阅读说明：本技术 即用型冷冻保存细胞 (Ready-to-use cryopreservation of cells ) 是由 M·富岛 K·王 于 2018-04-26 设计创作，主要内容包括：本公开的主题涉及解离细胞的即用型低温保存群体的组合物,其可以直接用于下游应用而无需解冻后扩增和/或传代。本公开的主题还提供制备此类组合物的方法以及使用此类组合物的体外方法。(The presently disclosed subject matter relates to compositions that dissociate a ready-to-use cryopreserved population of cells, which can be used directly for downstream applications without post-thaw expansion and/or passaging. The presently disclosed subject matter also provides methods of making such compositions and in vitro methods of using such compositions.)

即用型冷冻保存细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年4月26日提交的美国临时申请号：62/490,432，2017年6月13日提交的美国临时申请号：62/518,891和2017年6月13日提交的美国临时申请号：62/519,006的优先权。其中每一项的内容都是全部并入以供参考，并要求对每一项享有优先权。

技术领域

本公开的主题涉及即用型冷冻保存细胞的组合物，其可直接用于下游应用而无需解冻后扩增和/或传代，并且涉及所述组合物、前体组合物的制备方法以及所述组合物中细胞的体外培养方法。

背景技术

人多能干细胞(hPSC)正在彻底改变疾病建模和细胞替代疗法。现在，PSC(例如，作为诱导的PSC或iPSC)通常从受试者制备，可以随意改变怀疑引起疾病的基因改变，以探索基因型与表型的关系。这些技术将全基因组关联与病因联系起来，并结合日益复杂的PSC定向分化的能力(这是提供疾病相关环境的必要步骤)，为疾病机理提供了前所未有的视角。除疾病建模外，PSC还可定向为临床上相关的细胞类型，以提供无限的细胞替代疗法资源。尽管这两种PSC应用都很强大，但是hPSC维持和分化的许多实际方面都可以改进。

疾病建模实验中的一种实际问题是在指导它们分化的同时维持hPSC系。在iPSC疾病建模研究中，“最佳实践”要求平行地反复扩增和分化许多iPSC系，该过程在此处定义为“连续传代”。同步化PSC是充满挑战性的，因为不同的系通常以不同的速率扩增。另一个问题是每个PSC细胞系在连续传代过程中都可以漂移，因此，分化差可能反映了疾病状态或PSC培养不够理想。连续传代会增加被其它细胞系或微生物污染的风险，并会在实验过程中加剧遗传不稳定性。与多个iPS系的连续传代和平行分化相关的工作量也增加了人为错误的机会。串行方法可以分离扩增和分化工作量，并在执行实验之前为执行适当的质量控制提供时间。

连续传代会给细胞疗法带来更大的问题。多能干细胞在cGMP条件下储存，然后进行一系列昂贵的测试，以验证细胞库的完整性和无菌性。验证后，将储存的PSC解冻并扩增，然后开始分化以将库转化为临床上相关的细胞类型。解冻、扩增和PSC传代在制造过程中产生了一个主要变量并增加了复杂性。此步骤可以改变PSC进入分化过程的时间、产量和质量。

因此，在本领域中需要消除制备用于体外培养细胞的传统方法相关的问题的方法和组合物，并且需要产生高质量和高度一致的PSC。

发明内容

本公开的主题涉及即用型冷冻保存细胞的组合物，其可直接用于下游应用而无需解冻扩增和/或传代，此类组合物、前体组合物的制备方法，以及所述组合物中细胞的体外培养方法或其它用途。

本公开的主题提供用于实验的质量控制多能干细胞(PSC)，并通过创建可在不同时间和地点重复使用的大批次来消除批次间的变异性，因为它们作为即用型等分试样冻存。

根据所公开的主题的一个方面，提供包含细胞的冷冻群体和冷冻保存培养基的组合物。在另一方面，本公开提供包含用异源核酸转染的细胞的组合物，该转染的细胞通过转染使细胞的冷冻群体和冷冻保存培养基解冻而获得的细胞来制备。

在某些实施方式中，冷冻细胞群体是解离细胞群体。在某些实施方式中，冷冻细胞群体的浓度为至少约50万、100万、500万、1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞/ml。在某些实施方式中，冷冻群体中细胞的浓度为至少约100万个细胞/ml。在某些实施方式中，冷冻群体中细胞的浓度为至少约500万个细胞/ml。在某些实施方式中，冷冻群体中细胞的浓度为至少约3000万个细胞/ml。在某些实施方式中，冷冻群体中细胞的浓度为至少约5000万个细胞/ml。

在某些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，哺乳动物细胞是多能干细胞(PSC)。在某些实施方式中，多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)或由胚胎干细胞(ESC)制备。

此外，本公开的主题提供一种制备包含冷冻细胞的组合物的方法，包括：将在培养基中培养的细胞群体解离；将解离的细胞悬浮在冷冻保存培养基中以形成细胞悬液；和将细胞悬液冷冻以形成冷冻细胞的组合物。另外，本公开提供用于制备转染细胞的方法，包括(i)通过一种方法制备包含冷冻细胞的组合物，该方法包括：将在培养基中培养的细胞群体解离；将解离的细胞悬浮在冷冻保存培养基中以形成细胞悬液；和将细胞悬液冷冻以形成冷冻细胞的组合物；和(ii)用异源核酸转染来自组合物(i)的细胞。

在某些实施方式中，冷冻细胞的组合物的浓度为至少约50万、100万、500万、1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞/ml。

在某些实施方式中，解离细胞群体还包括将细胞群体暴露于有效量的细胞解离溶液中。在某些实施方式中，细胞解离溶液选自无酶的细胞解离溶液和含酶的溶液。在某些实施方式中，含酶的细胞解离溶液包含一种或更多种酶。在某些实施方式中，酶选自Accutase^TM、胶原酶、蛋白酶、胰蛋白酶和衍生物、木瓜蛋白酶、透明质酸酶和DNase。在某些实施方式中，无酶细胞解离溶液包含螯合剂。在某些实施方式中，螯合剂是EDTA或其它用于去除细胞与底物相互作用的无Ca⁺⁺/Mg⁺⁺试剂。在某些实施方式中，培养基是无饲养层的培养基。

根据本公开的主题的另一方面，本公开的主题提供用于体外培养细胞的方法，其包括：使包含解离的冷冻细胞群体和冷冻保存培养基的组合物解冻；使细胞进行下游处理，其中细胞在下游处理之前基本上不扩增和/或不传代。在某些实施方式中，冷冻细胞的组合物的浓度为至少约50万、100万、500万、1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞/ml。

在某些实施方式中，细胞群体进行解冻后扩增。在某些实施方式中，细胞群体扩增一段时间，以使得该群体中的细胞经历至多1、2、3、4或5轮细胞***。

在某些实施方式中，细胞群体扩增一段时间，以使细胞经历细胞***，其中所述扩增不是指数扩增。在某些实施方式中，细胞群体进行解冻后传代。在某些实施方式中，细胞群体进行至多1、2、3、4或5次传代。在某些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，哺乳动物细胞是多能干细胞(PSC)。在某些实施方式中，多能干细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)或由胚胎干细胞(ESC)制备。

在某些实施方式中，下游处理包括体外分化冷冻保存的细胞的方法。在某些实施方式中，将冷冻保存的细胞分化成多个体细胞，例如神经元细胞或其前体，其中所述分化的细胞表达可检测水平的所述细胞的一种或多种标志物。在某些实施方式中，将冷冻保存的细胞分化为神经嵴或神经嵴衍生细胞。在某些实施方式中，将冷冻保存的细胞分化为产生多巴胺的细胞，例如中脑多巴胺细胞或其前体。在某些实施方式中，多巴胺前体细胞表达可检测水平的叉头盒蛋白A2(FOXA2)、LIM同源盒转录因子1α(LMX1A)和/或酪氨酸羟化酶(TH)。

在某些实施方式中，iPSC来源于诊断患有疾病或病症例如神经退行性疾病的受试者。在某些实施方式中，神经退行性疾病是帕金森氏病。

在某些实施方式中，本文所述的细胞在冷冻保存之前或在冷冻保存之后的解冻后用核酸转染。在某些实施方式中，通过转染或核转染引入核酸。在某些实施方式中，与未进行冷冻保存的细胞相比，细胞显示出增加的核酸摄取和/或表达。在某些实施方式中，解离细胞群体的表达水平是未冷冻的细胞群体的表达水平的至少约2倍。在某些实施方式中，解离细胞群体的表达水平比未冷冻的细胞群体的表达水平高至少约5％。

因此，各种实施方式提供产生转染细胞的方法，该方法包括使包含解离的冷冻细胞群体和冷冻保存培养基的组合物解冻；然后用目的核酸转染细胞，其中在转染前细胞基本上不扩增和/或基本上不传代，并且其中与转染前未冷冻保存的对照细胞的转染效率相比，转染效率显著提高，和/或与转染前未冷冻保存的对照细胞中转染的核酸的表达相比，转染的核酸的表达显著增加。在某些实施方式中，提供通过前述方法制备的转染细胞的组合物，其中所述细胞包含转染的核酸，例如异源核酸，其包括至少有一部分在转染前未在细胞中发现的核酸序列，包括通过***、删除、替代或重排而改变的序列。

附图说明

图1A-1L描绘冷冻暂停(CryoPaused)细胞的生存力、库一致性和PSC标志物表达。(1A，1F)解冻后新鲜(对照)和冷冻暂停WA09细胞的生存力百分比。在Nexcelom自动细胞计数器上使用吖啶橙(活)和碘化丙啶荧光(死)荧光测量生存力(CP：n＝15，对照：n＝28)。(1B)在13个独立的冷冻暂停PSC细胞库上冷冻之前(红色三角形)和解冻之后(黑色圆圈)的细胞生存力。(1C-1E)通过流式细胞术在对照或冷冻暂停细胞中的干细胞标志物表达(或自发分化，SSEA-1)(1C)，以平均值±SD(1D，n＝3)或免疫荧光(1E，比例尺＝100μm)显示的独立生物学重复的值。(1G)PluriTest测定法评估对照和冷冻暂停细胞的多能性。在与微阵列杂交之前，使用对照(n＝2)或冷冻暂停(n＝2)WA09培养物获得RNA。使用PluriTest算法处理阵列数据，并将每个样品绘制为两个相关参数，即多能性评分和新奇评分(NoveltyScore)。所有四个样品均通过了PluriTest的多能性评估。红色云代表通过PluriTest的样品，而蓝色云代表未通过PluriTest的样品。(1H)评估对照细胞和冷冻暂停细胞的甲基化的MA图。将互补的CpG位点(相反链上相距一个碱基)的甲基化值合并以生成CpG单元甲基化。使用10个读取的最小阈值覆盖率来过滤CpG单元，分别得到了对照样品和冷冻暂停样品的3,714,418和3,408,158个CpG单元。通过中位数绝对偏差(MAD)评估甲基化水平的一致性，中位数绝对偏差(MAD)是一种对异常值不敏感的可变性的粗略测量，它评估了两个样品所涵盖的3,155,482个常见CpG单元的甲基化水平的统计离差。(1I)冷冻暂停细胞能够产生畸胎瘤。对于所有小组，红色箭头指向外胚层，绿色和蓝色星号表示中胚层，黑色箭头指向内胚层。(顶部)低倍放大图像，显示来自冷冻暂停WA09 hESC的苏木精和曙红染色的畸胎瘤切片，比例尺＝1mm。(中间)高倍放大图像，显示含有内胚层(杯状细胞，黑色箭头)和中胚层(绿色星号)的区域，比例尺＝200μm。(下部)高倍放大图像，显示外胚层(黑色素化的神经外胚层，红色箭头)和中胚层(脂肪细胞，蓝色星号)，比例尺＝200μm。(1J)通过在Operetta高内涵成像仪上的γΗ2ΑX表达(左)和在用0.5μM喜树碱处理1小时后作为测定的阳性对照并测试对DNA损伤的脆弱性(右，n＝3；独立生物学重复的值显示为平均值±SD)来测量对照细胞和冷冻暂停细胞中DNA损伤的定量。(1K)在用和没有用0.5μM喜树碱处理1小时的情况下，在对照细胞和冷冻暂停细胞中γH2AX表达的代表性免疫荧光。(1L)对20个DAPI标记的中期进行了染色体分析，所有这些均已完全核型化。对照(20/20)和冷冻暂停细胞(20/20)均具有正常的46,XX核型。在(1A)、(1C)和(1J)中，Wilcoxin的符号秩检验至少进行了三个独立实验，而对照和冷冻暂停之间未发现统计学差异(p>0.05)。参见图5A。

图2A-2M描绘冷冻暂停细胞的动力学和定向分化的程度。(2A&2L)在神经诱导过程中通过流式细胞术定量的OCT4和PAX6表达(n＝5；独立生物学重复的值显示为平均值±SD)。(2B-2C)在神经诱导后第0、3、6和9天的代表性的流式细胞术(2B)和免疫荧光(2C)。(2D)在中胚层诱导期间通过流式细胞术定量的OCT4和Brachyury表达(n＝3；独立生物学重复的值显示为平均值±SD)。中胚层诱导后第0、1、2和4天的代表性流式细胞术(2E，2K)和免疫荧光(2F)。(2G)当以100万、500万、1000万、2000万和3000万个细胞/mL冷冻时，解冻后冷冻暂停细胞的生存力。在自动细胞计数器上用吖啶橙(活)和碘化丙啶(死)荧光确定活细胞的百分比(n＝3；独立生物学重复的值显示为平均值±SD)。(2H，2M)通过流式细胞术测量在Cell Factory中扩增的对照和冷冻暂停细胞中的干细胞标志物表达(或自发分化，SSEA-1)(n＝3；在2H中，独立生物学重复的值显示为平均值±SD，在2M中为代表性实例)。(2I)中脑多巴胺神经元分化为低温暂停细胞后21天，FOXA2(红色)和TH(绿色)表达，比例尺＝100μm。(2J)对照和冷冻暂停的WA09 hESC以及中脑多巴胺神经元的基因表达。将样品归一化为WA09 hES对照细胞，并用颜色编码表达的倍数变化。相对于对照hES，较高的表达水平显示为红色，而较低的水平显示为蓝色。在(2A)、(2D)、(2G)和(2H)中，Wilcoxin的符号秩检验至少进行了三个独立实验，在对照和冷冻暂停之间未发现统计学差异(p>0.05)。

图3A-3E.冷冻暂停细胞的遗传修饰。A-B)用GFP质粒进行核转染后24小时，对照细胞和冷冻暂停细胞中GFP表达的代表性免疫荧光(A)和流式细胞术(B)。(C)在用GFP质粒进行核转染后24小时，通过流式细胞术量化对照细胞和冷冻暂停细胞中GFP表达(n＝3；独立生物学重复的值显示为平均值±SD)。(D)在用含有EmGFP的仙台病毒载体转导后，冷冻暂停细胞中GFP表达的代表性免疫荧光。最初转导的单个亚克隆可以维持为GFP+集落至少10代。(E)在冷冻暂停WA01 iCRISPR细胞中使用具有HPRT向导RNA的基因组裂解检测试剂盒后，对裂解产物进行琼脂糖凝胶分析。+或-表示有(+)和没有(-)检测酶。(1)阳性对照；(2)具有在冷冻暂停之前诱导的Cas9，但没有向导RNA的iCRISPR细胞。(3)没有Cas9诱导但具有HPRT向导RNA的iCRISPR细胞；(4)具有Cas9诱导和HPRT向导RNA的iCRISPR细胞；(5)具有Cas9诱导和HPRT向导RNA的iCRISPR细胞(无冷冻暂停)。在(C)中，Wilcoxin的符号秩检验是通过三个独立实验进行的，对照和冷冻暂停之间没有统计学差异(p>0.05)。

图4A-4C描绘冷冻暂停细胞的遗传修饰。在对照和冷冻暂停细胞中，用GFP质粒进行核转染后24和48小时，通过流式细胞术(4A)或荧光显微镜(4B)的GFP表达。(4C)用(泳道1)和不用(泳道2)酶的GeneArt基因组裂解检测试剂盒阳性对照。Dox在冷冻暂停之前添加到细胞中，但是在用(泳道3)和不用(泳道4)酶进行核转染时，没有向导RNA。在冷冻暂停之前，没有向细胞添加Dox，但是在用(泳道5)和不用(泳道6)酶进行核转染时，确实接受了HPRT向导RNA。细胞在冷冻暂停之前接受Dox和在用(泳道7)和不用(泳道8)酶解冻后接受HPRT向导RNA。用(泳道9)和不用(泳道10)酶、接受Dox和HPRT向导RNA的新鲜对照细胞(但从未冷冻)。

图5A-5F描绘冷冻保存条件改变的冷冻暂停细胞的生存力。与图1相关。在自动细胞计数器上使用吖啶橙(活)和碘化丙啶(死)荧光测量生存力。(5A)在WA09、960.1B、153.3A和WA01 iCRISPR细胞系中冷冻暂停和对照细胞的生存力百分比。(5B)使用可控速率的冷冻机或在FreSR-S或PSC冷冻保存试剂盒中常规冷冻，冷冻暂停WA09细胞解冻后的生存力。(5C)使用控制速率的冷冻机或常规冷冻(见方法)，冷冻暂停WA09细胞解冻后的生存力。(5D)在无饲养层(Geltrex^TM)或基于饲养层的条件下生长的冷冻暂停WA09细胞的解冻后生存力。“CRF”表示使用控制速率的冷冻机，而“-80”表示将小瓶在-80℃的细胞冷冻容器中存放24小时，然后转移到液氮罐中。DMSO表示使用10％DMSO作为冷冻液。使用控制速率的冷冻机或常规冷冻将细胞冷冻暂停。(5E)通过流式细胞术的对照或冷冻超过一年的冷冻暂停细胞中干细胞标志物表达(或自发分化，SSEA-1)。(5F)使用对照和冷冻暂停WA09 hESC的畸胎瘤生长速率。

图6是制备和使用冷冻保存细胞的传统方法和冷冻暂停方法的示意图。

图7是与常规PSC培养相比冷冻暂停方法的不同示意图。(顶部)常规(对照)工作流程可从冷冻保存中恢复集落，并在很长一段时间内扩增集落，并定期将一部分培养物用于特定应用，例如定向分化成目标细胞类型。随着时间的流逝，PSC可能会发生遗传变化、污染或自发分化程度的变化，而其中任何一种都会影响结果。(底部)冷冻暂停在尽可能少的传代数上扩增了大量的PSC。然后在冷冻保存之前将大批样品解离为单细胞悬液。冷冻过程将PSC的生产与使用分开，从而留出时间对每个库进行适当的质量控制和表征。它还允许在多个实验中使用相同的细胞，并允许运送到世界任何地方，以便其它实验室可以使用完全相同的PSC起始群体启动独立实验。

图8A-8C描绘与新鲜的非冷冻对照WA09细胞相比，由基因修饰的冷冻暂停WA09人胚胎干细胞群体表达的构建体的表达水平分布。(8A)通过流式细胞术测量，进行冷冻暂停并在解冻后用3.4kb GFP质粒进行核转染的WA09干细胞群体(蓝色图，a)、用GFP载体进行核转染的新鲜非冷冻对照WA09细胞(红色图，b)和非核转染的WA09细胞(绿色图，c)中的GFP表达水平分布。(8B)通过流式细胞术测量，进行冷冻暂停并在解冻后用表达mCherry的9.3kbCRISPR/CAS9质粒进行核转染的WA09干细胞群体和用mCherry CRISPR/CAS9质粒进行核转染的新鲜非冷冻对照WA09细胞中的mCherry表达水平分布。用2.5μg、5μg、7.5μg、10μg或12.5μg质粒对细胞进行核转染。(8C)用2.5μg、5μg、7.5μg、10μg和12.5μg质粒进行核转染后表达mCherry的冷冻暂停细胞和新鲜的非冷冻对照细胞的百分比。还在冷冻暂停和新鲜的非冷冻条件下用2.5μg质粒测试了第二种核转染溶液HSC2，并分析了mCherry表达。

具体实施方式

本公开的主题涉及即用型冷冻保存细胞的组合物，其可直接用于下游应用而无需解冻后扩增和/或传代，因此消除了与连续传代相关的多个问题，例如污染和细胞质量不一致。本公开的主题还涉及此类组合物、前体组合物的制备方法，以及将所述组合物中的细胞用于下游应用(例如细胞分化、细胞疗法和疾病建模)的体外方法。

为了本公开的清楚起见而不是为了限制，详细描述分为以下小节：

5.1.定义；

5.2.即用型冷冻保存细胞的组合物；

5.3.即用型冷冻保存细胞的制备方法；和

5.4.即用型冷冻保存细胞的使用方法。

5.1定义

在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中，本说明书中使用的术语通常具有本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书中的其它地方讨论，在描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们时为从业人员提供额外的指导。

术语“约”或“大约”是指本领域普通技术人员所确定的特定值在可接受误差范围内，将部分取决于如何测量或确定该数值，即测量系统的极限。例如，按照本领域的实践，“约”可以表示3个或3个以上的标准偏差内。可替代地，“约”可以表示给定值浮动20％的范围，例如浮动10％、浮动5％，或浮动1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或方法，该术语可以意指在数值的数量级内，例如在值的5倍以内或2倍以内。

如本文所用，术语“等分试样”是指溶液，例如细胞悬液的总量的一部分。“细胞等分试样”是指从细胞悬液中分出并储存在单独容器中的细胞悬液总量的一部分。

如本文所用，术语“细胞培养”是指细胞在用于研究或医学治疗的人工培养基中的体外生长。

如本文所用，术语“贴壁细胞培养”是指细胞培养方法，其中细胞在附着于组织培养瓶或平板底部的同时在细胞培养基中生长。

如本文所用，术语“培养基”是指覆盖培养容器(例如皮氏(Petri)板、多孔板等)中的细胞的培养液，并且包含营养物质以滋养和支撑细胞。培养基还可包含添加的生长因子，以在细胞中产生所需的变化。

如本文所用，术语“细胞悬液”是指溶液，其中单个细胞或小的细胞聚集体悬浮在液体培养基中而不附着在容器壁上。“单细胞悬液”是指其中单个细胞悬浮在液体培养基中的细胞悬液。

如本文所用，术语“冷冻保存的”或“冷冻保存”是其中通过冷却至非常低的温度来保存细胞的过程。

如本文所用，术语“冷冻保存培养基”是指与冷冻保存细胞混合并储存的液体。冷冻保存培养基可能包含有效量的物质，这些物质可用于保护细胞免受由于形成冰而造成的冷冻损伤。

如本文所用，术语“扩增”是指细胞数目的增加。

如本文所用，术语“传代”是指从培养容器中移出培养基并将在培养容器中培养的细胞转移到新鲜培养基中的过程。传代过程使培养的细胞得以进一步扩增。

如本文所用，术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境的示例但不限于皮氏培养皿、锥形管和细胞培养物。

如本文所用，术语“体内”是指天然环境(例如动物或细胞)以及在天然环境内发生的过程或反应，例如胚胎发育、细胞分化、神经管形成等。

如本文所用，术语“分化”是指这样的过程，其中非特异性细胞，例如多能干细胞，例如胚胎干细胞(ESC)和/或诱导性多能干细胞(iPSC)，获得了例如心脏、肝脏、神经元或肌肉细胞或其前体的特异性细胞的特征。分化是通过细胞与细胞外的物理和化学条件的相互作用来控制的，例如，通过涉及直接或间接调节基因表达的嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。

如本文所用，术语“细胞群体”或“细胞群体”是指一群细胞。在非限制性实施例中，细胞群体可包含至少约10万、至少约50万、至少约100万、至少约200万、至少约300万、至少约400万、至少约500万、至少约1000万、至少约2000万、至少约3000万、至少约4000万、至少约5000万、至少约6000万、至少约7000万、至少约8000万、至少约9000万、至少约1亿个细胞、至少约2亿个细胞、至少约5亿个细胞、至少约10亿个细胞、至少约15亿个细胞、至少约20亿个细胞、至少约25亿个细胞、至少约30亿个细胞或介于之间的值。该群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。或者，该群体可以包含一种以上的细胞类型，例如混合细胞群体。

如本文所用，术语“干细胞”是指在培养中具有无限期***能力并产生特定细胞的细胞。人干细胞是指来自人的干细胞。

如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指来源于植入前阶段胚胎的原始的(未分化)细胞，在培养中能够***而不会长时间分化，并且已知会发育为三个主要胚层的细胞和组织。人胚胎干细胞是指来自人的胚胎干细胞。如本文所用，术语“人胚胎干细胞”或“hESC”是指来源于早期人类胚胎直至并包括胚泡期的多能干细胞的一种，其在培养过程中能够***而不会长时间分化，并且已知会发育成三个主要胚层的细胞和组织。

如本文所用，术语“多能的”是指发育成包括内胚层、中胚层和外胚层的生物体的三个发育胚层的能力。

如本文所用，术语“诱导的多能干细胞”或“iPSC”是指通过引入某些胚胎基因(例如OCT4、SOX2和KLF4转基因)至体细胞(例如CI4、C72等)中形成的类似于胚胎干细胞的多能干细胞(PSC)的类型(例如，参见并入本文以供参考的Takahashi and Yamanaka Cell126，663-676(2006))。

如本文所用，术语“多能干细胞系”或“PSC系”是指已经在体外条件下培养的多能干细胞群体，其允许增殖长达数天、数月至数年而没有分化。

有效量是产生期望效果的量。

如本文所用，关于细胞的术语“诱导分化”是指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变为非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“在干细胞中诱导分化”是指诱导干细胞(例如人干细胞)分成具有与干细胞不同的特征的后代细胞，例如基因型(例如通过遗传分析(例如微阵列)确定的基因表达变化)和/或表型(例如，比如TUJI、DCX、TBR1、REELIN和FOXG1的蛋白质表达的变化)。本文的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人类或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿类动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠的啮齿类动物；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物，例如猿和猴子。

如本文所用，术语“疾病“是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况或病症。

如本文所用，术语“治疗“是指试图改变被治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗性效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、和缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以预防在受影响或确诊的受试者或怀疑患有该病症的受试者中由于病症引起的恶化，而且治疗可以预防在有患疾病风险或怀疑患有该疾病的受试者中该病症的症状或该病症的发作。

5.2即用型冷冻保存细胞的组合物

本公开的主题提供包含解离细胞的冷冻群体和冷冻保存培养基的组合物。冷冻的细胞群体是即用型的，其中细胞可以用于下游应用，而无需或只需很少的解冻后扩增和/或传代。

在某些实施方式中，解离细胞群体包含单细胞悬液，使得与未解离细胞群体相比，群体中的每个细胞表现出降低的对其它细胞的附着水平。在某些实施方式中，与未解离细胞群体相比，解离细胞群体包含降低水平或数量的细胞聚集体。在某些实施方式中，与非解离细胞群体相比，解离细胞群体包含尺寸较小的细胞聚集体。

在某些实施方式中，解离细胞群体包含单细胞悬液，其中该群体中的每个细胞不与该群体中的其它细胞附着，使得该群体不包含细胞聚集体。

冷冻的细胞可以以高浓度保存在冷冻保存培养基中，因此该组合物的单等分试样可以提供足够数量的细胞用于下游应用，而无需或几乎不需解冻后的扩增。例如但不限于，等分试样中的细胞浓度可以大于100万个细胞/ml、或大于500万个细胞/ml、或大于1000万个细胞/ml、或大于2000万个细胞/ml。

在某些实施方式中，组合物的单等分试样提供足够数量的细胞用于下游应用，而无需解冻后扩增。

在某些实施方式中，组合物的单等分试样提供足够数量的细胞用于下游应用，而无需解冻后传代。

在某些实施方式中，组合物的单等分试样提供足够数量的细胞用于下游应用，而无需解冻后的扩增和传代。

在某些实施方式中，组合物的单等分试样提供足够数量的细胞用于下游应用，或者其中在解冻之后，将细胞群体扩增一段时间，使得该群体中的细胞进行有限量的细胞***，例如，至多0.5、至多1、至多2、至多3、至多4或至多5轮细胞***(0.5轮细胞***是指培养时间是细胞群体倍增时间的一半)。

在某些实施方式中，细胞群体在解冻后扩增一段时间，使得该群体中的细胞经历细胞***，其中所述扩增不是指数扩增。

在某些实施方式中，细胞群体进行解冻后传代。在某些实施方式中，细胞群体进行至多1、至多2、至多3、至多4或至多5次传代。

在某些实施方式中，冷冻保存培养基中的细胞浓度为至少约10万个细胞/ml、至少约50万个细胞/ml、至少约100万个细胞/ml、至少约500万个细胞/ml、至少约1000万个细胞/ml、至少约1500万个细胞/ml、至少约2000万个细胞/ml、至少约2500万个细胞/ml、至少约3000万个细胞/ml、至少约3500万个细胞/ml、至少约4000万细胞/ml、至少约4500万细胞/ml、至少5000万细胞/ml、至少约5500万细胞/ml、至少约6000万细胞/ml、至少约6500万个细胞/ml、至少约7000万个细胞/ml、至少约7500万个细胞/ml、至少约8000万个细胞/ml、至少约8500万个细胞/ml、至少约9000万个细胞/ml、至少约9500万个细胞/ml、至少约1亿个细胞/ml、至少约1.5亿个细胞/ml、至少约2亿个细胞/ml、至少约2.5亿个细胞/ml、至少约3亿个细胞/ml、至少约3.5亿个细胞/ml、至少约4亿个细胞/ml、至少约4.5亿个细胞/ml、至少约5亿个细胞/ml。

在某些实施方式中，组合物的单等分试样的体积为至少约1ml、至少约2ml、至少约3ml、至少约4ml、至少约5ml、至少约6ml、至少约7ml、至少约8ml、至少约9ml、至少约10ml、至少约15ml、至少约20ml、至少约25ml、至少约30ml、至少约35ml、至少约40ml、至少约45ml、至少约50ml、至少约55ml、至少约60ml、至少约65ml、至少约70ml、至少约75ml、至少约80ml、至少约85ml、至少约90ml、至少约95ml、至少约100ml、至少约150ml、至少约200ml、至少约250ml、至少约300ml、至少约350ml、至少约400ml、至少约450ml、至少约500ml、至少约1000ml。

在某些实施方式中，细胞是干细胞，例如多能干细胞(例如人多能干细胞)。人干细胞的非限制性实例包括人胚胎干细胞(hESC)、人多能干细胞(hPSC)、人诱导性多能干细胞(hiPSC)、人孤雌生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、表皮干细胞、F级(F-class)多能干细胞、体细胞干细胞、癌症干细胞或任何其它具有谱系特异性分化能力的细胞。在某些实施方式中，人干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。在某些实施方式中，人干细胞是人诱导性多能干细胞(hiPSC)。在某些实施方式中，人干细胞是人多能干细胞系。人多能干细胞系的非限制性实例包括WA09(H9)、960.1B、15.3A和WA01 iCRISPR细胞系。在某些实施方式中，干细胞是非人干细胞。非人干细胞的非限制性实例包括非人灵长类干细胞、啮齿类动物干细胞、狗干细胞、猫干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，干细胞是胚胎干细胞。在某些实施方式中，干细胞是诱导性多能干细胞。

可以在贴壁细胞培养物中生长的任何类型的细胞都适合于本公开的主题。此类细胞的非限制性实例包括动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。在某些实施方式中，细胞是CHO细胞。在某些实施方式中，细胞是COS细胞。在某些实施方式中，细胞是HEK细胞，例如HEK293细胞。在某些实施方式中，细胞是HeLa细胞。在某些实施方式中，细胞是视网膜细胞。

本领域已知的任何类型的冷冻保存培养基可以与本公开的主题一起使用。冷冻保存培养基可以包含例如冷冻保护剂的物质，该物质可以保护细胞免受由于冰形成引起的冷冻损伤。冷冻保护剂的非限制性实例包括二醇，例如乙二醇、丙二醇和甘油，二甲基亚砜(DMSO)和海藻糖。冷冻保存培养基的非限制性实例包括FreSR^TM-S、PSC冷冻保存培养基(ThermoFisher Scientific)、Stem-CellBanker GMP、含10％DMSO的Essential 8^TM(ThermoFisher Scientific)、冷冻培养基(Biolife)和CryoStem冷冻保存培养基(Stemgent)。在某些实施方式中，冷冻保存培养基为FreSR^TM-S。

可以将包含细胞和冷冻保存培养基的组合物等分并储存在本领域已知的适用于冷冻保存的任何类型的储存容器或器皿中。冷冻保存容器的非限制性实例包括小瓶、塑料袋、管和盒子，例如比如玻璃小瓶(例如但不限于火石玻璃小瓶)，安瓿，塑料柔性容器，例如但不限于PVC(聚氯乙烯)容器、CZ树脂容器、聚丙烯容器和注射器以及玻璃注射器。

5.3即用型冷冻保存细胞的制备方法

本公开的主题提供包含冷冻解离细胞群体的组合物的制备方法。该组合物可以直接用于下游应用，而无需或只需很少的解冻后扩增和/或传代。

在某些非限制性实施方式中，冷冻解离细胞群体的制备方法包括：将在培养基中培养的细胞群体解离；和将解离的细胞悬浮在冷冻保存培养基中以形成细胞悬液；和将细胞悬液冷冻以形成冷冻细胞的组合物。在某些实施方式中，细胞在冷冻之前扩增。

在某些实施方式中，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞在解冻后是存活的。

在某些实施方式中，冷冻解离细胞的组合物的浓度为至少约10万个细胞/ml、至少约50万个细胞/ml、至少约100万个细胞/ml、至少约500万个细胞/ml、至少约1000万个细胞/ml、至少约1500万个细胞/ml、至少约2000万个细胞/ml、至少约2500万个细胞/ml、至少约3000万个细胞/ml、至少约3500万个细胞/ml、至少约4000万细胞/ml、至少约4500万细胞/ml、至少5000万细胞/ml、至少约5500万细胞/ml、至少约6000万细胞/ml、至少约6500万个细胞/ml、至少约7000万个细胞/ml、至少约7500万个细胞/ml、至少约8000万个细胞/ml、至少约8500万个细胞/ml、至少约9000万个细胞/ml、至少约9500万个细胞/ml、至少约1亿个细胞/ml、至少约1.5亿个细胞/ml、至少约2亿个细胞/ml、至少约2.5亿个细胞/ml、至少约3亿个细胞/ml、至少约3.5亿个细胞/ml、至少约4亿个细胞/ml、至少约4.5亿个细胞/ml、至少约5亿个细胞/ml。

在某些实施方式中，组合物的单等分试样的体积为至少约1ml、至少约2ml、至少约3ml、至少约4ml、至少约5ml、至少约6ml、至少约7ml、至少约8ml、至少约9ml、至少约10ml、至少约15ml、至少约20ml、至少约25ml、至少约30ml、至少约35ml、至少约40ml、至少约45ml、至少约50ml、至少约55ml、至少约60ml、至少约65ml、至少约70ml、至少约75ml、至少约80ml、至少约85ml、至少约90ml、至少约95ml、至少约100ml、至少约150ml、至少约200ml、至少约250ml、至少约300ml、至少约350ml、至少约400ml、至少约450ml、至少约500ml、至少约1000ml。

在某些实施方式中，在进行解离之前，将细胞在培养基中培养。适用于培养细胞的任何类型的培养基可以与本公开的主题一起使用。在某些实施方式中，培养基是无饲养层的培养基。在某些实施方式中，培养基是饲养层培养基。在某些实施方式中，培养基是Essential 8^TM培养基。

使用细胞解离溶液，将在培养基中培养的细胞从培养表面如培养板或烧瓶中解离。解离还可以帮助将细胞彼此分离以形成单细胞悬液。本领域已知的适用于从细胞附着中解离细胞的任何类型的试剂或溶液可用作细胞解离溶液与本公开的主题一起使用。细胞解离溶液可包含具有蛋白水解和/或胶原水解功能的酶。此类酶的非限制性实例包括Accutase^TM、胶原酶、蛋白酶、胰蛋白酶和衍生物、木瓜蛋白酶。细胞解离溶液还可以包含其它酶，例如透明质酸酶和DNase。透明质酸酶是可以催化透明质酸降解的一系列酶。DNase是可以消化泄漏到解离培养基中的核酸的一系列酶。此类含酶溶液的非限制性实例包括胰蛋白酶缓冲液、胰蛋白酶-EDTA缓冲液、Accutase、Detachin^TM细胞分离溶液(Genlantis)和Accumax。细胞解离溶液可以不含酶。在某些实施方式中，无酶细胞解离溶液可以包含螯合剂以螯合溶液中的游离钙和镁离子，从而解离细胞。螯合剂的非限制性实例是EDTA或其它用于消除与底物1,1-双(二苯基膦基)乙烯的细胞相互作用的无Ca++/Mg++的试剂。此类无酶溶液的非限制性实例包括温和细胞解离试剂(GCDR，STEMCELL Technologies)；和细胞解离缓冲液，无酶，汉克斯平衡盐溶液(ThermoFisher)；以及细胞解离缓冲液，无酶，PBS(ThermoFisher)；或EDTA。在某些实施方式中，使用Accutase将细胞解离。

在某些实施方式中，在将解离细胞群体悬浮于冷冻保存培养基中之前对其进行洗涤。可以用本领域已知的适用于洗涤细胞的任何溶液洗涤解离细胞群体。在某些实施方式中，在Essential 8^TM培养基中洗涤解离细胞群体。

可以将细胞悬液等分并储存在本领域已知的适用于冷冻保存的任何类型的储存容器中。上文描述了冷冻保存容器和器皿的非限制性实例。

本领域已知的适用于冷冻细胞悬液以冷冻保存细胞的任何冷冻方法均可与本公开的主题一起使用，例如，控制速率的冷冻程序。

在某些实施方式中，冷冻方法包括使用通过以下程序编程的控制速率的冷冻机：

步骤1：在4℃下等待；

步骤2：1.2℃/min(样品)至-4℃；

步骤3：25℃/min(腔室)至-40℃；

步骤4：10℃/min(腔室)至-12℃；

步骤5：1.0℃/min(腔室)到-40℃；

步骤6：10℃/min(腔室)至-90℃；和

步骤7：在-90℃下等待。

在某些实施方式中，在控制速率的冷冻机达到-90℃之后，可以将冷冻的细胞等分试样转移至液氮罐中。

在某些实施方式中，冷冻方法是常规的慢速冷却方法。

5.4即用型冷冻保存细胞的使用方法

本公开的主题还提供体外培养或以其它方式使用包含冷冻离解细胞群体和冷冻保存培养基的组合物的方法。在某些实施方式中，体外方法包括使组合物进行下游处理，其中细胞在下游处理之前不扩增和/或传代。

在某些实施方式中，包含冷冻解离细胞群体的组合物包含足够数量的细胞用于下游处理。例如，组合物的单个等分试样可以包含足够数量的细胞用于下游处理。

在某些实施方式中，组合物的单个等分试样提供了足够数量的细胞用于下游应用，其中在解冻后，将细胞群体扩增一段时间，以使得该群体中的细胞经历细胞***，例如至少1、2、3、4或5轮细胞***。在某些非限制性实施方式中，在使用前，将细胞群体在培养(任选地添加细胞培养基)中维持足以进行至多2轮细胞***的时间段，或足以进行至多5轮细胞***的时间段。

在某些非限制性实施方式中，在使用前，例如，在细胞群体解冻后，将细胞群体在培养(任选地添加细胞培养基)中维持至多约1h、5h、10h、15h、20h、25h或30h的时间。

在某些非限制性实施方式中，在使用前，例如，在细胞群体解冻后，将细胞群体在培养(任选地添加细胞培养基)中维持至多约24h的时间。

在某些实施方式中，细胞群体在解冻后扩增一段时间，使得该群体中的细胞经历细胞***，其中所述扩增不是指数扩增。在某些实施方式中，细胞群体进行解冻后传代。在某些实施方式中，细胞群体进行至多1、2、3、4或5次传代。

在某些实施方式中，冷冻解离细胞群体包含人iPSC或人ESC。在某些实施方式中，下游处理包括将细胞群体分化成多个体细胞例如神经元或其祖细胞的方法。在某些实施方式中，所述分化的细胞可以包含在用于治疗用途的治疗组合物中，例如药物组合物中。在某些实施方式中，分化的细胞可以用于体外疾病建模。例如，分化多能干细胞的方法公开于国际公开号WO/2010/096496、WO/2011/149762、WO/2013/067362、WO/2016/19666、WO/2014/176606、WO/2015/077648和国际申请号：2016年12月22日提交的PCT/US16/068430、2017年2月6日提交的PCT/US17/016723和2017年1月27日提交的PCT/US17/015480，其全部内容整体用于所有目的并入本文以供参考。

在某些实施方式中，本文描述的细胞群体分化为多个多巴胺细胞，例如中脑多巴胺细胞或其前体。在某些实施方式中，多巴胺前体细胞表达可检测水平的叉头盒蛋白A2(FOXA2)、LIM同源盒转录因子1α(LMX1 A)和/或酪氨酸羟化酶(TH)。在某些实施方式中，冷冻解离细胞群体包含iPSC，其来源于诊断患有或有风险患有神经退行性疾病，例如帕金森氏病的受试者。

在某些实施方式中，本文描述的细胞用外源核酸转染，例如进行核转染、电穿孔、基于脂质/脂质体、磷酸钙诱导或其它将外源遗传材料移入哺乳动物细胞的方法。在某些实施方式中，与未冷冻的对照细胞相比，在转染后，本文描述的细胞表现出提高的核酸摄取和/或核酸表达水平。在某些实施方式中，由本文描述的细胞提高的表达水平是非冷冻对照细胞的表达水平的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25倍。

在某些实施方式中，由本文描述的细胞提高的表达水平比非冷冻对照细胞的表达水平高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。

在某些实施方式中，提高的表达水平是指群体中表达核酸的细胞数量。

在某些实施方式中，提高的表达水平是指一个或更多个细胞或细胞群体表达的mRNA或蛋白质的强度或数量。

在某些实施方式中，在冷冻保存之前用核酸转染细胞。

在某些实施方式中，在冷冻保存之后，例如在解冻之后，用核酸转染细胞。在某些实施方式中，在冷冻保存之后的解冻后至少约0.1h、0.2h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h转染细胞。

在某些实施方式中，核酸包含用于CRISPR基因编辑的核酸分子，例如，编码Cas9蛋白、CPF1蛋白的核酸和/或用于预定靶标的向导RNA(参见，例如，Cong等，Science Feb 15；339(6121)：819-23(2013)；Hsu等，Cell.2014Jun 5；157(6)：1262-78；Ran等，NatureProtocols Nov；8(11)：2281-308.(2013)；Gilbert等，Cell 2013Jul 18；154(2)：442-51；Staahl等，Nat Biotechnol.2017May；35(5)：431-434；和Mali等，Science.2013Feb 15；339(6121)：823-6，其每一个的内容整体并入以供参考)。

在某些实施方式中，提供转染细胞的组合物。在某些实施方式中，提供试剂盒，其包含用于实施一种或更多种上述方法的材料。此类试剂盒可包含例如冷冻保存细胞和编码用于CRISP基因编辑的分子的核酸，或包含启动子序列的表达盒等。

6.实施例

通过参考以下实施例将更好地理解本公开的主题，实施例作为本公开的主题的示例提供，而不是作为限制。

实施例1：冷冻保存的解离多能干细胞用于解冻后，无需传代。

概要

人多能干细胞(PSC)为细胞替代疗法和疾病建模提供了无限的细胞来源。尽管功能强大，但技术方面却阻碍了可重复性。这里描述的是对PSC工作流程的简单修改，它消除了几乎所有PSC实验的主要变量：PSC起始材料的质量和数量。大多数实验室会连续传代PSC，并且在扩增后会少量使用，但是这些实验的“及时”性质意味着在使用前很少进行质量控制。缺乏质量控制意味着PSC的质量、无菌性和遗传完整性可能会受到损害，从而在获得的结果中造成混淆因素。此处公开的方法称为冷冻暂停(图7)，将PSC的培养物解离成单个细胞，并将PSC储存为一次性使用的冷冻小瓶，可解冻后立即用于实验，如分化。

在这里，对冷冻暂停法冷冻保存的细胞相对于传统方法培养的细胞进行了测试。此处显示短期生存力或多能性无差异。进一步的冷冻暂停显示中胚层和神经分化的分化效率没有损失。解冻后的生存力通常大于90％，并且发现解冻后干细胞标志物表达无显著差异。发现冷冻暂停细胞可以解冻并直接分化或遗传修饰而无需扩增。当前数据为任何实验室使用PSC提供了一种简单、新的方法，它将提高可重复性，帮助分化前同步不同的PSC系，并消除了在为细胞疗法和疾病建模应用扩增PSC的过程中的遗传不稳定和污染的可能性。

冷冻暂停允许从相同的、质量控制的PSC中重复进行多个实验，并消除了在为细胞疗法和疾病建模应用扩增PSC的过程中的遗传不稳定和污染的可能性。此外，冷冻暂停允许人们从相同的起始PSC群体在不同的时间点执行多种分化或基因修饰实验。它使地理上分开的实验室可以在相同的起始PSC群体上进行实验。除了一致性之外，还可以在使用前对每个库进行预验证，以减少高水平的自发分化、污染或遗传完整性损害实验的可能性。任何实验室都可以实施冷冻暂停来提高疾病建模和细胞疗法应用的可重复性。

结果

目前的研究表明，在生存力、多能性和分化能力上没有差异，但是观察到植板率(plating efficiency)略有下降。冷冻暂停可以放大。例如，可以构建来自4层细胞工厂的2.8亿个细胞库。在本实施例中，将细胞以每瓶高达3000万个细胞的浓度冷冻，而解冻后的生存力没有明显降低。

开发冷冻暂停条件

确定是否可以去除解冻后的扩增，以提高干细胞实验的可重复性。绕过恢复和扩增可能需要较高的解冻后生存力才能实用。使用在Essential 8^TM培养基中使用WA09(H9)无饲养层的培养物的临床范例(E8；Chen等，2011)。在洗涤并重悬于FreSR^TM-S(一种专为单分散人多能干细胞冷冻保存而设计的商业培养基)之前，用Accutase处理WA09细胞以产生单细胞悬液。使用标准程序将细胞冷冻保存在控制速率的冷冻机中，然后作为“即用型”等分试样长期保存在液氮中(请参见材料和方法)。初步实验表现出惊人的高解冻后生存力。研究了细胞系、冷冻保存培养基和控制速率冷冻机对解冻后生存力的影响，发现在E8培养基中使用无饲养层培养时，未发现对这些变量有明显的依赖性。不同的PSC系(图5A)、不同的冷冻保存培养基(图5B)和常规的慢速冷却(图5C)在效率上没有明显的区别。主要因素似乎是初始培养条件，因为使用传统的基于饲养层的方法扩增的WA09细胞生存力较低，尽管在FreSR^TM-S中这种生存力的下降得到了缓解(图5D)。

为了平衡实验，除非另有说明，否则基线条件是在控制速率冷冻机中在FreSR^TM-S中的WA09冷冻暂停。当使用吖啶橙/碘化丙啶(AOPI)进行无偏自动细胞计数器测量时，这种条件通常产生的解冻后生存力仅比未冷冻的对照WA09细胞低几个百分点(图1A&1F)。建立多个库后，据了解，解冻后的生存力仅受输入培养物的生存力冷冻暂停限制(图1B)。在液氮中保存长达一年(迄今为止测试的最长时间点)，未观察到生存力或多能性损失(图5E)。

尽管解冻后生存力极佳，但在培养24小时后，植板率有所下降(数据未显示)，因此可以接种更多的冷冻暂停细胞，以弥补这种植板率的差异(冷冻暂停中400,000个细胞/cm²，新鲜对照中200,000个细胞/cm²)。

验证冷冻暂停细胞

为了评估冷冻暂停细胞的健康状况，在接种一天后(通常会诱导分化)检查PSC标志物。用流式细胞术测量的冷冻暂停和新鲜对照细胞之间的多能干细胞标志物SSEA3、SSEA4、OCT4、SOX2和NANOG没有明显差异(图1C和1D)。自发分化标志物SSEA1没有增加(图1C和1D)。免疫荧光分析独立验证了流动结果，两群体间无明显差异(图1E)。

为了对冷冻暂停PSC中的多能性特征进行更全面的检查，使用PluriTest比较对照和冷冻暂停培养物(Müller等，2011；Williams等，2011；Müller等，2012)。PluriTest基于全基因组转录谱，可以可靠地评估未分化干细胞培养物中的多能性。简而言之，PluriTest使用“多能性评分”分析了大量多能性相关转录本的表达，并使用第二个度量标准，即“新奇评分”，检测被测样品与通常在遗传和表观遗传正常的人多能干细胞中观察到的总体转录模式的一致性。使用PluriTest，发现对照和冷冻暂停WA09样品均通过了经验定义的多能性和新奇评分阈值，并证明符合新奇一类分类器模型，这表明这两个样品组的基因表达模式与在特征良好的hESC和hiPSC细胞系中观察到的基因表达模式高度相似(图1G)。还通过简化代表性重亚硫酸盐测序(RRBS)对冷冻暂停细胞的表观遗传学风貌进行了调查，发现对照细胞和冷冻暂停细胞之间常见CpG单元的甲基化水平具有很强的一致性(图1H；MAD＝0.122)，与技术重复中观察到的一致甲基化水平相当(Kacmarczyk等，2016)。

多能性的另一种度量是畸胎瘤的产生。对照和冷冻暂停培养物产生的畸胎瘤具有大致相同的尺寸和动力学(图5F)。苏木精和曙红染色的冷冻暂停畸胎瘤切片显示了所有3个胚层的衍生物(图1I：内胚层[黑色箭头]，中胚层[绿色和蓝色星号]和外胚层[红色箭头])。总体而言，这些数据表明通过在解冻后直接使用冷冻暂停细胞进行的流式细胞术、PluriTest、CpG甲基化和畸胎瘤形成，关键多能性标志物的表达没有差异。

为了评估基因组中具有双链DNA断裂的细胞比例，在高内涵显微镜上对核gH2AX进行了定量免疫荧光分析(图1J和1K；供查阅，请参见Redon等，2002)。表达gH2AX的细胞百分比没有统计学差异。为了验证该实验，并观察是否冷冻暂停细胞对DNA损伤剂更敏感，加入了喜树碱(一种细胞毒性喹诺酮类生物碱)。喜树碱暴露后表达γΗ2ΑX的细胞百分比无统计学差异。最后，我们分析了解冻后冷冻暂停细胞上的核型，以测试总体遗传异常。在对照(20/20中期染色体涂片(metaphase spreads))和冷冻暂停培养物中(20/20中期染色体涂片：图1L)中发现了正常的核型。

定向分化和细胞疗法

由于在冷冻暂停细胞和对照细胞之间几乎没有差异，因此评估了冷冻暂停细胞的体外分化能力。将对照和冷冻暂停细胞暴露于双重SMAD抑制作用下，将WA09 hESC定向至神经命运(Chambers等，2009)。随时间测量OCT4和PAX6以评估神经分化的效率和动力学。在神经诱导的时间和程度上均无差异(图2A-2C和2K)。在分化的程度和动力学上，定向于中胚层命运的冷冻暂停细胞也难以区分(图2D-2F和2L)。这两种细胞的命运都相对不成熟，因此更容易形成，因此尝试从冷冻暂停细胞制造中脑多巴胺神经元(Barker等，2015)。WA09冷冻暂停细胞从临床上兼容的“标准操作程序”中有效创建了FOXA2/TH双阳性、有丝***后中脑多巴胺神经元，并且显示出与来自对照细胞的神经元相似的基因表达谱(图2I和2J)。

以制造商指定的细胞密度100万个细胞/mL用FreSR^TM-S冷冻保存。该密度足以用于规模较小的实验，但对于需要大量细胞的应用(例如，每个实验需要数十亿个细胞的细胞疗法)的应用成为限制。因此，测试了在冷冻保存期间增加细胞密度是否会对生存力或植板率产生不利影响。当将细胞冷冻至密度高达3000万/mL(测试最高)时，发现生存力(图2G)或植板率(数据未显示)无明显差异。高密度制剂应为通常需要在制造前输入数十亿个PSC的大多数治疗性应用提供合理的工作流程。

冷冻暂停的优势在于建立了大型的、有特点的、即用型细胞库。尽管此策略有很多优点，但缺点是它要求在冷冻保存和质量控制之前同时执行所有PSC扩增。为了扩大规模，使用了“细胞工厂”：连体烧瓶，其允许一次可轻松饲养所有层，可轻松调整为具有自动化的封闭系统。使用4层烧瓶尺寸(2528cm²，或约44×6孔板)扩增PSC，每个工厂的平均产量为～2.5亿个细胞(n＝3)。在这种“工厂”中生长的问题在于，由于分层烧瓶不允许直接的显微镜观察，因此在扩增过程中很难监测其形态。为了验证冷冻暂停库是否正确扩增，测试了PSC标志物，发现工厂扩增的细胞具有相同的标志物表达(图2H和2M)，并且能够分化(数据未显示)。

遗传修饰

由于冷冻暂停细胞在解冻后24小时内表现正常，因此研究了解冻后细胞是否可以立即进行基因操作。将刚解冻后的冷冻暂停WA09细胞的核转染效率与新鲜对照细胞进行比较。用GFP质粒进行核转染后24小时，荧光显微镜检查显示在两种条件下均具有GFP+细胞，流式细胞术定量显示>85％的细胞表达了GFP(图3A-3C和4A-4B)。如转导后24小时荧光显微镜所显示的，立即解冻的冷冻暂停细胞也可以成功地通过表达EmGFP的仙台病毒载体进行转导(图3D)。来自CP的仙台转导的亚克隆可以繁殖至少15代(测试的最长时间)。

核转染成功表明解冻后基因组修饰可能起作用。为了测试靶向的基因组修饰，使用了iCRISPR系统，将含有可诱导Cas9的PSC设计到AAVS1位点(Gonzalez等，2014)。扩增WA01(H1)iCRISPR细胞，然后在冷冻暂停前24小时用强力霉素处理：这产生了在冷冻前预先表达了Cas9的冷冻暂停细胞。解冻后，在基因组分析之前，将HPRT向导RNA对这些细胞进行核转染。冷冻暂停的表达Cas9的iCRISPR细胞解冻后立即用HPRT向导RNA进行核转染。在冷冻暂停和对照iCRISPR WA01(H1)细胞之间，HPRT靶向突变的效率没有明显差异(图3E和4C)。

讨论

描述了一种新方法(冷冻暂停)，该方法消除了大多数基于多能干细胞的应用的关键变量：分化或基因组修饰之前的多能细胞的性质。公认的是，冷冻保存的hPSC在使用前需要恢复、扩增和传代。本实验表明，与未冷冻的平行“新鲜”细胞相比，解离的人多能干细胞可以冷冻保存为单细胞悬液，解冻后生存力几乎没有损失，并且植板率略有降低。当前数据表明，实现这一模式改变的技术驱动力是培养系统，其中观察到使用多种冷冻保存模式的E8扩增细胞的恢复率提高(Liu和Chen，2014)。

与常规的PSC培养相比，冷冻暂停具有许多优势。冷冻暂停可使准备好分化的大细胞库锁定在限定的状态，从而提高了可重复性。质量测试，例如测量污染(细胞系、支原体、细菌)、遗传不稳定性、多个iPS系的同步性以及培养物的纯度可以验证整个库，而不是进行连续监视。

最好使用来源于众多健康个体和患病个体的多个iPSC克隆来完成疾病建模研究。常规的平行培养方法是劳动密集型和费时的，因为必须同时进行多个系的维持和定向分化，以提供用于实验的新鲜原料的连续来源。以不同速率扩增的iPS系使分化和平行传代的同步启动复杂化，通常会导致一种折衷，即最大化某个时间点准备就绪的培养物的数量：其余的往往不足或过度扩增。连续培养还会在延长培养过程中增加细胞系交叉污染、在实验过程中意外引入微生物或使用获得基因组异常的细胞的风险。冷冻暂停将PSC扩增中的工作与分化实验分开。它允许从相同的PSC库中重复进行分化，从而完全消除了PSC制备中的变异性。完整的质量控制标准(例如PSC标志物状态、遗传完整性、无菌性和细胞系认证)可以在使用前验证每个库。目前，大多数实验室在使用过程中或甚至可能在系列传代开始之前就进行“抽查”。几乎可以肯定，“及时”PSC工作流程的变量会降低几乎所有PSC应用程序的稳健性和可重复性。这也可能不方便，因为由于PSC扩增速率的不确定性，何时可以开始分化，这会变得很复杂。

对于制造细胞疗法而言，冷冻暂停的优势可能更加深远。在典型的细胞疗法工作流程中，将hPSC扩增并存储在GMP设施中，然后再进行昂贵且费时的测试以验证细胞库。将该PSC库向治疗有用的细胞类型转化通常需要在开始分化为治疗细胞类型之前从冷冻保存状态恢复并限制细胞传代的次数。这产生以次优状态启动具有PSC的细胞库分化的可能性，潜在地降低了可重复性和产物产量。制造过程可能会花费大量时间和金钱，并可能潜在地导致患者发生不良事件。制造的可重复性也是监管机构在评估供人使用的细胞产品时检查的关键属性之一。如果能够验证冷冻暂停在细胞疗法中的应用，那么PSC扩增的时机、产量和质量作为细胞疗法的变量可以完全排除。此处显示，使用临床兼容的SOP可以将冷冻暂停WA09细胞定向至中脑多巴胺神经元。

在某些细胞替代疗法中使用PSC衍生物的一大问题是使细胞的HLA状态与患者相匹配。自体iPSC是创建患者匹配细胞并避免免疫错配的一种策略。但是自体策略存在相当大的实际和潜在的安全问题。这导致了许多大规模的努力来存储大量的PSC系，以便在临床使用之前可以对其进行仔细的质量控制，但仍为异体移植的特定患者提供紧密的HLA匹配。在这种情况下，使用冷冻暂停可以简化将许多不同的PSC转换为临床有用细胞的过程。

方法与材料

人多能干细胞维持

首先将WA09(H9)和960.1B iPSC系维持在以1:50稀释于DMEM/F12(ThermoFisher，#11330032)的Geltrex(Thermo Fisher，#A1413202)上的Essential 8^TM(E8，ThermoFisher，#A1517001)培养基中，并在刮擦(以保持菌落结构)之前每3-4天使用短暂(3分钟)0.05％胰蛋白酶-EDTA(Thermo Fisher，#25300054)处理传代(作为簇)，并用新鲜E8培养基洗涤两次。细胞与10μM Y-27632再接种(replated)24小时。在第30-55代之间使用细胞，未发现异常核型。

图5D使用的WA09细胞保持在以10,500个细胞/cm²的密度接种的MEF上，具体取决于所使用的批次(Applied StemCell,Inc.)。在一周中，每天用hPSC培养基[由DMEM/F12、20％敲除血清替代品(Thermo Fisher，#10828028)、3.5mM L-谷氨酰胺(Thermo Fisher，#25030081)、0.1mM MEM NEAA(Thermo Fisher，#11140050)、55μM2-巯基乙醇(ThermoFisher，#21985023)和6ng/mL rhFGF basic(R&D Systems，#233-FB)组成]饲养PSC。在星期五，细胞通常用补充有StemBeads(StemCultures,Inc.，SB500)、时释性FGF2的培养基饲养，使得培养物在周一饲养之前保持静态。可在http://stemcells.mskcc.org上获得基于hPSC饲养层培养基的工作规程。

冷冻暂停细胞的生产

为了创建冷冻暂停细胞库，将在E8培养基中生长的PSC用Accutase(InnovativeCell Technologies，#AT-104)在37℃的孵育箱中解离30分钟。用2倍体积的E8(相对于细胞：Accutase)洗涤细胞，并离心以沉淀细胞(200×g，室温下5分钟)。吸出上清液，并重复冲洗。除非另有说明，否则最后将细胞以1000万个细胞/mL的浓度悬浮于FreSR-S^TM(Stem CellTechnologies，#05859)中。将FreSR-S：细胞混合物添加到预冷的冷冻管中，然后使用以下程序在控制速率的冷冻机中冷冻：

步骤1：在4℃下等待；步骤2：1.2℃/min(样品)至-4℃；步骤3：25℃/min(腔室)至-40℃；步骤4：10℃/min(腔室)至-12℃；步骤5：1.0℃/min(腔室)到-40℃；步骤6：10℃/min(腔室)至-90℃；步骤7：在-90℃下等待。一旦控制速率的冷冻机达到-90℃，就将冷冻管迅速转移到液氮罐中。

图5B和5C中使用的其它冷冻保存培养基是PSC冷冻保存试剂盒(Thermo Fisher，#A2644601)、Stem-CellBanker GMP(AMSBIO，#11890)和含有10％DMSO(Sigma Aldrich，#2650)的E8培养基。图5C中使用的常规冷冻被定义为在将小瓶转移至液氮罐之前，将小瓶在-80℃的细胞冷冻容器中储存24小时。

干细胞标志物的流式细胞术和免疫荧光分析

根据制造商的规程，使用人多能干细胞分选和分析试剂盒(BD Biosciences，#560461)和人多能转录因子分析试剂盒(BD Biosciences，#560589)在BD FACS Aria III上来定量干细胞标志物。对于免疫荧光染色，使用以下一抗：NANOG(1:200，BD Biosciences，#560482)；OCT4(1:200，Santa Cruz Biotechnology，#sc-9081)；SOX2(1:100，R&DSystems，#AF2018)。以1：400使用合适的Alexa Fluor偶联的二抗(Thermo Fisher)。

PluriTest分析

PluriTest基于全基因组转录组微阵列数据分析。简而言之，采用与先前描述的相同的程序(Müller等，2011；Williams等，2011；Müller等，2012)。按照制造商的说明，使用Qiagen RNeasy分离试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从每个培养条件(对照和冷冻暂停，每个样品1×10⁶个细胞)的两个生物学重复中分离RNA。按照制造商的说明(Müller等，2011；Williams等，2011；Müller等，2012)，进行杂交Illumina HT12v4芯片。所得的原始数据用R/Bioconductor lumi-package处理(Du等，2008；Lin等，2008；Müller等，2011)。已经认识到，由于扫描仪技术的变化和通过Illumina对杂交方案的修改，近年来PluriTest的结果往往显示出较低的多能性评分和较高的新奇评分(Bernhard Schuldt，德国基尔石勒苏益格-荷尔斯泰因大学医院，个人交流)。即使考虑到这种技术偏见，对照样品和冷冻暂停样品也都通过了经验多能性评分阈值，并且两个生物学重复都具有较高的新奇评分阈值。

简化代表性重亚硫酸盐测序

对于测序文库的制备，根据制造商的说明，将1μg高质量的基因组DNA与NEXTFlex重亚硫酸盐-Seq试剂盒(Bioo，#5119-01)一起使用。未甲基化的λDNA掺入量为1％，以评估硫酸氢盐对话(bisulfate conversation)的水平。进行12个PCR循环。样品在Hiseq 2500快速模式配对末端125上运行，每个样品平均产生1.4亿个读数。

RRBS DNA甲基化分析

FASTQ文件由bcl2fastq(V2.17)生成，并根据Illumina的纯粹(chastity)过滤器进行过滤以进行通过过滤器读取。用FLEXBAR(V2.4)(Dodt等，2012)修剪测序接头(adapters)，使用Bismark(V0.14.4)(Krueger等，2011)和Bowtie2(V2.2.5)(Langmead等，2012)进行基因组比对以参考人类基因组hg19，并使用自定义PERL脚本计算每碱基CpG甲基化指标(Garrett-Bakelmann等2015)。

γH2AX定量免疫荧光

将单个PSC以100,000个细胞/cm²接种于在Geltrex包被的培养皿上的含有10μMY-27632的E8培养基中。24小时后，在37℃下将细胞用含有0.5μM喜树碱(Sigma，#C9911)的E8处理1小时。然后，细胞针于磷组蛋白H2A.X染色(1:300，Millipore，#05-636)以及以1:400使用适当的Alexa Fluor偶联二抗。使用eHarmony软件在Perkin-Elmer Operetta上采集图像并分析。

神经诱导

使用Chambers等2009的衍生物。在神经诱导之前，将单个PSC以200,000(新鲜对照)或400,000细胞/cm²(冷冻暂停)接种于包被Geltrex的培养皿(1:30)上的含有10μM Y-27632的E8培养基中。24小时后，除去培养基，并添加含有100nM LDN189193和10μMSB431542(LSB)的Essential 6^TM(E6)培养基(Thermo Fisher，#A1516401)。将细胞用E6培养基+LSB饲养三天，然后在3次饲养过程中逐步过渡到N2培养基(见下文)，每两天用新鲜培养基替换一次。通过对OCT4(BD Biosciences，#560186)和PAX6(BD Biosciences，#562249)的流量分析来定量神经转化的效率。还使用针对OCT4和PAX6(1：200，BD Biosciences，#561462)的抗体对培养物染色。中脑多巴胺神经元是使用Kriks等2011的改良方法制成的。简而言之，在最终停药(withdrawal)之前，将如上在Geltrex上生长的WA09细胞用SHH和WNT信号进行双重SMAD抑制。停药后，添加中脑多巴胺支持性培养基，其中含有相同的生长因子和在Kriks等2011(正在准备手稿)中发现的小分子。使用针对酪氨酸羟化酶(1：1000，Thermo Fisher，#P21962)和FOXA2(1：200，R&D Systems，#AF2400)的抗体对培养物进行染色。以1：400使用合适的Alexa Fluor偶联的二抗。

第0天：E6+100nM LDN189193和10μM SB431542

第1天：E6+100nM LDN189193和10μM SB431542

第2天：E6+100nM LDN189193和10μM SB431542

第4天：3:1的E6与N2+100nM LDN189193和10μM SB431542

第6天：1:1的E6与N2+100nM LDN189193和10μM SB431542

第8天：1:3的E6与N2+100nM LDN189193和10μM SB431542

第10天：N2+100nM LDN189193和10μM SB431542

N2培养基包含500mL DMEM/F12，其中含有1g碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，#S5761)、0.78g葡萄糖(Sigma-Aldrich，#G7021)和0.5mL 2-巯基乙醇(Thermo Fisher，#21985023)。在添加5mL N2补充剂B(Stem Cell Technologies，#07156)和0.02nM孕酮(10μL的1mM储备液溶于100％乙醇，Sigma-Aldrich，#P8783)之前，将培养基进行无菌过滤(22μm)。

中胚层诱导

如上接种单个PSC。24小时后，移除培养基并添加含有5μM CHIR99021(Stemgent#04-0004-10)的E6培养基以产生中胚层(Lam等，2014)。每24小时更换一次含有5μMCHIR99021的E6，长达4天。通过对OCT4(BD Biosciences，#560186)和Brachyury(R&DSystems，#IC2085A)的流量分析来定量转化效率。使用针对OCT4和Brachyury(1:40，R&DSystems，#AF2085)的抗体对培养物进行染色和以1:400使用适当的Alexa Fluor偶联二抗。

定量RT-PCR

使用无RNase的DNase套件(Qiagen，#79254)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，#74106)从细胞沉淀物中分离RNA。使用RT2第一链试剂盒(Qiagen，#330404)和EppendorfMastercycler PCR仪进行RNA样品的逆转录和cDNA合成。使用RT2 SYBR Green Mastermix(Qiagen，#330503)制备用于qPCR分析的cDNA样品。样品在包含以下Qiagen引物的定制RT2Profiler PCR Array上运行：OTX2(PPH16151)、FOXA2(PPH00976)、CORIN(PPH58029)、SHH(PPH02405)、LMX1A(PPH22219)、LMX1B(PPH12240)、EN1(PPH00986)、NR4A2(PPH02082)、NEUROG2(PPH11564)、ASCL1(PPH07090)、TH(PPH02062)、CHRNB3(PPH01891)、DDC(PPH19374)、CCK(PPH22272)、DRD2(PPH01876)、PITX3(PPH12380)、SLC18A(PPH01437)、KCNJ6(PPH01415)、SLC17A6(PPH14888)、POU4F1(PPH14485)、NKX6-1(PPH17340)、SIM1(PPH11011)、NKX2-1(PPH00246)、FEV(PPH02033)、NKX2-2(PPH01574)、GBX2(PPH13900)、DBH(PPH02066)、ISL1(PPH02461)、FOXG1(PPH01973)、HOXB2(PPH05804)、DLX2(PPH01943)、GATA3(PPH02143)、PHOX2A(PPH15630)、PHOX2B(PPH10361)、PAX6(PPH02598)、FABP7(PPH02438)、MAP2(PPH02419)、POU5F1(PPH02394)、PRR16(PPH13057)、KRT19(PPH01004)、MKI67(PPH01024)、TOP2A(PPH01520)、GFAP(PPH02408)、ACTB(PPH00073)、TBP(PPH01091)、HGDC(PPH65835)、RTC(PPX63340)和PPC(PPX63339)。使用Bio-Rad c1000接触式热循环仪CFX96实时系统(Bio-Rad，#1855195)进行分析。

畸胎瘤

将NSG小鼠(Jackson Laboratories)用于体内研究，并按照MSKCC机构动物护理和使用委员会和研究动物资源中心批准的指南进行护理。8周大的雌性小鼠侧腹皮下注射300万个H9细胞和以1:2混合于HEPES缓冲HBSS中的Matrigel^TM(BD Biosciences)。每天观察小鼠的发病/死亡迹象，并每周至少两次评估体重。使用卡尺每周两次测量肿瘤，并使用公式长度×宽度2×0.52计算体积。在研究结束时，将肿瘤固定在10％***中，进行处理，包埋在石蜡中，切片并用苏木精和曙红(H&E)染色。由病理学家检查显微镜载玻片。

使用细胞工厂

在冷冻暂停之前，使用Nunc^TMCell Factory^TM系统(4个托盘层)(Thermo Fisher，#140004)来扩展大型库。细胞在传代后的前两天用500mL E8培养基饲养，在第三天用600mLE8培养基饲养。为了产生单细胞悬液，在37℃下添加140mL的Accutase 30分钟，然后用100mL的培养基洗涤托盘。

核转染/iCRISPR

为了对冷冻暂停细胞进行核转染，使用了Amaxa^TMCell Line Nucleofector^TM试剂盒V(Lonza，#VCA-1003)。将WA09冷冻暂停细胞解冻并洗涤。将100μL的溶液V与22.2μL的补充剂1混合，并向100μL的该混合物中添加500万个冷冻暂停细胞。在程序B-016(LonzaNucleofector^TM 2b装置)上进行核转染之前，将10μl的GFP对照质粒加入反应中。如上所述，将核转染的细胞添加至在Geltrex上的含有10μM Y-27632的E8。图3A和图4B为活细胞成像，通过用Accutase处理培养物、洗涤、并重悬于含0.1％BSA的PBS中来测定荧光细胞的数量，然后测量BD FACS Aria III上的荧光。使用FlowJo分析流量数据，并使用Adobe Photoshop调整免疫荧光图像。

为了进行冷冻暂停iCRISPR基因修饰，在经过24小时的Dox处理以诱导Cas9之前，将WA01(H1)iCRISPR细胞如上所述扩增(Gonzalez等，2014)。在冷冻暂停之前，如上所述收集Cas9诱导的细胞并洗涤。将冷冻暂停细胞解冻并洗涤，然后用200ng从GeneArt(ThermoFisher)购买的HPRT向导RNA进行核转染。向导序列为CATTTCTCAGTCCTAAACA。

仙台转导

将冷冻暂停的WA09细胞解冻，洗涤并重悬于补充有10μM Y-27632的E8培养基中，表达EmGFP的仙台病毒载体(CytoTune^TMEmGFP，ThermoFisher Scientific，#A16519)以5的感染复数添加。转导的CP细胞在E8中重新接种并扩增。转导的细胞可以扩增至少15代。

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实施例2：冷冻保存的解离的多能干细胞以比非冷冻保存的细胞更高的水平表达外源核酸。

如实施例1所述，将WA09人胚胎干细胞冷冻保存、解冻并在解冻后立即用3.4kbGFP质粒进行核转染。将未经冷冻保存的新鲜非冷冻对照WA09细胞进行类似的核转染，并在核转染后24小时使用流式细胞术分析GFP的表达。未转染的WA09细胞也用作阴性对照。如图8A所示，冷冻暂停细胞表现出不同的小DNA摄取模式：总体上，略少细胞表达来自小质粒的GFP，但它们确实表现得更亮，表明冷冻暂停使细胞更有能力摄取大量的DNA。在整个细胞库中，具有较少构建体的较低比例可能是DNA滴定的结果：也就是说，摄取大量质粒的细胞可能对通常摄取较少DNA的群体中的细胞留下很少的数量。

还用表达mCherry的更大的9.3kb CRISPR/Cas9质粒对WA09冷冻暂停和新鲜的非冷冻细胞进行了核转染。用2.5μg、5μg、7.5μg、10μg和12.5μg的质粒对细胞进行核转染。还在冷冻暂停和新鲜的非冷冻条件下，用2.5μg质粒测试了第二核转染溶液HSC2。如图8B和8C所示，与新鲜的非冷冻细胞相比，HSC缓冲液冷冻暂停的WA09细胞在所有浓度下均表现出更高的表达水平。

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