剂）、或瘤内给药。

本发明化合物的给药剂量可以大约为0.3-30mg/kg体重/天，例如0.5-20mg/kg体重/天，10mg/kg体重/天。当本发明化合物为盐、酯、前药等时，以母体化合物为基础计算施用量。

本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于口服给药的固体剂型，包括，但不限于胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂等。在这些固体剂型中，本发明式（I）化合物作为活性成分与至少一种常规惰性赋形剂（或载体）混合，例如与柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：（1）填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸等；（2）粘合剂，例如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶等；（3）保湿剂，例如，甘油等；（4）崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠等；（5）缓溶剂，例如石蜡等；（6）吸收加速剂，例如，季铵化合物等；（7）润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯等；（8）吸附剂，例如，高岭土等；和（9）润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠等，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中也可包含缓冲剂。

所述固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材料例如肠溶衣和其他本领域公知的材料进行包衣或微囊化。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于口服给药的液体剂型，包括，但不限于药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酊剂等。除了作为活性成分的式（I）化合物或其药学上可接受的盐外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水和其他溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1, 3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油类，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油等或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，本发明液体剂型也可包含常规助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料等。

所述悬浮剂包括，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂等或这些物质的混合物。

本发明化合物或其药学上可接受的盐可以配制为用于肠胃外注射的剂型，包括，但不限于生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明化合物或其药学上可接受的盐也可以配制为用于局部给药的剂型，包括如软膏剂、散剂、栓剂、滴剂、喷射剂和吸入剂等。作为活性成分的本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐在无菌条件下和生理上可接受的载体及任选的防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明还提供药物组合物，它含有本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂。在制备药物组合物时，通常是将本发明式（I）化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂混合。

可以按常规制备方法将所述本发明组合物配制为常规药物制剂。例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、乳液剂、混浮剂、分散液、溶液剂、糖浆剂、酏剂、软膏剂、滴剂、栓剂、吸入剂、喷射剂等。

本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药，特别是与其他抗肿瘤药物组合。所述治疗剂包括但不限于：作用于DNA化学结构的药物抗肿瘤药如顺铂，影响核苷酸合成的抗肿瘤药物如甲氨蝶呤（MTX）、5-氟尿嘧啶（5FU）等，影响核酸转录的抗肿瘤药物如阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等，作用于微管蛋白合成的抗肿瘤药物如紫杉醇、长春瑞滨等，芳香化酶抑制剂如氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等，细胞信号通路抑制剂如表皮生长因子受体抑制剂伊马替尼（Imatinib）、吉非替尼（Gefitinib）、埃罗替尼（Erlotinib）等。待组合的各成分可同时或顺序的给予，以单一制剂形式或以不同制剂的形式给予。所述组合不仅包括本发明化合物和一种其他活性剂的组合，而且也包括本发明化合物和两种或更多种其他活性剂的组合。

经激酶抑制实验（酶联免疫吸附法），证明本发明化合物对EGFR突变 (如EGFR^L858R、EGFR^L858R/T790M等)具有很好的抑制活性，尤其是对EGFR^L858R/T790M。

此外，通过细胞实验即对敏感型突变肿瘤细胞如HCC827(EGFR E746_A750del)细胞、PC-9(EGFR ex19del)细胞，耐药型突变肿瘤细胞如H1975(EGFR L858R/T790M)体外增值抑制实验，证明本发明化合物对敏感型突变或耐药型突变肿瘤细胞具有良好的增值抑制作用；通过动物实验即对人鳞状细胞癌A431、人非小细胞肺癌HCC827、人肺腺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制实验，证明本发明化合物对敏感型突变和耐药型突变肿瘤如人非小细胞肺癌HCC827、人肺腺癌H1975移植瘤的生长具有良好的抑制作用，而对野生型EGFR人鳞状细胞癌A431的抑制作用相对较弱，说明本发明化合物具有良好的特异选择性抑制作用，并且具有较好的安全性。本发明化合物可用作治疗由EGFR敏感型或耐药型突变体活性介导的疾病或病况、特别是肿瘤例如癌症的药物。所述癌症包括但不限于，例如肺癌、卵巢癌、***、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、胃肠道基质瘤（GIST）、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病（AML）、多发性骨髓瘤、间皮瘤，尤其对于表皮生长因子受体790位苏氨酸突变为蛋氨酸（EGFR T790M）的肿瘤类型有更好的应用。举例来说，本发明化合物可作为和用于治疗非小细胞肺癌（EGFR T790M）的药物。可用于克服临床上应用吉非替尼、埃罗替尼后由EGFR T790M引起的耐药性问题。且因与野生型EGFR抑制相关的毒性降低，预期本发明化合物在应用于治疗癌症的过程当中产生的毒副作用相对较小。

本发明化合物激酶活性抑制实验可用常规方法测定，一种优选的评价方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，通过测定药物作用于激酶后所产生的光吸收值的变化来计算药物对激酶的抑制率，

。

根据各浓度抑制率，采用非线性回归方法计算出各测试化合物的半数抑制浓度IC50。

本发明化合物抑制癌细胞增殖的药效可用常规方法测定，一种优选的评价方法为磺酰罗丹明B（SulforhodamIne B,SRB）蛋白染色法，通过测定药物作用于癌细胞后所产生的光吸收值的变化来计算药物对癌细胞增殖的抑制率，

。

阴性对照组OD值为不加入任何化合物(含0.5%的DMSO)的正常生长的细胞孔的OD值。

给药组OD值为加入待测化合物(含0.5% 的DMSO)作用后的OD值。

半数抑制剂浓度（IC50）值采用GraphPad公司PrIsm 软件5.0版本，四参数拟合方法计算。每个实验重复3次，求出3次实验的平均IC50值为抑制能力的最终指标。

本发明化合物抑制动物移植瘤生长的药效可用常规方法测定，一种优选的评价方法为对对人鳞状细胞癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用；另一种优选的评价方法为对人非小细胞肺癌细胞HCC827裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用；另一种优选的评价方法为对人肺腺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。试验方法：人鳞状细胞癌A431、人非小细胞肺癌细胞HCC827、人肺腺癌H1975分别接种于BALB/c Nude小鼠右前背部皮下，待肿瘤生长至平均合适大小时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组，测试化合物按一定剂量灌胃给药，溶剂对照组灌胃给予等量溶剂，每天一次，连续21天，整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小，观察是否出现毒性反应。

肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm³)=0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)。

附图说明

附图1是实施例2化合物盐和AZD9291在10mg/kg给药剂量下人鳞状细胞癌A431裸小鼠的体重变化曲线。

附图2是实施例2化合物盐和AZD9291在10mg/kg给药剂量下人鳞状细胞癌A431裸小鼠皮下移植瘤的肿瘤生长抑制率TGI%曲线。

附图3是实施例2化合物盐在不同给药剂量下人非小细胞肺癌细胞HCC827裸小鼠的体重变化曲线。

附图4是实施例2化合物盐在不同给药剂量下人非小细胞肺癌细胞HCC827裸小鼠皮下移植瘤的肿瘤生长抑制率TGI%曲线。

附图5是实施例2化合物盐在不同给药剂量下人肺腺癌细胞H1975裸小鼠的体重变化曲线。

附图6是实施例2化合物盐在不同给药剂量下人肺腺癌细胞H1975裸小鼠皮下移植瘤的肿瘤生长抑制率TGI%曲线。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比分别为重量份和重量百分比。

具体实施方式

I．本发明化合物制备实施例

中间体1a：6-氯-5-硝基-3-氨基-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶

（中间体1a）

步骤1：6-氯-3-硝基-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶的合成

加入甲苯（24.0L）至反应釜中，再加入2,6-二氯-3-硝基吡啶（3000g，15.54mol），调整内温在-20℃至-10℃之间，分批加入钠氢（933g，23.33mol）。滴加2,2,2-三氟乙醇（1586g，16.00mol）甲苯（6.0L）溶液。反应2h，TLC及HPLC监控反应终点。反应完毕，滴加入10% 氯化铵溶液（6.0L）。静置，分层。有机相使用水（6.0L）洗涤，减压浓缩。加入乙酸乙酯（0.3L)，升温至40～50℃，滴加正庚烷（2.7L），滴完降温到-15至-5℃下继续析晶3小时，抽滤。得到产物固体3017g，收率75.65%。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J =8.5 Hz, 1H), 5.13 (q, J = 9.0 Hz, 2H)；

¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 153.20, 151.09, 139.34, 132.67, 123.38 (q, J= 277.2 Hz), 119.14 , 63.34 (q, J = 36 Hz)；

MS m/z：256.99[M+1]。

步骤2：6-氯-3-氨基-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶的合成

室温下，加入乙腈（21.0L）和水（21.0L）至反应釜中，开启搅拌，加入实施例1得到的6-氯-3-硝基-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶（3017.0g，11.76mol），加入保险粉（15.1Kg，70.54mol）。控制温度27～33℃条件下反应2小时。滴加入36%的浓盐酸（11.9Kg，117.60mol），继续反应1.5小时。加入碳酸氢钠固体（12.8Kg，12.96mol）。过滤，母液分层，有机相使用饱和食盐水（21.0L）洗涤，减压浓缩，得到油状物质理论计算投下步反应。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.03 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.90 (d, J =8.0 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 4.93 (q, J = 9.0 Hz, 2H)；

¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 148.16, 131.72, 130.55, 123.93 (q, J = 278.5Hz), 121.02, 118.42, 61.72 (q, J = 34.0 Hz)；

MS m/z：227.01 [M+1]。

步骤3：6-氯-3-(2, 2, 2-三氟乙酰胺基)-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶的合成

室温下，反应釜中加入二氯甲烷（10.4L），开启搅拌，加入实施例2得到的6-氯-3-氨基-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶(2664g，11.76mol)，加入二异丙基乙基胺（2279g，17.64mol），控温-15至-10℃，滴加三氟乙酸酐（2963g，14.11mol）的二氯甲烷（5.2 L）溶液，滴完继续搅拌20分钟。滴加水（13.0L），分层，有机相减压浓缩，理论计算投下步反应。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.23 (s, 7H), 7.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H),7.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.03 (q, J = 8.9 Hz, 2H)；

¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 155.74 (q, J = 46.6 Hz), 155.60, 145.37,140.24, 124.01 (q, J = 278.8 Hz), 119.07, 118.30, 116.19 (q, J = 289.9 Hz),62.99 (q, J = 35.4 Hz)；

MS m/z：322.99 [M+1]。

步骤4：6-氯-5-硝基-3-(2, 2, 2-三氟乙酰胺基)-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶的合成

室温下，反应釜中加入浓硫酸（11.7L），开启搅拌，加入实施例3得到的6-氯-3-(2, 2,2-三氟乙酰胺基)-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶(3.9Kg，11.76mol)，分批加入硝酸钾固体（1783.4g，17.64mol），加完继续搅拌约40分钟，监测反应完毕后，降温，控制内温在10~25℃, 开始滴加二氯甲烷(27.3L)，搅拌45分钟，分层，取有机相，用水(11.7L)洗涤一次。有机相减压浓缩，理论计算投下步反应。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.58 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 5.17 (q, J =8.7 Hz, 2H)；

¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 155.89, 155.43 (q, J = 37.8 Hz), 138.84,138.57, 135.05, 123.22 (q, J = 273.4 Hz), 118.47, 115.51 (q, J = 278.5 Hz),63.65 (q, J = 35.3 Hz)；

MS m/z：367.98 [M+1]。

步骤5：6-氯-5-硝基-3-氨基-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶的合成

室温下，反应釜中加入甲醇（13.0L），加入实施例4得到的6-氯-5-硝基-3-(2, 2, 2-三氟乙酰胺基)-2-(2, 2, 2-三氟乙氧基）吡啶( 4322g,11.76mol)，加入对甲苯磺酸一水合物（3355g，17.64mol），控制温度60～65℃反应15小时，减压除去甲醇。加入甲基叔丁基醚（13.0 L）和水（6.5L），用碳酸钾调pH 7-8。分层，有机相用水（8.6L）洗一次，分液，减压浓缩。加入正庚烷（21.5 L），控温60～65℃搅拌1小时，降至室温，抽滤，滤饼50℃鼓风干燥18小时，得到产品1475 g。

步骤1至步骤5五步反应合计收率34.9%。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.62 (s, 1H), 5.92 (s, 2H), 5.05 (q, J =8.9 Hz, 2H).

¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 149.30, 139.53, 132.84, 123.46, 123.44 (q, J= 278.5 Hz), 116.25, 62.52 (q, J = 35.3 Hz)；

MS m/z：272.00 [M+1]。

实施例1：N-(2-(甲基(2-(甲基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3-基)丙烯酰胺

步骤1：2-氯-3-硝基-5-[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-胺基]-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶对甲苯磺酸盐的合成

将甲苯（7.43L）加入到20L反应釜中，依次加入中间体1a化合物 6-氯-5-硝基-3-氨基-2-(2,2,2-三氟乙氧基）吡啶（743.0g，2.74mol）、化合物3-(2-氯嘧啶-4-基)-1-甲基-1H-吲哚（866.7g，3.56mol）（参照CN105315259A中间体2a制备）、对甲苯磺酸一水合物（780.7g，4.10mol），搅拌，将反应混合物升温至110-115℃，反应36小时。控制温度15～30℃，加入四氢呋喃（3.72L）搅拌30分钟。抽滤，将滤饼转移至50 L反应釜中，加入四氢呋喃（4.46 L），加热回流3小时。降至15～25℃，抽滤，滤饼50 ℃鼓风干燥17小时，得2-氯-3-硝基-5-[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-胺基]-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶对甲苯磺酸盐（1719g，85.96 HPLC area % purity）。按照HPLC纯度折算，投下步反应。

熔点：216 - 218℃；

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.70 (s, 1H), 9.21 (s, 1H), 8.62 (s, 1H),8.40 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.24 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.3 Hz, 1H),7.50 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.49 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.6 Hz, 1H),7.18 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.12 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.17 (q, J = 8.8 Hz, 2H),3.91 (s, 3H), 2.29 (d, J = 5.2 Hz, 3H)；

¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 166.66, 157.35, 155.72, 147.40, 140.87,139.90, 139.72, 138.59, 135.83, 130.09, 129.99, 129.98, 129.97, 127.39,127.38, 127.37, 127.15, 125.22 (q, J = 278.5 Hz), 124.97, 123.85, 123.69,113.63, 112.97, 110.27, 63.58 (q, J = 35.3 Hz), 35.57, 22.81。

步骤2：N²-甲基-N²-（2-（甲胺基）乙基）-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-N⁵-（4-（1-甲基-1H-3-基）嘧啶-2-基）-3-硝基吡啶-2，5-二胺的合成

500 mL单口瓶中加入2-氯-3-硝基-5-[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-胺基]-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶对甲苯磺酸盐（15.0 g，31.3 mmol）、碳酸钾（10.4 g，75 mmol）、N,N'-二甲基乙二胺（3.3 g，37.6 mmol）及DMF（75 mL）。反应物置于80 °C油浴中搅拌反应1小时。向反应物中滴加400 mL水，抽滤收集析出的固体，80 °C烘干，得棕黄色固体（7.6 g，收率46%）。

MS（ESI）m/z 531[M+1]⁺。

步骤3：N²-甲基-N²-（2-（甲基叔丁氧羰基胺基）乙基）-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-N⁵-（4-（1-甲基-1H-3-基）嘧啶-2-基）-3-硝基吡啶-2，5-二胺的合成

250 mL单口瓶中加入N²-甲基-N²-（2-（甲胺基）乙基）-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-N⁵-（4-（1-甲基-1H-3-基）嘧啶-2-基）-3-硝基吡啶-2，5-二胺（7.0 g，13.2 mmol）、二碳酸二叔丁酯（4.3 mL，18.5 mmol）、DMAP（0.16 g，1.32 mmol）及乙腈（100 mL）。反应物置于80 °C油浴中搅拌反应4小时。反应液减压蒸干，固体残留物用乙酸乙酯（80 mL）打浆处理，抽滤得棕黄色固体（5.5 g，收率66%）。

MS（ESI）m/z 631[M+1]⁺。

步骤4：N²-甲基-N²-（2-（甲基叔丁氧羰基胺基）乙基）-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-N⁵-（4-（1-甲基-1H-3-基）嘧啶-2-基）吡啶-2，3，5-,三胺的合成

1 L单口瓶中加入N²-甲基-N²-（2-（甲基叔丁氧羰基胺基）乙基）-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-N⁵-（4-（1-甲基-1H-3-基）嘧啶-2-基）-3-硝基吡啶-2，5-二胺（5.5 g，8.7 mmol）、10%钯碳（0.5 g）及甲醇（100 mL）。反应物室温下以氢气球加压氢化反应2小时。反应液通过硅藻土过滤，滤液减压蒸干得棕褐色固体（3.8 g，收率72%），直接用于下一步反应。

MS（ESI）m/z 601[M+1]⁺。

步骤5：N-(2-(甲基(2-(甲基叔丁氧羰基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成

将N²-甲基-N²-（2-（甲基叔丁氧羰基胺基）乙基）-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-N⁵-（4-（1-甲基-1H-3-基）嘧啶-2-基）吡啶-2，3，5-,三胺（3.8 g，6.3 mmol）及三乙胺（1.76 mL，12.6mmol）溶于二氯甲烷（120 mL）。反应物以冰水浴冷却，加入丙烯酰氯（0.56 mL，6.9 mmol），于冰水浴中搅拌反应1小时。再加入丙烯酰氯（0.11 mL，1.2 mmol）并继续反应1小时。反应物依次以饱和NaHCO₃溶液、饱和NaCl溶液洗涤，有机相以无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物以硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯=4/1洗脱），得黄色固体（1.2 g，收率29%）。

MS（ESI）m/z 655[M+1]⁺；

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9.52 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.26 (d, J = 5.4Hz, 2H), 8.10 (s, 1H), 7.51 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.20 (m, 3H), 6.58 (dd, J =16.9, 10.1 Hz, 1H), 6.25 (dd, J = 17.0, 2.4 Hz, 1H), 5.75 (dd, J = 10.1, 2.4Hz, 1H), 4.97 (m, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.36 (m, 4H), 2.92 (s, 3H), 2.76 (m,3H), 1.37 (s, 9H)。

步骤6：N-(2-(甲基(2-(甲基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成

将N-(2-(甲基(2-(甲基叔丁氧羰基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)丙烯酰胺（780 mg，1.2 mmol）溶于二氯甲烷（20 mL）。反应物以冰水浴冷却，加入三氟乙酸（10 mL），然后于室温搅拌反应3小时。反应液减压浓缩，残留物中加入乙酸乙酯（100 mL），再依次以饱和NaHCO₃溶液、饱和NaCl溶液洗涤，有机相以无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得黄色固体（535 mg，收率81%）。

MS（ESI）m/z 555[M+1]⁺；

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.15 (s, 1H), 8.90 (s, 2H), 8.64 (s, 1H),8.44 (s, 1H), 8.29 (t, J= 6.1 Hz, 2H), 8.18 (s, 1H), 7.52 (d, J= 8.1 Hz, 1H),7.22 (m, 2H), 6.91 (dd, J = 17.0, 10.2 Hz, 1H), 6.29 (m, 1H), 5.78 (dd, J =10.1, 2.0 Hz, 1H), 5.00 (q, J= 9.1 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.58 (t, J = 5.5Hz, 2H), 3.13 (m, 2H), 2.79 (s, 3H), 2.60 (t, J = 5.0 Hz, 3H)。

实施例2：N-(2-(甲基(2-(甲基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3-基)丙烯酰胺甲磺酸盐的合成

游离碱产物N-(2-(甲基(2-(甲基胺基)乙基)胺基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)胺基)吡啶-3-基)丙烯酰胺（50 mg，0.09 mmol）加入到丙酮/水混合溶剂（2 mL，v/v=20/1）中，再加入甲磺酸（8 μL），室温下搅拌0.5小时后抽滤收集固体，干燥得黄色固体（48 mg，收率83%）。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10.19 (s, 1H), 8.86 (brs, 2H), 8.75 (s,1H), 8.21 (brs, 2H), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 7.28(m, 2H), 6.81 (dd, J = 17.0, 10.3 Hz, 1H), 6.27 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 5.78(d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.96 (q, J = 9.0 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.68 (m, 2H),3.16 (m, 2H), 2.88 (s, 3H), 2.60 (t, J = 5.2 Hz, 3H), 2.34 (s, 3H)。

II．本发明化合物活性测试实施例

测试实施例1：EGFR酪氨酸激酶抑制剂活性检测

ELISA法：酶反应底物多聚谷氨酸:酪氨酸(4:1)包被96孔酶标板，T-PBS(含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液)洗板5次，于37℃烘箱中干燥酶标版2小时。每孔先加入用反应缓冲液稀释的三磷酸腺苷溶液80μl，然后加入不同浓度梯度的待测化合物（化合物孔）或一定浓度的二甲亚砜溶液（阴性对照孔）10μl，最后加入用反应缓冲液稀释的蛋白酪氨酸激酶溶液10μl以启动反应或10μl的反应缓冲液作为无酶对照孔，置37℃摇床反应1小时，T-PBS洗板5次。加入抗磷酸化酪氨酸的单抗（PY99）100μl/孔，25℃摇床反应1小时，T-PBS洗板5次。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 100μl/孔，25℃摇床反应1小时，T-PBS洗板5次。加入2mg/ml的邻苯二胺OPD显色液，25℃避光反应10min。加入2M 硫酸溶液 50μl/孔中止反应，用可调波长式微孔板酶标仪Synergy H4读数，波长490nm。并进行数据整理计算抑制率，根据各浓度抑制率，通过非线性回归方法计算出各测试化合物对EGFR^L858R、EGFR^T790M/L858R和HER2的IC ₅₀值。

注：AZD9291购自上海岱岩化工有限公司

测试结果表明：实施例2化合物盐对HER2、EGFR突变 (如EGFR^L858R、EGFR^L858R/T790M等)具有良好的抑制活性。

测试实施例2：对EGFR敏感突变的人肺癌细胞PC-9(EGFR ex19del)、HCC827(EGFRE746_A750del)以及耐药突变的人肺癌细胞H1975(EGFR L858R/T790M)的增值抑制作用

磺酰罗丹明B蛋白染色法（SRB法）：取处于对数生长期的细胞接种在96孔板中(细胞浓度为5000个/孔；细胞悬液180μl/孔)，37℃、5% CO₂培养24H使细胞贴壁。将受试药物事先溶解在二甲亚砜中配制成10mM储存液，当检测时稀释到目的浓度的10倍，然后在接种细胞的96孔板中加入化合物20μl/孔，即到达目的浓度。每个浓度设3个复孔，并设空白对照。继续在37℃、5% CO₂中继续培养72H。终止培养，每孔加入50μl预冷（4℃）的50%三氯乙酸即TCA（终浓度10%），放置在4℃固定1H，用纯化水洗涤至少5次，空气中自然干燥或60℃烘箱干燥。用含1%冰乙酸的纯化水配制4mg/ml的磺酰罗丹明B即SRB，每孔加入100μl，室温染色1H，弃上清，用1%冰乙酸洗涤至少5次除去非特异结合，干燥待用。每孔加入150μl的10mM的三羟甲基氨基甲烷—盐酸缓冲溶液溶解，在510nm波长处测OD值，并进行数据整理计算抑制率，根据各浓度抑制率，计算半数抑制浓度IC50。

测试结果表明：实施例2化合物盐对EGFR敏感突变及耐药突变的肿瘤细胞具有很强的增殖抑制作用。

测试实施例3：对人鳞状细胞癌A431、人非小细胞肺癌细胞HCC827、人肺腺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。

观察本发明实施例2化合物盐和AZD9291对人鳞状细胞癌A431、人肺腺癌HCC827、人肺腺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用及其相应的安全情况。

肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm³)=0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)。

小鼠体重变化率(%)公式：体重变化率=当天体重/该动物D0体重×100%。

肿瘤生长抑制率TGI%：若肿瘤体积≥D0体积，公式为TGI%=[1-(肿瘤体积 –该肿瘤D0体积) / (当天对照组肿瘤体积 – 对照组D0肿瘤体积)] ×100%；若肿瘤体积<D0体积，公式为TGI%=（1-(肿瘤体积 –该肿瘤D0体积) /该肿瘤D0体积）×100%。

测试实施例3.1：对人鳞状细胞癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。

细胞培养：细胞复苏后，使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，并置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，细胞融合度约80%-90%时（对数生长期）传代扩增，培养至5个T175cm²培养瓶，收取对数生长期的细胞并计数，以供接种。

实验动物：BALB/c Nude裸鼠，12只，雌性，4-5周，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司。

实验方法：人鳞状细胞癌细胞A431以3*10⁶/0.2mL接种于BALB/c Nude小鼠右前背部皮下，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均约150-200mm³时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组。设3个实验组，分别为：0.5％甲基纤维素溶媒对照组，AZD9291 10mg/kg组，实施例2化合物盐10mg/kg组。分组后各组按照对应给药剂量给药，给药体积为10 μL/g，每天一次，连续21天。整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小，观察是否出现毒性反应。

3个实验组小鼠体重变化率见附图1，肿瘤生长抑制率TGI%见附图2。结果表明实施例2化合物盐对动物体重无影响，对人鳞状细胞癌A431裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用较弱，即本发明化合物具有较好的安全性。

测试实施例3.2：对人非小细胞肺癌HCC827裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。

细胞培养：细胞复苏后，使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，并置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，细胞融合度约80%-90%时（对数生长期）传代扩增，培养至24个T175cm²培养瓶，收取对数生长期的细胞并计数，以供接种。

实验动物：BALB/c Nude裸鼠，32只，雌性，4-5周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验方法：人非小细胞肺癌细胞HCC827以5*10⁶/0.1mL接种于BALB/c Nude小鼠右前背部皮下，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均约150-200mm³时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组。设4个实验组，分别为：20％聚乙二醇400+80%生理盐水溶媒对照组，实施例2化合物盐1mg/kg组、3mg/kg组和10mg/kg组。分组后各组按照对应给药剂量给药，给药体积为10 μL/g，每天一次，连续21天。整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小，观察是否出现毒性反应。

4组实验组小鼠体重变化率见附图3，肿瘤生长抑制率TGI%见附图4。实验结果表明实施例2化合物盐对人非小细胞肺癌细胞HCC827裸小鼠皮下移植瘤的生长具有较好的抑制作用，对动物体重无明显影响，显示出较好的安全性。

测试实施例3.3：对人肺腺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。

细胞培养：细胞复苏后，使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，并置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，细胞融合度约80%-90%时（对数生长期）传代扩增，培养至27个T175cm²培养瓶，收取对数生长期的细胞并计数，以供接种。

实验动物：BALB/c Nude裸鼠，32只，雌性，4-5周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验方法：人肺腺癌细胞H1975以5*10⁶/0.1mL接种于BALB/c Nude小鼠右前背部皮下，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均约150-200mm³时根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组。设4个实验组，分别为：20％聚乙二醇400+80%生理盐水溶媒对照组，实施例2化合物盐3mg/kg组、10mg/kg组和30mg/kg组。分组后各组按照对应给药剂量给药，给药体积为10 μL/g，每天一次，连续21天。整个实验过程中，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小，观察是否出现毒性反应。

4组实验组小鼠体重变化率见附图5，肿瘤生长抑制率TGI%见附图6。实验结果表明实施例2化合物盐对人肺腺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的生长具有较好的抑制作用，对动物体重无明显影响，显示出较好的安全性。

结合测试实施例3.1、测试实施例3.2、测试实施例3.3，表明实施例2化合物盐对人非小细胞肺癌HCC827、人肺腺癌H1975移植瘤的生长具有良好的抑制作用，而对野生型EGFR人鳞状细胞癌A431移植瘤的抑制作用相对较弱，本发明实施例2化合物盐具有良好的选择性，且具有较好安全性。

在本文中提及的所有文献均通过引用被并入本申请中。此外还应指明的是，在阅读了本申请的上述公开内容之后，本领域技术人员可以无需背离本发明的精神和范围，对本发明作出各种修饰、改动或修改，但这些变化形式同样都应落于本申请所附权利要求书所记载的范围。