阅读说明：本技术 Map3k8基因敲除pk-15细胞系的构建方法及其应用 (Construction method and application of PK-15 cell line knocked out by MAP3K8 gene ) 是由 郑海学 张克山 闫鸣昊 郝军红 �田宏 李丹 朱紫祥 茹毅 杨帆 张大俊 刘湘涛 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及MAP3K8基因敲除PK-15细胞系的构建方法及其应用。MAP3K8基因敲除的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8的保藏编号为CCTCC NO:C2019176。该细胞系的构建方法包括1：根据猪源MAP3K8基因序列分别设计两条sgRNA,将双链sg RNA与酶切后的lentiGuide-EGFP载体连接得到重组慢病毒表达质粒lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA；2：将重组慢病毒表达质粒、病毒包装辅助质粒共转染PK-15细胞；3：收集病毒液,过滤、超速离心浓缩纯化病毒；4：用感染复数MOI=30的慢病毒感染PK-15细胞,然后用超速流式细胞分选系统进行单细胞分选；5：将分选得到的单克隆细胞进行扩大培养并测序鉴定。该细胞系能够促进FMDV和SVV增殖,提高病毒产量,可用于FMDV和SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产,并可为研究MAP3K8在病毒感染过程中的作用机制提供有力工具。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to a construction method and application of a PK-15 cell line knocked out by a MAP3K8 gene. The preservation number of the PK-15 cell line PK-15-KO-MAP3K8 with the MAP3K8 gene knockout is CCTCC NO: C2019176. The construction method of the cell line comprises the following steps of 1: respectively designing two sgRNAs according to a swine MAP3K8 gene sequence, and connecting the double-stranded sg RNA with a digested lentiGuide-EGFP vector to obtain a recombinant lentivirus expression plasmid lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA; 2: co-transfecting the recombinant lentivirus expression plasmid and the virus packaging helper plasmid to a PK-15 cell; 3: collecting virus liquid, filtering, ultracentrifuging, concentrating and purifying virus; 4: infecting PK-15 cells with lentiviruses with multiplicity of infection MOI =30, and then performing single cell sorting with an ultra-speed flow cytometric sorting system; 5: and carrying out amplification culture and sequencing identification on the sorted monoclonal cells. The cell line can promote the proliferation of FMDV and SVV, improve the virus yield, can be used for large-scale cell culture and production of FMDV and SVV vaccine strains, and can provide a powerful tool for researching the action mechanism of MAP3K8 in the virus infection process.)

MAP3K8基因敲除PK-15细胞系的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及MAP3K8基因敲除PK-15细胞系的构建方法及其应用。

背景技术

猪肾上皮细胞PK-15，来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞。该细胞对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等的制备。

TPL2是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也被称为COT或MAP3K8，在未受刺激时TPL2与p105和ABIN2形成复合物以保持非活性状态(Gantke,T.,S.Sriskantharajah,andS.C.Ley,Regulation and function of TPL-2,an IkappaB kinase-regulated MAPkinase kinasekinase.Cell Res,2011.21(1):p.131-45.)。当受到刺激后能通过TLR，TNFR和IL1R等多种受体激活下游ERK、JNK、p38和NF-κB等多种信号转导途径；还能刺激巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞等多种先天性免疫细胞产生IFN-γ，TNF-α等大量细胞因子(Gantke T,S.S.,Sadowski M,Ley SC.,IκB kinase regulation of the TPL-2/ERK MAPKpathway.2012.)。TPL2在调节CD4+T细胞分化产生不同Th细胞谱系的过程中也是必不可少的，是先天性免疫、炎症和肿瘤的重要参与者。

CRISPR-Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因组编辑技术。该技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas获得性免疫系统，后经人工改造而逐渐发展起来(四川农业大学李沛哲.CRISPR/Cas9技术的发展与应用[N].科学导报,2019-08-20(B02).)。细菌在CRISPR和Cas9的帮助下，可以经由小RNA分子的引导，靶标和沉默入侵者遗传信息的关键部分。CRISPR-Cas9基因组编辑技术是通过一段gRNA特异性识别靶基因序列，并引导Cas9核酸内切酶在靶定位点剪切双链DNA，随后，细胞的非同源末端连接修复机制(NHEJ)重新连接断裂处的基因组DNA，并引入***或缺失突变。与ZFN和TALEN技术相比，CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用在各物种中，是目前使用最广泛的基因编辑技术。

发明内容

本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8，该细胞系能够促进***病毒(FMDV)和塞尼卡谷病毒(SVV)的增殖，提高病毒产量。可用于FMDV和SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产，并可为研究MAP3K8在病毒感染过程中的作用机制提供有力工具。

第一方面，本发明提供的敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8，其保藏编号为CCTCC NO:C2019176。

第二方面，本发明还提供了敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8的构建方法，具体包括如下步骤：

步骤1：引物设计与质粒构建：根据猪源MAP3K8基因序列，分别设计两条sgRNA，将双链sg RNA与酶切后的lentiGuide-EGFP载体进行连接，得到重组慢病毒表达质粒lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA；

具体的，使用T4 DNA连接酶将双链sg RNA与酶切后的lentiGuide-EGFP载体进行连接。

步骤2：质粒转染：将lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒表达质粒、病毒包装辅助质粒共转染PK-15细胞；

具体的，所述转染过程按照脂质体Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。

转染前，PK-15细胞用添加10％的胎牛血清、0.2mg/mL链霉素和200IU/mL青霉素的DMEM培养基进行培养。

步骤3：慢病毒浓缩：收集病毒液，过滤、超速离心浓缩纯化病毒，保存备用。

慢病毒感染前进行慢病毒滴度测定：病毒原液梯度稀释后感染PK-15细胞，并计算病毒滴度。

步骤4：慢病毒感染及流式分选：用感染复数MOI＝30的慢病毒感染PK-15细胞，然后用超速流式细胞分选系统进行单细胞分选。

步骤5：单克隆细胞的培养及测序鉴定：将分选得到的单克隆细胞进行扩大培养并测序鉴定单细胞克隆。

具体的，所述扩大培养为：将分选得到的单克隆细胞接种至96孔板中，长满后传代至48孔板，依次扩大培养传至24孔板、12孔板、6孔板和T25培养瓶中。

进一步的，所述sgRNA的序列为：

P-MAP3K8-sgRNA1 Forward：5’-CACCGTTCCATAATGTCTATTACAT-3’，

P-MAP3K8-sgRNA1Reverse：5’-AAACATGTAATAGACATTATGGAAC-3’；

P-MAP3K8-sgRNA2Forward：5’-CACCGAGATCCCAGATTCCTGGGGT-3’，

P-MAP3K8-sgRNA2Reverse：5’-AAACACCCCAGGAATCTGGGATCTC-3’；

步骤1中所述lentiGuide-EGFP载体使用BsmBⅠ酶进行酶切后与sg RNA进行连接。

第三方面，本发明提供了敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8在病毒感染作用机制研究中的应用。

进一步的，所述病毒为FMDV或SVV。

第四方面，本发明提供了敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8在分离和培养FMDV或SVV中的应用。

第五方面，本发明提供了敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8在FMDV或SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明利用CRISPR-Cas9系统构建了敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8，该细胞系的建立为研究MAP3K8在病毒感染过程中的作用机制提供有力工具。

2、敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8，由于***或缺失某些片段而引起移码突变，故不能正确的表达MAP3K8蛋白。由于MAP3K8蛋白具有抗病毒作用，故FMDV病毒和SVV病毒在野生型的PK-15细胞中不能大量的增殖。而敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8由于不能正确的表达MAP3K8蛋白，故有利于FMDV病毒或SVV病毒在该细胞系中增殖，获得更大量高滴度的病毒，可用于FMDV或SVV疫苗株的大规模细胞化培养和生产。

附图说明

图1为本发明中构建的lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒表达载体结构图。a为lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA1，b为lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA2。

图2为本发明中荧光显微镜下lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒表达载体转染PK-15细胞情况图(透射光和荧光检测,×200)。

图3为本发明中PK-15-KO-MAP3K8细胞系#1，#19，#20号克隆MAP3K8基因***、缺失突变型分析图。a为#1克隆，b为#19克隆，c为#20克隆。

图4为本发明中Western blotting检测PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中MAP3K8蛋白丰度图。

图5为本发明中绝对定量检测FMDV在PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中病毒拷贝数图。

图6为本发明中绝对定量检测SVV在PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中病毒拷贝数图。

图7为本发明中相对定量检测FMDV在PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中复制的转录水平图。

图8为本发明中相对定量检测SVV在PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中复制的转录水平图。

图9为本发明中Western blotting检测FMDV在PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中复制的蛋白丰度图。

图10为本发明中Western blotting检测SVV在PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中复制的蛋白丰度图。

图11为本发明中荧光显微镜下观察PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中FMDV的荧光表达量及对应的光密度值图。

图12为本发明中荧光显微镜下观察PK-15-WT-MAP3K8和PK-15-KO-MAP3K8细胞中SVV的荧光表达量及对应的光密度值图。

附图中WT表示对照PK-15-WT-MAP3K8细胞系，KO表示PK-15-KO-MAP3K8细胞系。

图中*表示p<0.05；***表示p<0.001。

保藏信息：

保藏时间：2019年7月23日；

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

保藏编号：CCTCC NO:C2019176；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学；

分类命名：猪肾上皮细胞PK-15-KO-MAP3K8。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所用材料来源：

细胞与病毒：猪肾细胞(PK-15)购自中国科学院昆明动物研究所。猪肾细胞(PK-15)在含10％DMEM培养基中培养，培养基添加10％热灭活胎牛血清(HyClone)、1％链霉素(0.2mg/mL)和青霉素(200IU/mL)。所有细胞均保持在37℃，CO₂含量为5％恒温培养箱中。***毒株A/GDMM/CHA/2013、猪塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)毒株由兰州兽医研究所***流行病学团队保存。

试剂和抗体：0.25％EDTA-Trypsin、Opti-MEM、DMEM培养基及胎牛血清均购自Gibco公司；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、0.1MDTT和反转录酶M-MLV均购自Life Invitrogen公司；细胞培养瓶、培养板及移液管等细胞培养耗材均购自Coring公司；磷酸盐缓冲液(PBS溶液pH7.4，0.0067M)购自Hyclone公司；RAPI细胞裂解液和PMSF均购自碧云天公司；蛋白质Marker购自Thermo Scientific公司；RNA抽提试剂Trizol、SYBR Permix Ex Taq II、Trans5α感受态、LA Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶BsmBⅠ、T4 DNA连接酶、RNA酶抑制剂(RRI)、Oligo(dT)引物、Random随机引物、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)和核酸Marker均购自宝生物工程大连有限公司；用于检测CRISPR/Cas9基因敲除效率的qRT-PCR引物合成于奥科生物科技有限公司。本发明使用的商业抗体包括：HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(Proteintech)、HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Proteintech)、抗MAP3K8多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)、抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)。抗FMDV多克隆抗体和抗SVV多克隆抗体由兰州兽医研究所***流行病学团队制备，制备方法参考(陈飞.***病毒3C蛋白多克隆抗体的制备与鉴定[D].山东农业大学,2018.)和(胡涛等.教学用纯化水疱性口炎病毒抗原制备兔多克隆抗体结果分析[J]，卫生职业教育，2019(6)：112-114)。免疫荧光兔二抗购自CellSignaling Technology(CST)公司。

仪器：ABI梯度PCR仪、CO₂恒温培养箱、QuanStudio3/5定量PCR仪，700系列-80℃冰箱均购自美国Thermo公司；激光共聚焦显微镜购自德国LEICA公司；GLOMAX化学发光检测仪购自PROMEGA公司；电热恒温水浴锅购自上海一恒仪器公司；5804R高速冷冻离心机、小型高速离心机均购自德国Eppendorf公司；凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司；制冰机购自FOCUSUN公司；紫外可见分光光度计购自上海昂拉仪器公司；DYY-12型稳压电泳仪购自北京六一仪器厂；生物安全柜购自苏州苏净集团。

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

1、引物设计与质粒构建

参考NCBI数据库中猪源MAP3K8基因(Gene ID为100622217)，对蛋白质序列进行分析选择Exon2中保守区域进行靶点筛选，并在Ensembl基因组数据库上(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Transcript/Summary？db＝core；g＝ENSSSCG00000020705；r＝10:40709927-40746355；t＝ENSSSCT00000033089)，根据Cas9靶点设计原则选择得分较高的作为sg RNA备选序列，分别设计了Exon2两个靶点的sg RNA后在其两端加入BsmBⅠ位点切割后产生的互补黏端，设计获得上下游sg RNA序列，见表1。将双链的sg RNA与酶切后的lentiGuide-EGFP载体(慢病毒表达载体lentiGuide-EGFP载体由南方模式生物科技股份有限公司提供)混合，在T4 DNA连接酶的作用下16℃连接过夜，将MAP3K8sgRNA Oligo双链DNA连接到线性化载体内。将连接反应液转化至Trans5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性平板，37℃过夜。挑取单克隆菌，在具有氨苄抗性的LB培养基中培养，37℃恒温箱震荡培养，12h后提取质粒。载体构建完成后送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序鉴定。构建的lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒表达质粒lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA1和lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA2的结构如图1所示。

表1猪MAP3K8-sg RNA的引物序列

引物名称	引物序列(5'-3')
		P-MAP3K8-sgRNA1 Forward	CACCGTTCCATAATGTCTATTACAT
P-MAP3K8-sgRNA1 Reverse	AAACATGTAATAGACATTATGGAAC
		P-MAP3K8-sgRNA2 Forward	CACCGAGATCCCAGATTCCTGGGGT
P-MAP3K8-sgRNA2 Reverse	AAACACCCCAGGAATCTGGGATCTC

2、细胞培养和质粒转染

将PK-15细胞用DMEM培养基进行培养，培养基中添加10％的胎牛血清、0.2mg/mL链霉素和200IU/mL青霉素。于37℃恒温和5.0％CO₂气体的饱和湿度培养箱中静置培养。将生长状态良好的PK-15细胞接种至6孔细胞培养板中培养，每个孔中传1×10⁵个细胞，当细胞密度达到70％～80％时,按照脂质体Lipofectamine 2000转染试剂说明书将lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒表达质粒(lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA1和lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA2)、病毒包装辅助质粒共转染PK-15细胞。质粒与Lipofectamine 2000试剂(两者按照比例为1μg:2μl)分别加至Opti-MEM中，将两者混合静置15min后，将Opti-MEM混合物直接加至细胞中；将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。48h后在显微镜下观察荧光表达情况，发现有大量荧光蛋白的表达，表明质粒成功转染PK-15细胞，如图2所示。

3、病毒浓缩

转染后24h第一次收获病毒(即未纯化的细胞上清液)，放置4℃冰箱中保存，皿中更换培养基继续培养。转染后48h第二次收获病毒，与第一次收集的上清合并。将收取的病毒液使用0.22μm滤膜进行过滤，4℃超速离心浓缩纯化病毒，分装保存。

4、慢病毒滴度测定

测定前一天，将PK-15细胞接种96孔板，病毒感染前显微镜下确认细胞状态，细胞密度均匀，形态正常，无污染。将病毒原液梯度稀释后，依次加入96孔板中，做好标记后置于CO₂培养箱中培养。病毒感染后约24h按低浓度组往高浓度组的原则，依次补液，继续培养。感染后72h，更换含有puromycin的培养基，继续培养24h后对所有组拍照，计算病毒滴度。病毒滴度(TU/mL)＝GFP阳性细胞数/稀释倍数。本实施例构建的病毒滴度为1×10⁹TU/mL。

5、慢病毒感染及流式分选

将生长状态良好的PK-15细胞接种在6孔板中，每孔1×10⁵个细胞，当细胞密度达到70％～80％时，按照慢病毒感染复数MOI＝30进行感染。弃去细胞上清液，加入lentiGuide-EGFP-MAP3K8-sg RNA慢病毒与无血清培养基的混合液，加入Polybrene至终浓度为6μg/mL。12h后更换细胞上清为新鲜DMEM培养基，继续培养72h。用PBS洗涤细胞2次后，加入0.25％EDTA-Trypsin，37℃消化2min，800rpm，5min，加入1mL DMEM培养基制成单细胞悬液。利用超速流式细胞分选系统进行单细胞分选。

6、单克隆细胞的培养及测序鉴定

将分选的单克隆细胞接种至96孔板中，2～3天换一次液，待96孔板长满后传代至48孔板，依次扩大培养传至24孔板、12孔板、6孔板和T25培养瓶中。将扩大培养的单克隆细胞按1×10⁵的密度传至6孔板中，待细胞密度长到约90％收获细胞。采用Triozl裂解法提取单克隆细胞系总RNA，并反转录为cDNA模板进行PCR扩增。然后设计引物扩增MAP3K8基因的全长，引物序列见表2。将PCR产物送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序鉴定碱基***或者缺失情况。共选取23株阳性克隆进行序列分析。测序后与野生型细胞株中MAP3K8基因序列进行序列比对分析，以检查***或缺失突变。测序结果显示，阳性克隆的DNA序列存在一定程度的***和缺失，说明本实施例所构建的携带Cas9和MAP3K8 sg RNA1+sg RNA2的慢病毒已对PK-15细胞MAP3K8基因进行有效的定点切割，进而造成了细胞基因组的错配修复。在挑选的23个单克隆中，#1、#19和#20号阳性克隆为单克隆细胞系。敲除MAP3K8的单克隆细胞株#1存在2个单碱基的***和2个碱基的缺失；敲除MAP3K8的单克隆细胞株#19存在3个碱基的缺失；敲除MAP3K8的单克隆细胞株#20存在2个碱基的缺失，见图3。

表2猪MAP3K8基因的PCR扩增引物

引物名称	引物序列(5'-3')
		MAP3K8 Forward	GGACAGCAGGTGAAACGCATCT
MAP3K8Reverse	CCACAGCCATAGCCACAACC

7、敲除MAP3K8基因的PK-15细胞系PK-15-KO-MAP3K8蛋白水平验证

为了验证MAP3K8基因敲除是否对PK-15-KO-MAP3K8细胞系蛋白质表达水平有影响，采用Western blotting法检测在PK-15-KO-MAP3K8细胞系和对照PK-15-WT-MAP3K8细胞系中MAP3K8蛋白质表达水平。将细胞扩大培养后，用PBS洗涤细胞并加入含PMSF的RAPI细胞裂解液以及1×蛋白上样缓冲液，将细胞刮下放于98℃金属浴加热10min，然后10000rpm离心10min，取上清。经10％SDS-PAGE分离再经转移电泳将电泳分离的蛋白条带转移到NC膜上。NC膜用5％脱脂奶粉溶液室温封闭1～1.5h；用MAP3K8抗体(1：1000稀释)和β-actin抗体(1：5000稀释)分别与NC膜室温共孵育过夜；1×TBST洗涤孵育后的NC膜4次(8min/次)；然后用HRP标记的山羊抗兔IgG(1：5000稀释)和山羊抗小鼠IgG(1：5000稀释)的二抗孵育液与NC膜室温孵育1h；用1×TBST洗涤NC膜4次(8min/次)；使用全自动化学发光成像分析系统对电泳结果进行拍照及分析。结果显示野生型PK-15-WT-MAP3K8细胞中MAP3K8表达正常，而MAP3K8敲除的单克隆细胞株#1、#19和#20中并未检测到MAP3K8的表达，内参β-actin表达量正常且基本一致，见图4，说明本实施例成功构建了MAP3K8基因敲除细胞株。

8、细胞培养和接毒

将PK-15-KO-MAP3K8和PK-15-WT-MAP3K8细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，自复苏后传代2～3代，待细胞状态稳定后消化接种在6孔板中，每孔1×10⁵个细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中，待细胞长至70％～90％时，用无血清的DMEM将细胞清洗两遍，以去除细胞中残留的血清。用无血清的DMEM将毒液稀释，之后将稀释好的毒液按照适当的体积加入到细胞中，置于37℃、5％CO₂培养箱孵育1h之后，弃去毒液换成2％DMEM维持液，继续培养。

9、绝对定量验证FMDV和SVV在PK-15-KO-MAP3K8上的复制情况

FMDV和SVV接毒后0h，8h，16h收取细胞，用Triozl裂解法提取细胞的总RNA，然后利用扩增FMDV和SVV3D蛋白保守区域的绝对定量引物FMDV-3D-F/R，SVV-3D-F/R，以及FMDV和SVV的3D蛋白的探针对提取的全基因组RNA进行绝对定量检测，测定FMDV和SVV的拷贝数，引物序列详见表3。从图5中可以看出在接毒后8h、16h时收取的样品中，PK-15-KO-MAP3K8细胞中FMDV的拷贝数远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中FMDV的拷贝数；图6显示PK-15-KO-MAP3K8细胞中SVV的拷贝数远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中SVV的拷贝数。这是由于MAP3K8蛋白具有抗病毒作用，PK-15-KO-MAP3K8不能正确的表达MAP3K8蛋白，故而有利于FMDV和SVV病毒大量增值。也就是说与PK-15-WT-MAP3K8相比，PK-15-KO-MAP3K8细胞在FMDV和SVV感染后FMDV和SVV的复制量更多。这表明PK-15-KO-MAP3K8细胞通过敲除MAP3K8进而促进了FMDV和SVV病毒的复制。

表3绝对定量引物序列

引物名称	引物序列(5'-3')
		FMDV-3DForward	CACTGGTGACAGGCTAAGG
FMDV-3D Reverse	CCCTTCTCAGATTCCGAGT
		FMDV 3D探针	FAM-TCCTTTGCACGCCGTGGGAC-TAMRA
SVV-3D Forward	AGAATTTGGAAGCCATGCTCT
		SVV-3DReverse	GAGCCAACATAGARACAGATTGC
SVV3D探针	FAM-TTCAAACCAGGAACACTACTCGAGA-BHQ1

10、相对定量验证FMDV和SVV在PK-15-KO-MAP3K8上的复制情况

FMDV和SVV接毒后0h，8h，16h收取细胞，用Triozl裂解法提取细胞的总RNA，并反转录为cDNA进行相对定量验证。利用扩增FMDV和SVV3D蛋白的相对定量引物FMDV-F/R、SVV-F/R分别对反转录的cDNA进行相对定量检测，测定FMDV和SVV转录水平的变化，引物序列详见表4。结果如图所示，在接毒后8h、16h时收取的样品中，PK-15-KO-MAP3K8细胞中FMDV mRNA表达量远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中FMDV mRNA表达量(图7)；PK-15-KO-MAP3K8细胞中SVVmRNA表达量远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中SVVmRNA表达量(图8)。也就是说PK-15-KO-MAP3K8细胞与PK-15-WT-MAP3K8相比能够显著促进FMDV和SVV的复制，这与绝对定量的结果相符。

表4 qPCR引物序列

引物名称	引物序列(5'-3')
		P-GAPDHForward	ACATGGCCTCCAAGGAGTAAGA
P-GAPDHReverse	GATCGAGTTGGGGCTGTGACT
		FMDVForward	TGGGACCATACAGGAGAAGT
FMDVReverse	GTAGCTTGGAATCTCGAAGAGG
		SVVForward	AGAATTTGGAAGCCATGCTCT
SVVReverse	GAGCCAACATAGARACAGATTGC

11、Western blotting验证FMDV和SVV在PK-15-KO-MAP3K8上的复制情况

FMDV和SVV接毒后0h，8h，16h收取细胞，用上述方法处理PK-15-KO-MAP3K8和PK-15-WT-MAP3K8细胞样品，并进行Western blotting实验。结果如图所示，在接毒后8h、16h时收取的样品中，PK-15-KO-MAP3K8细胞中FMDV的结构蛋白VP1，VP2和VP3的丰度远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中FMDV的结构蛋白VP1，VP2和VP3的丰度(图9)；PK-15-KO-MAP3K8细胞中SVV的结构蛋白VP1，VP2和VP3的丰度远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中SVV的结构蛋白VP1，VP2和VP3的丰度(图10)。

12、间接免疫荧光实验

将PK-15-KO-MAP3K8和PK-15-WT-MAP3K8细胞分别铺于20mm的玻璃小皿中，待细胞长至70％～80％时，用MOI＝2的FMDV和SVV病毒感染；接毒后0h、8h、16h收取细胞，用1×PBS清洗3次；用4％的多聚甲醛(每皿1mL)室温避光固定1h；用1×PBS清洗3次，5min/次(轻加1×PBS，防止细胞被冲起来)；用0.2％Triton X-100(100mL PBS+200μLTriton100)室温通透1h；用1×PBS洗涤3次，5min/次；用5％BSA(5％BSA：10mL+0.5g BSA)37℃封闭1h；吸取封闭液，加入用5％BSA稀释的一抗，4℃过夜；用1×PBST清洗三次，10min/次，加入用1×PBST(1×PBST：100mL 1×PBS+50μLTween20)稀释的荧光素标记二抗(免疫荧光兔二抗)，37℃孵育1h；1×PBST清洗三次，10min/次，每皿加100μL抗荧光衰减封片剂封片(含DAPI)；使用激光共聚焦仪器观察荧光，并保存图片。结果如图所示，在接毒后8h、16h时收取的样品中，PK-15-KO-MAP3K8细胞中FMDV的VP1，VP2和VP3病毒粒子的荧光表达量均远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中FMDVVP1，VP2和VP3病毒粒子的荧光表达量(图11)；PK-15-KO-MAP3K8细胞中SVVVP1，VP2和VP3病毒粒子的荧光表达量均远高于PK-15-WT-MAP3K8细胞中SVV的VP1，VP2和VP3病毒粒子的荧光表达量(图12)。随后利用ImagePro-Plus软件对FMDV和SVV的荧光表达量进行量化分析。

13、病毒滴度TCID₅₀测定

将FMDV和SVV分别感染PK-15-KO-MAP3K8和PK-15-WT-MAP3K8细胞，待细胞病变量达到50％～60％收取病毒毒液。反复冻融三次后，用无血清的DMEM将获得的FMDV和SVV病毒进行10^-2～10^-9倍梯度稀释，用各稀释度毒液分别接种96孔细胞培养板中长满单层的PK-15-KO-MAP3K8和PK-15-WT-MAP3K8细胞，每个稀释度接种8个孔，每个孔0.1mL。置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养并观察4天，每隔半日观察记录细胞病变(CPE)情况，根据Reed-Muench法计算扩增病毒的TCID₅₀。按Reed-Muench法测定FMDV病毒的TCID₅₀，PK-15-WT-MAP3K8细胞的TCID₅₀为10^-3.6/0.1mL，PK-15-KO-MAP3K8细胞的TCID₅₀测定结果为10^-4.58/0.1mL，见表5～6。按Reed-Muench法测定SVV病毒的TCID₅₀，PK-15-WT-MAP3K8细胞的TCID₅₀为10^-6.8/0.1mL。PK-15-KO-MAP3K8细胞的TCID₅₀测定结果为10^-8.4/0.1mL，见表7～8。由此可见与PK-15-WT-MAP3K8细胞相比，使用PK-15-KO-MAP3K8细胞能够获得更高滴度的FMDV和SVV。

表5 PK-15-WT-MAP3K8细胞扩增的FMDV的TCID₅₀

表6PK-15-KO-MAP3K8细胞扩增的FMDV的TCID₅₀

表7 PK-15-WT-MAP3K8细胞扩增的SVV的TCID₅₀

表8 PK-15-KO-MAP3K8细胞扩增的SVV的TCID₅₀

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式。以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，在权利要求的范围内做出各种变形或修改，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> MAP3K8基因敲除PK-15细胞系的构建方法及其应用

<130> 无

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

caccgttcca taatgtctat tacat 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

aaacatgtaa tagacattat ggaac 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

caccgagatc ccagattcct ggggt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

aaacacccca ggaatctggg atctc 25