阅读说明：本技术 一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法 (Cervical cell preservation solution, preparation method thereof and cervical cell preservation method ) 是由 高珂 岳乾 安顺 李振红 杜美 付光宇 吴学炜 苗拥军 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及细胞保存技术领域,特别涉及一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法。该宫颈细胞保存液按如下组分及配比制备而成：甲醇：50～70g；Tris-HCl溶液：30～50mL；EDTA·2Na：0.5～1.5g；NaCl：0.5～1.5g；proclin950：0.001～0.01mL；Proclin300：0.001～0.01mL。本发明宫颈细胞保存液能够维持宫颈脱落细胞内及感染细胞的病毒核酸完整性,对核酸DNA提供有效保护,防止核酸降解,有利于HPV-DNA检测。(The invention relates to the technical field of cell preservation, in particular to cervical cell preservation solution, a preparation method thereof and a cervical cell preservation method. The cervical cell preservation solution is prepared from the following components in parts by weight: methanol: 50-70 g; Tris-HCl solution: 30-50 mL; EDTA-2 Na: 0.5-1.5 g; NaCl: 0.5-1.5 g; proclin 950: 0.001-0.01 mL; proclin 300: 0.001-0.01 mL. The cervical cell preservation solution can maintain the integrity of virus nucleic acid in cervical exfoliated cells and infected cells, effectively protect nucleic acid DNA, prevent nucleic acid degradation and facilitate HPV-DNA detection.)

一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法

技术领域

本发明涉及细胞保存技术领域，特别涉及一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法。

背景技术

***是对女性健康造成危害且为女性生殖道常见的恶性肿瘤之一，而***的发生是长期的过程，癌前病变为病变的可逆期。现已有无数研究结果证实HPV持续感染与***及癌前病变密切相关，故HPV感染的早发现、早预防是阻断病变的关键。

虽然传统的巴氏涂片法具备诊断特异性高、简单易行且便宜等特点，但是灵敏度低、假阴性率高，同时还需要受过高等训练的细胞病理学家来解释其检测结果，受阅片者主观因素的影响。而直接针对病因的高灵敏度HPV-DNA/RNA检测在宫颈病变预防、筛查、诊治及随访中的优势日益显现。

目前市场上细胞保存液大都侧重于固定细胞结构，有利于保存细胞用于细胞学检测，但不能很好的适用于对细胞DNA样本的收集、储存或制备的技术要求。HPV-DNA/RNA检测对宫颈细胞保存液提出了更高的要求，不仅需要能够迅速固定白细胞、脱落上皮细胞等有检测意义的细胞，并能稀释样本中的粘液，减少对后续处理或检测的影响。现有公开专利中的细胞保存液或专用的宫颈细胞保存液不能有效保护细胞内核酸的完整性。因此，需要提供一种能够有效防止核酸降解的宫颈细胞保存液，从而有利于HPV-DNA/RNA检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法。该宫颈细胞保存液能够有效防止核酸降解，有利于HPV-DNA/RNA检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种宫颈细胞保存液，按如下组分及配比制备而成：

作为优选，该宫颈细胞保存液按如下组分及配比制备而成：

优选地，该宫颈细胞保存液按如下组分及配比制备而成：

上述细胞保存液组分中固定剂为甲醇，能够快速固定保存样本中白细胞、脱落上皮细胞等用于后续检测的细胞，同时助于胞内核酸的完整保存；

上述渗透压维持剂为NaCl溶液；

上述金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，在该保存液中是抗凝聚试剂，用于避免细胞堆积；

上述pH缓冲剂为Tris-HCl缓冲液，能够维持细胞保存液pH环境稳定；

上述非离子去污剂为Tritonx-100，利于降低样本中黏液造成的干扰；

上述防腐保鲜剂为Proclin950和Proclin300的混合物，可以有效地抑制细菌、真菌、酵母菌等微生物的生长，有利于延长保存液稳定时间。

作为优选，Tris-HCl溶液的浓度为1.0～2.0M。

优选地，Tris-HCl溶液的浓度为1.5M。

作为优选，Tris-HCl溶液的pH值为8.0～9.0。

优选地，Tris-HCl溶液的pH值为8.5。

本发明还提供了该宫颈细胞保存液的制备方法，包括：将Tris-HCl溶液、EDTA·2Na、NaCl、10％TritonX-100、proclin950、Proclin300混合，溶解后再加入甲醇，制成宫颈细胞保存液。

本发明还提供了一种宫颈细胞的保存方法，将宫颈细胞置于上述宫颈细胞保存液中，在-80℃～30℃条件下进行保存。

作为优选，保存的温度为-20℃～10℃。

本发明提供了一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法。该宫颈细胞保存液按如下组分及配比制备而成：甲醇：50～70g；Tris-HCl溶液：30～50mL；EDTA·2Na：0.5～1.5g；NaCl：0.5～1.5g；10％TritonX-100：0.1～0.3mL；proclin950：0.001～0.01mL；Proclin300：0.001～0.01mL。本发明具有如下优点：

1)本发明的宫颈细胞保存液能够维持宫颈脱落细胞内及感染细胞的病毒核酸完整性，对核酸DNA提供有效保护，防止核酸降解，有利于HPV-DNA检测。

2)本发明中的细胞保存液中缓冲液、抗凝剂等成分能够有效分散宫颈脱落细胞避免成团结块，利于液基细胞学涂片观察。

3)本发明的宫颈细胞保存液除了自身可室温长期保存，也可以长期室温长期保存宫颈脱落细胞样本，本发明采用的双防腐体系对样本提供了更有利的保存效果，便于样本的运输、保存及使用。

4)本发明中的细胞保存液组分去除核酸DNA提取中存在抑制的成分，并添加了非离子去污剂(TritonX-100)，有效降低样本粘稠度，增强样本漂洗程度，从而降低了DNA样本的提取难度。

5)本发明中的细胞保存液于-80℃～-20℃低温保存时，体系内水分不会出现结冰现象有效防止结晶伤害。

6)本发明的保存液技术简单、容易配制且操作方便。

7)本发明的细胞保存液成分简单、成本低。

附图说明

图1为采用对比例1保存液保存细胞加速前后荧光-PCR扩增结果折线图-HPV检测；

图2为采用对比例2保存液保存细胞加速前后的荧光-PCR扩增结果折线图-HPV检测；

图3为采用对比例3保存液保存细胞加速前后荧光-PCR扩增结果折线图-HPV检测；

图4为采用对比例4保存液保存细胞加速前后荧光-PCR扩增结果折线图-HPV检测；

图5为采用实施例1与对比例5-8保存液保存细胞加速前后荧光-PCR扩增结果折线图-HPV检测。

具体实施方式

本发明公开了一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本领域技术人员可以理解，尽管实施例配方中各组分重量单位是g或mL，但是也可以理解为重量份或体积份，即各组分之间满足比例即可。

本发明提供的宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

本实施例细胞保存液配方及配制方法，按下表组分称取和量取：

本实施例所述细胞保存液配制步骤为：

取1.5M Tris-HCl溶液40mL，调节pH至8.5后加入EDTA·2Na和NaCl及proclin950、Proclin300、10％TritonX-100，充分溶解后再加入醇类，制成细胞保存液。

实施例2

本实施例细胞保存液配方及配制方法，按下表组分称取和量取：

本实施例所述细胞保存液配制步骤为：

取1.5M Tris-HCl溶液45mL，调节pH至8.5后加入EDTA ·2Na和NaCl及proclin950、Proclin300、10％TritonX-100，充分溶解后再加入醇类，制成细胞保存液。

实施例3

本实施例细胞保存液配方及配制方法，按下表组分称取和量取：

本实施例所述细胞保存液配制步骤为：

取1.5M Tris-HCl溶液35mL，调节pH至8.5后加入EDTA·2Na和NaCl及proclin950、Proclin300、10％TritonX-100，充分溶解后再加入醇类，制成细胞保存液。

对比例1

本对比例细胞保存液配方及配制方法，按下表组分称取和量取：

本对比例所述细胞保存液配制步骤为：

先配制0.2mol/L NaOH和0.2mol/L KH₂PO₄溶液，将其与proclin300按上述配方混合，再加入醇类，混匀后加入超纯水至100mL，制成细胞保存液。

对比例2

本对比例细胞保存液配方及配制方法，按下表组分称取和量取：

本对比例细胞保存液配制步骤为：

先配制1M Taps溶液，调节pH至8.5后加入EDTA·2Na和NaCl，充分溶解后再加入醇类，制成细胞保存液。

对比例3

本对比例细胞保存液配方及配制方法，按下表组分称取和量取：

本对比例细胞保存液配制步骤为：

取1M Taps溶液40mL，调节pH至8.5后加入EDTA·2Na和NaCl，充分溶解后再加入醇类，制成细胞保存液。

对比例4

本对比例细胞保存液配方及配制方法，按下表组分称取和量取：

本对比例细胞保存液配制步骤为：取1.5M Tris-HCl溶液40mL，调节pH至8.5后加入EDTA·2Na和NaCl及10％TritonX-100、proclin950，充分溶解后再加入醇类，制成细胞保存液。

对比例5

CN101999343B表2：

在Milli-Q超纯水中，依次加入上述配方量的缓冲液、离子强度维持剂、将PH调整至8.0后，加入固定剂、固定剂辅助剂及漂洗剂。其中醋酸缓冲液配比为：100ml水中加入乙酸(CH3COOH)0.32g，乙酸钠(CH3COONa)12.89g)。

对比例6

CN107410287A表2保存液B1：

将各组分按上表用量混合，即得所述细胞保存液。

对比例7

CN108402033A实施例一：

无水乙醇28g；甲醇45g；抗凝剂-乙二胺四乙酸二钠EDTA 5g；PH缓冲液-磷酸缓冲盐溶液-15g；苯酚-1g；氯化钠-3g；甲醛-1g；黏液消化成分-二硫苏糖醇1.2g；红细胞裂解液0.8g。EDTA不易溶于水，可将PH缓冲液先调节至7.8，加热约70℃溶解EDTA后，再混合其他成分。

对比例8

CN102258003A实施例一：

本发明所述的一种液基细胞保存液的配制步骤为：

1配制磷酸钠缓冲液：用磷酸二氢钠和二水磷酸氢钠储存液混合，加水稀释至1000mL，量取618mL。

2在乙醇中加入乙二胺四乙酸钠，加热50-70℃充分溶解。

3在磷酸钠缓冲液中加入含乙二胺四乙酸二钠的乙醇，得到混合液。

4在混合液中加入氯化钠、氯化钾、甲醛、二硫苏糖醇、醋酸钙、醋酸镁，搅拌溶解。

5将溶液充分溶解后用冰醋酸调整PH值至6.5，制成液基细胞保存液。

试验例 HPV-DNA检测试验

取实施例1、对比例1-8的保存液，将宫颈细胞置于保存液中，在55℃加速条件下保存0-21天(d)。通过核酸提取获得上述样本核酸，利用HPV扩增试剂进行HPV-DNA荧光PCR检测，试验结果如下表和附图1-5：

表1对比例1-4保存液对应荧光-PCR扩增结果

表2实施例1与对比例5-8保存液对应荧光-PCR扩增结果

结论：根据阿伦尼乌斯公式，55℃加速14d大约为室温保存1年。上述试验结果表明，实施例1宫颈细胞保存液能够有效维持感染细胞核酸稳定，有利于感染细胞的HPV-DNA检测，保存效果好于其它对比例的保存效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。