一种大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子及其应用
阅读说明：本技术 一种大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子及其应用 (Lotus bean 12GmNCED1 gene salt-induced promoter and application thereof ) 是由 向凤宁 王禄利 李朔 刘振华 郑晓健 于 2019-12-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子,该启动子的核苷酸序如SEQ ID NO:1所示或与SEQ ID No:1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性,且具有相同功能的DNA序列。本发明还公开了该基因启动子在盐胁迫下提高报告基因在拟南芥中的表达的应用。实验证明,在盐诱导下,本发明所述的启动子能上调驱动报告基因在转基因拟南芥中的表达,此为GmNCED1基因耐盐调控机制研究,为获得通用型的盐诱导型启动子提供了序列材料,也为其用于培育抗盐作物品种提供了基础。(The invention discloses a salt-induced promoter of a soybean lotus 12GmNCED1 gene, wherein the nucleotide sequence of the promoter is shown as SEQ ID NO. 1 or has more than 90% homology with the nucleotide sequence shown as SEQ ID NO. 1, and has DNA sequences with the same functions. The invention also discloses application of the gene promoter in improving the expression of a reporter gene in arabidopsis thaliana under salt stress. Experiments prove that under the salt induction, the promoter can up-regulate the expression of a driving reporter gene in transgenic arabidopsis, so that the research on a salt tolerance regulation mechanism of the GmNCED1 gene is realized, a sequence material is provided for obtaining a universal salt-induced promoter, and a foundation is provided for the application of the promoter in cultivating salt-resistant crop varieties.)
技术领域
本发明涉及一种启动子，尤其涉及一种大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子及其应用。
背景技术
大豆(Glycine max.)含有丰富的植物蛋白、脂肪和多种对人体有益的活性物质，是重要的蛋白质、油脂及保健品活性物质的重要来源，同时是食品、饲料等多种加工工业的优质原料，在国民经济中处于重要的地位。大豆，豆科(Fabaceae)，大豆属(Glycine)，属于淡土植物，耐盐性较差，土地高盐碱含量限制了大豆种植业的发展(王遵亲等，1993)。
转录因子通过与下游基因启动子上的顺式作用相互作用调节基因的表达模式，参与生物体的各项生理活动，顺式作用元件的研究对掌握生物体整个调控网络有重要意义。9－顺式－环氧类胡萝卜素双加氧酶9－cis－epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)属于类胡萝卡素双加氧裂解酶(carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs)家族成员，被认为是植物体内ABA合成途径中最关键的限速酶(Bao-Cai
利用逆境诱导型启动子驱动抗逆基因在转基因植物中表达是培育抗逆作物新品种的有效方法。目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，对于新的抗逆相关启动子的发现、克隆、顺式作用元件分析以及与顺式元件相互作用的转录因子的研究仍然是今后研究的重要方向。目前研究较深入的有：脱落酸响应元件(ABA-responsive element,ABRE)、乙烯响应元件(ethylene-responsive element,ERE)、茉莉酸类物质应答元件(jasmonate-responsive element,JRE)、低温响应元件(low-temp rature reponsiveelement,LTRE)和干旱应答元件(dehydration-responsive element,DRE)等(朱丽萍,于壮,等.植物逆境相关启动子及功能.遗传.2010,32(3):229-234)。NCED相关基因往往对多种逆境胁迫响应，其主要原因是基因启动子上含有多种逆境胁迫相关的顺式作用元件，如：茉莉酸甲酯响应元件，厌氧胁迫相关相应元件，ABA响应元件等。通过对逆境相关的NCED基因启动子研究可以得到受多种胁迫诱导的启动子，对构建有效的逆境诱导型启动子有重要意义。
通过比较大豆材料在盐和非盐条件下的基因表达谱变化，发现了GmNCED1基因在盐处理下表达量的显著变化，将该基因的过表达载体转入模式生物拟南芥中，使转基因拟南芥获得了表达GUS报道基因的能力。然而，NCED基因的调控基因和参与的信号通路并十分不明确，研究NCED基因盐诱导启动子可以帮助更好地阐释NCED基因的功能，同时研究GmNCED1的盐诱导特性可为获得通用型的盐诱导型启动子提供重要参考，将来可用于转基因耐盐作物的培育。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子及其应用。
本发明所述的大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子，其特征在于：所述启动子的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：
a)序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；
b)与序列表中SEQ ID No:1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
本发明还公开了含有上述大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子的报告基因GUS表达载体pGmNCED1::pBGWFS7。
本发明所述大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子受盐胁迫诱导高效启动目标基因表达的应用。
本发明所述大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子在培育耐盐转基因植物中的应用。
其中：所述植物优选拟南芥或大豆。
本发明公开了一种大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子，是在大豆菏豆12GmNCED1植株中克隆获得。申请人利用Gateway系统，经过BP、LR反应，将12GmNCED1基因启动子连接到GUS报告基因表达载体pBGWFS7(见图2)上；将pGmNCED1::pBGWFS7载体转入农杆菌菌株GV3101中，通过转化的农杆菌菌株转入模式植物拟南芥中，以验证GmNCED1基因启动子功能。证实：在盐诱导下，本发明所述的启动子能上调驱动报告基因在转基因拟南芥中的表达。
本发明有益效果体现在：本发明通过克隆得到了大豆菏豆12GmNCED1基因启动子，并驱动GUS报告基因在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥具备表达GUS基因的能力，并且在盐诱导情况下具有更强的表达能力。通过拟南芥转染，经过比较分析证明，转基因拟南芥能在盐诱导下较非盐条件下能更高效的表达报告基因。预示本发明所述的GmNCED1基因启动子可广泛用于培育耐盐转基因植物品种。
附图说明
图1GmNCED1基因启动子克隆电泳图
其中：M为Marker，泳道1、2为启动子DNA。
图2为pBGWFS7.0载体示意图。
图3为pGmNCED1::GUS转基因拟南芥GUS染色结果
其中：所拍摄照片为转基因拟南芥全株的染色结果，可以观察到，其表达组织部位主要位于拟南芥的根中，并且在外施加50mmol Nacl浓度下，处理12小时以后，GUS信号表达比不加盐处理较强。其中A为不加盐处理的染色情况，B为盐处理下的染色情况。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1大豆GmNCED1基因启动子的获得
根据NCBI网站上查到的GmNCED1基因转录起始位点ATG上游1776bp序列，设计启动子引物(F：5’CCTTTTCAACCACTAAACATCCTT3’，R：5'GGTGAATGGTTTTTGTTTCTAATTT3')。利用CTAB法提菏豆12基因组DNA，将提取的基因组DNA稀释到100ug/ul，用作扩增启动子模板。利用高保真酶PrimerSTAR(Takara)，扩增GmNCED1基因启动子。
1.1大豆菏豆12基因组DNA提取
(1)将CTAB提取液水浴预热到65℃；
(2)将菏豆12植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末；
(3)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml预热的CTAB提取液，轻柔颠倒混匀，65℃水浴30min；
(3)12,000rpm，离心10min，将0.6ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，待提取液降低到室温，再加入0.36ml酚/氯仿/异戊醇(24:23:1)轻柔混匀5min，室温放置10min使液体分层；
(4)12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，轻柔上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；
(5)12,000rpm，离心10min，弃上清，加入1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，弹起沉淀，12,000rpm，离心5min，重复两次；
(6)弃上清，开盖干燥DNA约10min，加入50μl灭菌水，在60℃中充分溶解RNA10min；
(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A260/A280达到1.7-2.0，A230/A260达到2.0-2.2，并将提取的DNA吸取10μl浓度稀释到100μg/μl用作PCR模板，其他放置-20℃备用。
1.2GmNCED1基因启动子克隆
高保真酶PrimerSTAR扩增的反应体系如下(50μl体系)：
扩增条件如下：
反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图1所示。
1.3克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)
1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；
2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；
3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；
4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；
5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；
6)空柱，12000rpm，离心2min；
7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；
8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。
1.4.1PCR扩增含有attb接头的GmNCED1基因启动子片段
(1)高保真酶PrimerSTAR进行Gateway系统的第一轮扩增(20μl体系)：
扩增条件如下：
1.4.2克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)(同1.3)
1.5连接GmNCED1启动子与pdnor221载体
利用gateway(Thermo Scientific)系统，反应体系如下(20μl体系)：
25℃过夜连接。
1.6大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)
(1)将1-5μl质粒DNA或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；
(2)42℃，温水浴热激90sec，立即冰浴2-3min；
(3)加入1ml LB培养基，37℃培养40-50min；
(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；
(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。
1.7大肠杆菌PCR验证
反应体系如下(20μl体系)：
扩增条件如下：
反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
1.8阳性克隆摇菌提质粒
挑取含有重组质粒的阳性单菌落于1.5ml EP管中用含有kan(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后接种200ul于装有20ml LB(含有50mg/Lkan)的100ml锥型瓶中过夜摇，然后吸取4ml菌液提取质粒。
1.9大肠杆菌质粒DNA的提取得到pGmNCED1::pdnor221质粒(天根试剂盒)
(1)室温，12000rpm，离心1min，收集菌体；
(2)弃上清，加入250μl低温预冷的P1，振荡悬浮菌体；
(3)加250溶液P2轻柔颠倒混匀，静置5min；
(4)溶液澄清后加入350μl溶液P3，轻轻混匀后放置5min；
(5)12000rpm，离心12min，同时在过滤柱中加入600μl BL平衡液，室温放置2min,12000rpm离心1min，将收集管中的液体倒掉；
(6)转移质粒提取管中上层水相于过滤柱中，室温2min，12000rpm离心1min,将收集管中的液体倒掉；
(7)在过滤柱中加入600μl漂洗液PW，室温2min，12000rpm离心1min,将收集管中的液体倒掉，重复一次；
(8)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm离心5min；
(9)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位滴加55μl预热55℃的灭菌水，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。
1.10链接GmNCED1启动子与PBGWFS7
利用gateway(Thermo Scientific)系统，反应体系如下(20μl体系):
1.11大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)
转化方法同1.6中方法
1.12大肠杆菌PCR验证(同1.7)
1.13大肠杆菌质粒DNA的提取
挑取含有重组质粒的阳性单菌落于1.5ml EP管中用含有壮观霉素(100mg/L)的液体LB摇过夜，然后接种200ul于装有20mlLB(含有100mg/L壮观霉素)的100ml锥型瓶中过夜摇，然后吸取4ml菌液提取质粒。
1.14阳性克隆测序
吸取经过鉴定具有阳性克隆对应的1.5MLEP管中菌液200ul，送华大公司进行测序，利用自身基因特异性引物与M13引物同时进行测序。
1.15农杆菌的质粒转化(无菌操作)
(1)将10μl质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；
(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；
(3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；
(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；
(5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。
1.16转化农杆菌的PCR验证
反应体系如下(20μl体系)：
扩增条件如下：
反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
1.17在拟南芥中验证菏豆12GmNCED1基因启动子的功能验证
1.17.1花侵染法转化拟南芥
(1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；
(2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD600约为1.0-1.2；
(3)室温，4200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD600约为0.8；
(4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；
(5)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。
1.17.2拟南芥种子的表面消毒
将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用70％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。
1.17.3转基因植株的筛选
利用花侵染法通过农杆菌将pGmNCED1::GUS载体转入拟南芥中。将收获的T1代种子播在土壤基质中，于4摄氏度春化3天后置于培养箱中萌发3-4d以后，开始喷施用10％bastasolution的母液按1:1000浓度(v/v)稀释的除草剂(basta)，选取长势较好的植株移到新的土壤介质中，让其继续生长。待苗快抽苔时取少量叶片粗提基因组DNA，采取PCR方法验证转基因植株，引物为att B1/2。待阳性植株成熟并收获T1代种子。T1代种子用含有的1/2MS固体培养基进行抗性筛选，选取抗性：非抗性比为3:1的单拷贝***株系，种植阳性植株，成熟后即收获T2代种子。T2代种子经过抗性筛选得到转基因纯合系。
1.18转基因拟南芥分析GmNCED1启动子
将转基因拟南芥T3代植株种子种植于1/2MS培养基上，取幼苗期和开花期的拟南芥做GUS染色，观察其组织特异性表达，结果如图3所示，表明GmNCED1启动子驱动的GUS信号主要在根中表达。
将T3代纯系拟南芥种子种植于1/2MS培养基上，春化处理后在长日照(16h光照、22℃/8h黑暗、20℃)条件下生长。将生长7天的转基因拟南芥苗，放置1/2MS液体培养基中培养12h作对照，含50mMNaCl的MS液体培养基中作盐处理12h。结果如图3所示，表明GmNCED1启动子能够受盐胁迫诱导。
2.大豆菏豆12GmNCED1基因启动子序列分析
利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及
PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析系统对菏豆12GmNCED1基因启动子序列中可能存在的顺式作用元件进行分析。
GmNCED1基因启动子所含有的胁迫相关顺式作用元件如下表格所示，表明该启动子上含有丰富的胁迫相关顺式作用元件，可能受到多种转录因子的调控，参与植物对多种生物和非生物胁迫响应。
序列表
<110>山东大学
<120>一种大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子及其应用
<141> 2019-11-23
<160> 1
<210> 1
<211> 1776
<212> DNA
<213>大豆属大豆（Glycine max.）
<221>大豆菏豆12GmNCED1基因盐诱导启动子
<222>（1）…（1776）
<400> 1
ccttttcaac cactaaacat cctttataac ttccactatt ttaatatcca tattctaaaa 60
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