阅读说明：本技术 利用多能干细胞进行的伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善和治疗 (Amelioration and treatment of brain damage with fetal growth retardation using pluripotent stem cells ) 是由 佐藤义朗 北濑悠磨 清水忍 水野正明 早川昌弘 出泽真理 辻雅弘 于 2018-06-20 设计创作，主要内容包括：本发明的目的在于,提供一种在再生医疗中使用多能干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途。本发明提供一种含有从生物体的间充质组织或培养间充质细胞分离的SSEA－3阳性多能干细胞、用于对运动质量异常、神经发展异常等伴随胎儿生长迟缓的脑损伤进行改善和治疗的细胞制剂和医药组合物。本发明的细胞制剂是基于下述机制假设的：通过对具有上述障碍的对象用Muse细胞给药而植入受损脑组织,对上述障碍进行改善和治疗。(The purpose of the present invention is to provide a novel medical use of pluripotent stem cells (Muse cells) for regenerative medicine. The present invention provides a cell preparation and a pharmaceutical composition for improving and treating brain damage accompanied by fetal growth retardation, such as abnormal motor quality and abnormal nerve development, which contain SSEA-3-positive pluripotent stem cells isolated from mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells of an organism. The cell preparation of the present invention is based on the following mechanism hypothesis: the above-mentioned disorders are ameliorated and treated by implanting damaged brain tissue with Muse cell administration to a subject having the disorder.)

利用多能干细胞进行的伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善和 治疗

技术领域

本发明涉及再生医疗中的细胞制剂。更具体地，涉及含有多能干细胞、对伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的治疗有效的细胞制剂和新的治疗方法。

发明背景

胎儿生长迟缓(fetal growth retardation：FGR，或intrauterine growthrestriction：IUGR)由于各种原因而发病，妊娠中期发病的妊娠高血压综合征导致的FGR与介由胎盘的慢性低氧血症、循环衰竭、营养不良等综合作用，是精神发育迟缓、认知障碍等神经性后遗症的原因，还没有建立其治疗方法。目前，胎儿生长迟缓发现于全部妊娠的约8～10％，在约18％的围产期死亡例、约31％的胎儿死亡例中被确认。此外，胎儿生长迟缓也是新生儿的身高和体重均低于基准值的病理状况(small－for－gestational age：SGA)的原因，是神经性后遗症高风险群。为了预防该神经性后遗症，尝试了各种治疗介入，但均没有显著效果(非专利文献1)。

近年来，在再生医疗领域，针对各种疾病进行了使用干细胞的细胞疗法的研究，作为期待临床应用可能性的干细胞，已知有胚性干细胞(ES细胞)、神经干/祖细胞(NSPC)、人工多能干细胞(iPS细胞)、脐带血干细胞(UCBC)。

此外，骨髓间充质细胞部分(MSC)是从成体分离的，已知具有例如分化成骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等的能力(非专利文献2和3)。然而，MSC是含有各种细胞的细胞群，其分化能力的本质尚不明确，治疗效果波动大。此外，作为成体来源的多能干细胞，报道了iPS细胞(专利文献1)，但iPS细胞的建立需要对于作为间充质细胞的皮肤成纤维细胞级分将特定基因、特定化合物导入体细胞这种极为复杂的操作，而且iPS细胞具有高的肿瘤形成能力，因而对于临床应用存在极高的门槛。

根据作为本发明人之一的出泽的研究可知，存在于间充质细胞级分、无诱导操作而得到的、表达SSEA－3(Stage－Specific Embryonic Antigen－3)作为表面抗原的多能干细胞(Multilineage－differentiating Stress Enduring cells；Muse细胞)承担间充质细胞级分所具有的多能性，具有能够应用于以组织再生为目标的疾病治疗的可能性。此外，还已知Muse细胞可以通过用各种应力刺激间充质细胞级分来浓缩(专利文献2、非专利文献4)。然而，还没有表明在伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善和/或治疗中使用Muse细胞、获得期待的治疗效果的例子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特许第4183742号公报

专利文献2:国际公开第2011/007900号

非专利文献

非专利文献1:O’Keeffe M.J.等，Pediatrics，第112卷，第301－307页(2003)

非专利文献2:Dezawa，M.等，J.Clin.Invest.，第113卷，第1701－1710页(2004)

非专利文献3:Dezawa，M.等，Science，第309卷，第314－317页(2005)

非专利文献4:Wakao，S等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第108卷，第9875－9880页(2011)

发明概述

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，提供一种在再生医疗中使用多能干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途。更具体地，本发明的目的在于，提供一种含有Muse细胞、在伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的治疗中有效的细胞制剂和医药组合物、以及新的治疗方法。

用于解决课题的方法

本发明人等发现，在妊娠大鼠的子宫动脉中安装血管收缩器(AC)，制作慢性缺血模型，通过利用静脉注射用Muse细胞进行给药，伴随生长迟缓的脑损伤(例如学习障碍、运动障碍)得以改善，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]一种用于对伴随胎儿生长迟缓的脑损伤进行改善和/或治疗的细胞制剂，其含有从生物体的间充质组织或培养间充质细胞分离的SSEA－3阳性的多能干细胞。

[2]上述[1]所述的细胞制剂，其含有SSEA－3阳性多能干细胞由于外部应力刺激而浓缩的细胞级分。

[3]上述[1]或[2]所述的细胞制剂，前述多能干细胞为CD105阳性。

[4]上述[1]～[3]中任一项所述的细胞制剂，前述多能干细胞为CD117阴性和CD146阴性。

[5]上述[1]～[4]中任一项所述的细胞制剂，前述多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性和CD271阴性。

[6]上述[1]～[5]中任一项所述的细胞制剂，前述多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性和Dct阴性。

[7]上述[1]～[6]中任一项所述的细胞制剂，前述多能干细胞为具有以下性质的全部的多能干细胞：

(i)端粒酶活性低或没有端粒酶活性；

(ii)具有分化成三个胚层中的任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；和

(iv)具有自我更新能力。

[8]上述[1]～[7]中任一项所述的细胞制剂，伴随胎儿生长迟缓的脑损伤选***质量异常、神经发展异常、脑瘫、认知障碍、行为异常和运动障碍组成的组。

[9]上述[1]～[8]中任一项所述的细胞制剂，前述多能干细胞具有植入脑组织的能力。

[10]上述[1]～[9]中任一项所述的细胞制剂，对于人新生儿、婴儿或幼儿对象，用前述多能干细胞按作为治疗上的有效量的约1×10⁵细胞/个体～约1×10⁸细胞/个体进行给药。

[11]上述[1]～[10]中任一项所述的细胞制剂，对于人新生儿、婴儿或幼儿对象，用前述多能干细胞，作为治疗上有效量，用按该对象每一个体约1×10⁵细胞/kg～约1×10⁸细胞/kg实施了体重换算的细胞量进行给药。

发明效果

本发明可以利用下述脑组织再生机理使脑损伤显著减小：对于患有伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的对象，通过将Muse细胞从静脉等进行给药，选择性在受损脑组织中积累，Muse细胞在该组织内分化成构成脑组织的细胞。

具体实施方式

本发明涉及一种含有SSEA－3阳性的多能干细胞(Muse细胞)、用于对伴随胎儿生长迟缓的脑损伤进行改善和/或治疗的细胞制剂和医药组合物、以及新的治疗方法。以下详细地对本发明进行说明。

1.适用疾病及其诊断

本发明使用含有SSEA－3阳性多能干细胞(Muse细胞)的细胞制剂或医药组合物，目标是伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善和治疗。一般，围产期(就人而言，是从妊娠22周开始至出生后少于7天的时间)的生长迟缓有胎儿期引起的子宫内(胎儿)生长迟缓和出生后身体发育受到抑制的子宫外生长迟缓。这里，“胎儿生长迟缓”(或“子宫内生长迟缓”)是胎儿发育由于各种原因受到抑制的状态。作为胎儿因素，有多胎、胎儿畸形、染色体异常病、先天感染(先天性风疹、先天性巨细胞病毒感染、先天性弓形虫感染、先天性疱疹感染)等)，作为胎盘·脐带因素，可列举胎盘发育不全、绒毛膜下血肿、前置胎盘、绒毛膜羊膜炎、脐带附着异常、脐带扭转、脐带结节。作为母体因素，除了妊娠高血压综合征、心脏病、高血压、肾病、糖尿病、胶原病、呼吸系统疾病、自身免疫性疾病等母体的基础疾病以外，抽烟、喝酒、服用药物等生活习惯也是原因。除了胎儿畸形、染色体异常、先天感染等明确影响胎儿中枢神经系统的病例以外，与正常发育儿相比，子宫内发育不全儿的发展预后也差。已知，尤其在头围发育受到抑制的病例中，该倾向很显著。

根据胎儿的发育受阻的时间，胎儿生长迟缓大体分为“均衡型”和“不均衡型”。“均衡型”中细胞增殖受阻，因此细胞不足，颈部、躯干、四肢的发育受到同等程度的抑制，虽然是均衡的体型，但是，具有整体上小的特征。此外，关于出生后的预后，因为胎儿自身具有发育阻碍因子，所以存在预后差的倾向。妊娠初期胎儿方面的主要原因可列举染色体异常、先天畸形、胎内感染、酒精中毒等。而“不均衡型”的特征在于，局部(主要是躯干)细胞的大小小，虽然可观察到头部的发育，但躯干的发育受到抑制，因此形成瘦的体型。发病频率约为“均衡型”的2～3倍。关于出生后的预后，因为发育阻碍因素在于胎盘血流障碍(胎儿营养不良)，所以预后比较好。

这里，作为“胎儿生长迟缓”的定义，一般已知的是，“出生时的身高·体重均比基准值低10％”(SGA)、“比根据妊娠周(天)数对应的发育推测胎儿体重低10％”、或“使用标准化的胎儿体重推测算式的情况下，为标准值的－1.5SD以下”。这里，关于胎儿生长迟缓的诊断，初期是没有症状的，通常多在超声波检查中查明，进一步，更优选如上述那样使用标准化的胎儿体重推测算式(APES法)进行诊断。具体地，使用下述算式。

EFW(g)＝1.07×BPD³+0.30×AC²×FL

(式中，EFW：推测胎儿体重(estimated fetal weight)；BPD：双顶径(biparietaldiameter)；AC：腹围(abdominal circumference)；FL：股骨长度(femur length))

作为临床措施，对于被诊断为胎儿生长迟缓的胎儿，一般在使用生物物理特征评分(BPS)评价胎儿的状态的同时，在适当的时间进行分娩，转移至胎外治疗。出生后，在新生儿中，可观察到死亡、多血症、血小板减少、白细胞减少、胆汁淤积、消化道异常、低血糖、心力衰竭·肺出血、运动质量异常、脑瘫等；至于幼儿，则可观察到低身高、神经发展异常(认知障碍、行为异常)等；进一步，到了成人，可观察到葡萄糖耐量异常、心·血管异常、糖脂异常。这样，伴随胎儿生长迟缓产生各种后遗症。

本发明的目的在于，伴随胎儿生长迟缓的后遗症中，尤其是胎盘·脐带因素引起的低氧血症、循环衰竭、营养不良等复合性且慢性要因导致的后遗症、特别是运动质量异常(例如运动定位性·秩序性的下降、运动才能的下降等)、神经发展异常(例如智力/认知下降、学业问题、行为问题、对社会的适应性的下降等)的改善和治疗。如上所述，本发明以伴随胎儿生长迟缓的脑损伤作为改善和治疗的对象，特别是以慢性灌注不足(缺血)导致的脑损伤为适用疾病，这与伴随出生前或出生时的任何事件的低氧缺血导致的围产期脑损伤是有区别的。

根据本发明，为了治疗上述适用疾病，将后述细胞制剂和医药组合物对对象进行给药(以下有时统称为“移植”。)，能够实现适用疾病的改善和/或治疗。这里，“改善”的意思是伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的缓和以及恶化的抑制，优选意思是症状缓和至不妨碍日常生活的程度。此外，“治疗”是指抑制伴随胎儿生长迟缓的脑损伤或使其完全消失。

2.细胞制剂和医药组合物

(1)多能干细胞

本发明细胞制剂和医药组合物中使用的多能干细胞典型地是，作为本发明人之一的出泽发现了其在人活体内的存在、命名为“Muse(Multilineage－differentiatingStress Enduring)细胞”的细胞。Muse细胞可以从骨髓液、脂肪组织(Ogura，F.等，StemCells Dev.，2013年11月20日，(Epub)(2014年1月17日出版))、真皮***等皮肤组织获得，在各脏器的***中也零散存在。此外，该细胞是具有多能干细胞和间充质干细胞这两者的性质的细胞，例如经鉴定是作为它们的细胞表面标记的“SSEA－3(Stage－specificembryonic antigen－3)”和“CD105”双阳性的。因此，Muse细胞或含有Muse细胞的细胞群例如可以以这些抗原标记为指标从生物体组织分离。此外，Muse细胞是耐逆性的，可以利用各种应力刺激由间充质组织或培养间充质细胞进行浓缩。本发明细胞制剂也可以使用Muse细胞由于应力刺激而浓缩的细胞级分。Muse细胞的分离方法、鉴定方法和特征等的详细信息公开在国际公开第WO2011/007900号中。此外，正如Wakao等(2011，上述文献)报告的那样，可知由骨髓、皮肤等培养间充质细胞、使用其作为Muse细胞的母集团的情况下，SSEA－3阳性细胞全部为CD105阳性细胞。因此，本发明的细胞制剂和医药组合物中，从生物体的间充质组织或培养间充质干细胞分离Muse细胞的情况下，可以简单地以SSEA－3为抗原标记来纯化Muse细胞、进行使用。需要说明的是，本说明书中，对于用于对伴随胎儿生长迟缓的脑损伤进行改善和/或治疗的细胞制剂和医药组合物中能够使用的、以SSEA－3为抗原标记、从生物体的间充质组织或培养间充质组织分离的多能干细胞(Muse细胞)或含有Muse细胞的细胞群，有时简单地记载为“SSEA－3阳性细胞”。此外，本说明书中，“非Muse细胞”是指作为生物体的间充质组织或培养间充质组织所含的细胞的、“SSEA－3阳性细胞”以外的细胞。后述实施例中，根据涉及人Muse细胞的分离和鉴定的国际公开第WO2011/007900号中记载的方法从MSC将SSEA－3和CD105阳性细胞除去后的细胞群用作非Muse细胞。

简单来说，Muse细胞或含有Muse细胞的细胞群可以单独使用针对作为细胞表面标记的SSEA－3的抗体、或使用分别针对SSEA－3和CD105的抗体两者从生物体组织(例如间充质组织)分离。这里，“生物体”是指哺乳动物的生物体。本发明中，生物体不包括受精卵、发生阶段在囊胚期之前的胚，但包括胎儿、包括囊胚在内的囊胚期以后的发生阶段的胚。哺乳动物没有限定，可列举人、猴等灵长类、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等啮齿类、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、鼬等。本发明细胞制剂和医药组合物中使用的Muse细胞在直接使用标记从生物体的组织分离这一点上与胚性干细胞(ES细胞)、iPS细胞有明显区别。此外，“间充质组织”是指存在于骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、肌腱、牙髓、脐带、脐带血等组织和各种脏器中的组织。例如，Muse细胞可以由骨髓、皮肤、脂肪组织获得。例如，优选采集生物体的间充质组织，从该组织分离Muse细胞进行利用。此外，也可以使用上述分离方法，从成纤维细胞、骨髓间充质干细胞等的培养间充质细胞分离Muse细胞。本发明细胞制剂和医药组合物中，所使用的Muse细胞对于受体而言可以是自身的，或者也可以是其他个体的。

如上所述，Muse细胞或含有Muse细胞的细胞群例如可以以SSEA－3阳性和SSEA－3与CD105双阳性为指标从生物体组织分离，已知人类成人皮肤中含有各种类型的干细胞和祖细胞。然而，Muse细胞与这些细胞是不同的。这样的干细胞和祖细胞可列举皮肤来源祖细胞(SKP)、神经嵴干细胞(NCSC)、黑素细胞(MB)、血管周细胞(PC)、内皮祖细胞(EP)、脂肪来源干细胞(ADSC)。可以以这些细胞固有的标记的“不表达”为指标来分离Muse细胞。更具体地，Muse细胞可以以选自由CD34(EP和ADSC的标记)、CD117(c－kit)(MB的标记)、CD146(PC和ADSC的标记)、CD271(NGFR)(NCSC的标记)、NG2(PC的标记)、vWF因子(von Willebrand因子)(EP的标记)、Sox10(NCSC的标记)、Snai1(SKP的标记)、Slug(SKP的标记)、Tyrp1(MB的标记)和Dct(MB的标记)组成的组的11个标记中的至少1个、例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个标记的不表达为指标进行分离。例如，虽没有限定，但可以以CD117和CD146的不表达为指标进行分离，进一步，可以以CD117、CD146、NG2、CD34、vWF和CD271的不表达为指标进行分离，进一步，可以以上述11个标记的不表达为指标进行分离。

此外，本发明的细胞制剂和医药组合物中使用的具有上述特征的Muse细胞可以具有选自由以下：

(i)端粒酶活性低或没有端粒酶活性；

(ii)具有分化成三个胚层中的任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；和

(iv)具有自我更新能力

组成的组的至少1个性质。在本发明一个方面，本发明的细胞制剂和医药组合物中使用的Muse细胞具有全部的上述性质。这里，关于上述(i)，“端粒酶活性低或没有端粒酶活性”是指，例如使用TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore公司)检测端粒酶活性时，端粒酶活性低或检测不到。端粒酶活性“低”是指，例如具有与作为体细胞的人成纤维细胞同等程度的端粒酶活性，或与Hela细胞相比具有1/5以下、优选为1/10以下的端粒酶活性。关于上述(ii)，Muse细胞具有在体外(in vitro)和体内(in vivo)分化成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的能力，例如通过体外诱导培养，能够分化成肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。此外，有时在体内移植至***时，也显示出分化成三个胚层的能力。进一步，具有通过利用静脉注射移植于生物体而在受损脏器(心脏、皮肤、脊髓、肝、肌肉等)中移动和植入、分化成与组织对应的细胞的能力。关于上述(iii)，Muse细胞具有下述性质：在悬浮培养中以约1.3天的增殖速度增殖，在悬浮培养中从1个细胞开始增殖，制作胚状体样细胞块，在14天左右增殖停止；如果对这些胚状体样细胞块进行黏着培养，则细胞增殖再次开始，由细胞块增殖的细胞不断扩大。进一步，具有在移植至***的情况下，至少半年不会癌化的性质。此外，关于上述(iv)，Muse细胞具有自我更新(自我复制)能力。这里，“自我更新”是指，能够确认由通过利用悬浮培养从1个Muse细胞培养得到的胚状体样细胞块所含的细胞向3胚层性细胞的分化，同时，通过将胚状体样细胞块的细胞再次以1个细胞的形式进行悬浮培养，形成下一代的胚状体样细胞块，能够确认由此开始3胚层性的再次分化和悬浮培养下的胚状体样细胞块。自我更新可以重复1个或多个循环。

此外，本发明细胞制剂中使用的含有Muse细胞的细胞级分也可以是，通过包括对生物体的间充质组织或培养间充质细胞施加外部应力刺激、使耐受该外部应力的细胞以外的细胞死亡、回收幸存的细胞的方法得到的、具有以下性质中的至少1个、优选具有以下性质的全部的、SSEA－3阳性和CD105阳性多能干细胞浓缩而得的细胞级分。

(i)SSEA－3阳性；

(ii)CD105阳性；

(iii)端粒酶活性低或没有端粒酶活性；

(iv)具有分化成三胚层的能力；

(v)不显示肿瘤性增殖；和

(vi)具有自我更新能力。

上述外部应力可以是蛋白酶处理、低氧浓度下的培养、低磷酸条件下的培养、低血清浓度下的培养、低营养条件下的培养、暴露于热休克下的培养、低温下的培养、冷冻处理、有害物质存在下的培养、活性氧存在下的培养、机械刺激下的培养、振荡处理下的培养、应力处理下的培养或物理冲击中的任一种或多种的组合。例如，关于上述利用蛋白酶的处理时间，为了对细胞施加外部应力，优选合计进行0.5～36小时。此外，蛋白酶浓度可以是将黏着于培养容器的细胞剥下时、使细胞块分散为单个细胞时或从组织回收单个细胞时所使用的浓度。蛋白酶优选为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或N末端苏氨酸蛋白酶。进一步，前述蛋白酶优选为胰蛋白酶、胶原酶或中性蛋白酶。

此外，如后所述，本发明的细胞制剂中使用的具有上述特征的Muse细胞在通过静脉给药等对生物体进行给药后植入受损脑组织。然后，Muse细胞被认为会分化成构成该组织的细胞，改善和/或治疗伴随胎儿生长迟缓的脑损伤。

(2)细胞制剂和医药组合物的制备和使用

就本发明细胞制剂和医药组合物而言，没有限定，可通过将上述(1)中得到的Muse细胞或含有Muse细胞的细胞群悬浮在生理盐水、适当的缓冲液(例如磷酸缓冲生理盐水)中而得到。这种情况下，从自身或其他个体的组织分离的Muse细胞数少的情况下，可以在给药前对细胞进行培养，增殖至获得规定的细胞浓度。需要说明的是，正如已报告(国际公开第WO2011/007900号小册子)中所说，Muse细胞不会肿瘤化，因此即使以未分化的状态含有从生物体组织回收的细胞，癌化的可能性也低，是安全的。此外，没有特别限定地，回收的Muse细胞的培养可以在通常的增殖培养基(例如含有10％小牛血清的α－最低限度基本培养基(α－MEM))中进行。更详细地，可以参照上述国际公开第WO2011/007900号，在Muse细胞的培养和增殖中适当选择培养基、添加物(例如抗生素、血清)等，制备含有规定浓度的Muse细胞的溶液。在人对象中将本发明细胞制剂或医药组合物进行给药的情况下，可以从人的髂骨采集数mL左右的骨髓液，例如对作为来自骨髓液的黏着细胞的骨髓间充质干细胞进行培养，增殖至达到能够分离有效治疗量的Muse细胞的细胞量后，以SSEA－3的抗原标记为指标分离Muse细胞，制备自身或其他个体的Muse细胞作为细胞制剂。或者，例如可以以SSEA－3的抗原标记为指标分离Muse细胞后，培养细胞增殖至达到有效治疗量后，制备自身或其他个体的Muse细胞作为细胞制剂。

此外，Muse细胞在细胞制剂和医药组合物的应用中，细胞制剂和医药组合物中可以为了保护该细胞而含有二甲基亚砜(DMSO)、血清白蛋白等、为了防止细菌的混入和增殖而含有抗生素等。进一步，细胞制剂和医药组合物中还可以含有制剂上允许的其他成分(例如载体、赋型剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、舒缓剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)、间充质干细胞所含的Muse细胞以外的细胞或成分。本领域技术人员可以在细胞制剂和医药组合物中以适当的浓度添加这些因子和试剂。

上述制备的细胞制剂和医药组合物中所含的Muse细胞数可以考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态、所使用的细胞的状态等适当调整，以获得伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善和/或治疗中期望的效果(例如运动质量的改善、神经发展的改善)。后述实施例1中，通过在妊娠大鼠的子宫内安装血管收缩器(AC)、引起胎儿的慢性缺血，来制作子宫内发育模型。以由该亲本生产的陷入胎儿生长迟缓的模型大鼠为治疗对象，研究Muse细胞移植的治疗效果。对于体重约15～20g的该模型大鼠，通过按1×10⁴细胞/头(每个个体)用SSEA3阳性细胞给药，获得了非常优异的效果。由该结果可以期待，通过用人新生儿(出生后28天以内)、婴儿(出生后1年低于)或幼儿(出生后1～6年)每一个体约1×10⁵细胞/kg～约1×10⁸细胞/kg的换算成体重的细胞量进行给药，来获得优异的效果。例如将新生儿的体重设为约1,000g的情况下，作为给药量，可以认为估计约1×10⁵细胞/个体～约1×10⁸细胞/个体是有效的。另一方面，为了防止对血管的细胞给药导致的堵塞，作为1次给药的量，例如可以在细胞制剂中含有1×10⁷细胞/个体以下的SSEA－3阳性细胞。这里，个体包括大鼠、人，但不限定于此。此外，本发明细胞制剂和医药组合物可以多次(例如2～10次)、适当有间隔(例如1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次)地给药，直至获得期望的治疗效果。因此，作为治疗上的有效量，根据对象的状态的不同而不同，例如优选按每一个体1×10⁴细胞～1×10⁷细胞、1～10次的给药量。作为一个个体的给药总量，没有限定，可列举1×10⁵细胞～1×10⁸细胞、1×10⁵细胞～5×10⁷细胞、1×10⁵细胞～1×10⁷细胞、1×10⁵细胞～5×10⁶细胞、1×10⁵细胞～1×10⁶细胞、5×10⁵细胞～1×10⁸细胞、5×10⁵细胞～5×10⁷细胞、5×10⁵细胞～1×10⁷细胞、5×10⁵细胞～5×10⁶细胞、5×10⁵细胞～1×10⁶细胞、1×10⁶细胞～1×10⁸细胞、1×10⁶细胞～5×10⁷细胞、1×10⁶细胞～1×10⁷细胞、1×10⁶细胞～5×10⁶细胞等。

本发明细胞制剂和医药组合物以伴随胎儿生长迟缓的脑损伤为改善和治疗对象，作为给药时间，认为是在确认神经症状、发育迟缓后，在胎儿生长迟缓很强的情况下，也可以是出生后立刻给药。即，优选在受伤之后即刻给药，即使在受伤后过一段时间、例如受伤1小时后、1天后、1周后、1个月后、3个月后、6个月后，也可以期待本发明细胞制剂等的效果。此外，通过本发明人等的实验，确认了即使所使用的Muse细胞来自他人的情况下，也不会引起免疫应答，因而在伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善和治疗中可以适当给药直至获得期望的效果。需要说明的是，后述实施例2～4中，如果在使用由上述子宫内发育模型生产的模型大鼠(以下有时称为“胎儿生长迟缓模型大鼠”。)的、利用Muse细胞进行的伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善中进行行为学评价，则该脑损伤的改善显著可见。

需要说明的是，本发明细胞制剂和医药组合物中使用的Muse细胞具有在疾病部位积累的性质。因此，细胞制剂或医药组合物的给药中，它们的给药部位(例如腹腔内、肌肉内、疾病部位)、被给药的血管的种类(静脉和动脉)等没有限定。此外，作为确认给药的Muse细胞到达并植入疾病部位的方法，例如预先制作以表达荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP))的方式进行了基因导入的Muse细胞，对生物体给药后，利用能够检测荧光的系统(例如IVIS(注册商标)ImagingSystem(住商制药国际株式会社))进行观察，能够确认Muse细胞的动态。需要说明的是，本发明细胞制剂和医药组合物中使用的Muse细胞是人源性的，因此与大鼠是异种关系。在模型动物中用异种细胞等进行给药的实验中，为了抑制异种细胞在生物体内的排斥反应，可以在异种细胞给药前或给药同时给药免疫抑制剂(环孢素等)。

3.引起胎儿生长迟缓的子宫内发育模型的制作

本说明书中，为了研究本发明细胞制剂和医药组合物对伴随胎儿生长迟缓的脑损伤(例如运动质量异常、神经发展异常)的改善和治疗效果，可以构建引起妊娠大鼠中生长迟缓的子宫内发育模型，使用由该大鼠生产的具有脑损伤的大鼠。没有限定地，该子宫内发育模型例如可以通过下述方法来制作：在妊娠第17天的大鼠的子宫动脉的四个位置安装血管收缩器(ameroid constrictor：AC)(内径：0.45mm、0.40mm等)、微线圈(内径：0.24mm等)，引起胎儿的慢性缺血。所使用的AC的内部含有酪蛋白，内部有缺口，中心有孔，覆盖有宽的钛制的环。作为引起慢性缺血的作用机理，伴随AC内部所含的酪蛋白由于吸水缓慢膨胀而孔变小，安装有AC的子宫动脉部分的直径变窄，从而能够引起缺血。需要说明的是，没有限定地，子宫内发育模型中能够使用的大鼠一般可列举Wistar/ST系大鼠、Sprague Dawley(SD)系大鼠。

4.胎儿生长迟缓模型大鼠中Muse细胞带来的改善和治疗效果

本发明细胞制剂和医药组合物能够改善和/或治疗包括人在内的哺乳动物中伴随胎儿生长迟缓的脑损伤。根据本发明，可以使用由上述制作的子宫内发育模型生产的胎儿生长迟缓大鼠模型，实验性地研究伴随胎儿生长迟缓的脑损伤大鼠中Muse细胞带来的症状改善等，评价该Muse细胞的效果。作为具体的评价方法，可以使用一般的使用大鼠的评价脑功能的实验体系来进行，例如作为行为学评价，可列举负向趋地试验(negativegeotaxis)、转棒试验(Rota Rod Test)、旷场试验(Open Field Test)、穿梭回避试验(Shuttle Avoidance Test)、新物体识别试验(Novel Object Recognition Test)、步态试验(Cat Walk Test)、莫里斯水迷宫试验(Morris Water Maze Test)等。

“负向趋地试验”是测量被测动物开始远离某种刺激而行动之前的时间而进行评价的方法。例如，可以通过将大鼠头朝下置于倾斜板上，测量调整为向上的运动反应的时间来进行，由此，能够以直至反射完成的时间作为脑功能改善的指标。

“转棒试验”是使用测定被测动物具有的运动功能的协调性和平衡感的装置的试验。具体地，将被测动物放置在具有能够进行一定加速的旋转棒的装置上，从慢慢旋转开始，逐渐加速。调查该状态下被测动物不从旋转棒落下、能够配合旋转而行走的时间。通过反复测试，还能够检测运动学习功能。

“旷场试验”的基础是将被测动物放入新的一定的空间(例如60(W)×60(D)×40(H)cm的箱子)，观察被测动物的探索行为等情绪行为。观察者可以在实际记录被测动物的行为的同时用摄像机摄像，提取数据，评价活动性/情绪性的指标(例如移动距离、静止时间、在中心的停留率)。

“穿梭回避试验”是使用观察被测动物对声音、光的条件反射行为的装置的试验，可以评价学习障碍。这是，在一个房间内响起声音或点亮光后，对地板通入电流，为了躲避该电刺激，被测动物逃往别的房间。通过反复进行该操作，能够评价被测动物有无学习障碍。

“新物体识别试验”是，使被测动物在放有两个物体的空间内自由探索后，将其中一个换为新的物体，测定被测动物对新物体的探索时间的增减，从而能够评价记忆学习、视觉认知记忆。

“步态试验”是，使被测动物在内部有LED照射的透明玻璃板上行走，从下方拍摄由于内部全反射原理而只有接触面发光的足迹，利用该图像，用电脑软件进行分析，能够进行被测动物的肢体运动、走路状态的评价。

“莫里斯水迷宫试验”是，通过使大鼠在一处水面下有平台的水槽中游泳，评价直至到达平台的时间、距离等，能够进行空间认知的评价。

通过以下的实施例，进一步具体地对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的任何限制。

实施例

实施例1：胎儿生长迟缓模型大鼠的制作和Muse细胞的给药

本研究中使用的涉及实验动物的实验方案是被名古屋大学医学部动物实验委员会认可的。SD系妊娠大鼠由日本SLC株式会社(日本静冈县)获得，放入能够自由摄取食物和水的笼子，在12小时的明暗循环下饲养。动物室和实验空间一直维持在23℃。

通过在妊娠第17天的雌性大鼠的子宫动脉的四个位置安装血管收缩器(AC)(内径：0.45mm或0.40mm)，引起胎儿的慢性缺血，制作子宫内发育模型。使用由该雌性生产的大鼠幼鼠作为胎儿生长迟缓模型。需要说明的是，生出的大鼠是胎儿生长迟缓的是通过确认下述情况来确定的：经时性测量这些大鼠出生后的体重，与对照的普通大鼠的体重相比，体重的增加变化差(数据未示出)。

出生后第4天，将Muse细胞(1×10⁴细胞/个体)由左颈静脉给药，以此作为“Muse细胞给药组”。作为对照组，使用将非Muse细胞给药的大鼠作为“非Muse细胞给药组”，并使用将细胞保存液(STEM－CELLBANKER(注册商标))给药的大鼠作为“空白对照组”。此外，使用由进行了sham手术的雌性大鼠生产的大鼠作为“假手术组”。

实施例2：使用AC(0.45mm)情况下的脑功能改善(出生后1个月后)的评价

(1)负向趋地试验

通过负向趋地试验，调查Muse细胞等的移植带来的由伴随胎儿生长迟缓的脑损伤引起的行为障碍的改善。将胎儿生长迟缓模型大鼠(以下有时简单地称为“大鼠”。)头朝下放置在30度的倾斜板上，测定直至大鼠做出反应爬上来的时间(秒)，利用该时间的变化评价各处置的效果。各组的大鼠的例数是，假手术组n＝31、空白对照组n＝18、Muse细胞给药组n＝19和非Muse细胞组n＝18。该试验中，大鼠为8～11天龄，连续4天1天1次实施试验。将各组的负向趋地试验示于图1A。纵轴表示直至大鼠做出反应而爬上来的时间(秒)，整体性地，随着出生后天数的增长，直至爬上来的时间缩短。Muse细胞给药组中，在出生后第8天的试验中，与对照组(空白对照组和非Muse细胞给药组)相比，直至反射完成的时间短，进一步，在出生后第9天，接近假手术组的直至反射完成的时间，观察到更显著的效果。由此表明，Muse细胞在遭受脑损伤的大鼠的行为改善中取得了明显的效果。

此外，将各大鼠中全部4天的测量时间(秒)合计，除以4作为平均测量时间，将进行重绘图的数据示于图1B。根据该结果，与对照组(空白对照组和非Muse细胞给药组)相比，Muse细胞给药组存在直至反射完成的时间短、接近假手术组的直至反射完成的时间的倾向。由此表明，Muse细胞在遭受脑损伤的大鼠的行为改善中取得了明显的效果。

上述负向趋地试验中，空白对照组是仅添加细胞保存液(STEM－CELLBANKER(注册商标))的组，对于9天龄的大鼠，将该细胞保存液用作为Muse细胞组和非Muse细胞组的基液的Hanks’Balanced Salt Solution(HBSS)液替代，进行同样的试验(图7)。图7显示的是，基于下述基准用0～5点计分的结果。

0＝无反应

1＝60秒以内无法达到或中途落下

2＝低于45秒时达到

3＝低于30秒时达到

4＝低于15秒时达到

5＝低于0秒时达到

由图7的结果可以明确，与空白对照组相比，Muse细胞给药组中，与假手术组同样地确认到明显的改善。

(2)转棒试验

作为测定被测动物具有的运动功能的协调性和平衡感的装置，使用一般已知的装置(UGO Basile公司制Rat Rota－Rod 47700)，调查Muse细胞等的移植带来的脑损伤的改善。该试验的评价是，测定大鼠从旋转平台上直至落下的时间，通过重复(计4次)，直至落下的时间延长，由此作为观察到运动学习功能改善的指标。将结果示于图2。连续测定2天，在任一天，与非Muse细胞给药组和与空白对照组相比，Muse细胞给药组均观察到落下时间的延长。该结果提示，Muse细胞能够改善作为脑损伤之一的运动学习障碍功能。

转棒试验中，在对照组中加入假手术组，此外，在上文中，空白对照组是仅添加细胞保存液(STEM－CELLBANKER(注册商标))的组，将其替换为Hanks’Balanced SaltSolution(HBSS)液，进行同样的试验。将各次试验测得的数据示于图8左侧，将各次的测量值合计后的平均值示于图8右侧。从图8右侧的结果来看，Muse细胞组和非Muse细胞组中，直至大鼠(出生后1个月)落下的时间与空白对照组相比明显延长。

上文中使用出生1个月后的大鼠，使用出生5个月后的大鼠同样地对同样的试验进行试验(图10)。将各次试验测得的数据示于图10左侧，将各次的测量值合计后的平均值示于图10右侧。Muse细胞给药组与假手术组同等程度地、直至落下的时间明显比空白对照组延长。此外，与Muse细胞给药组和假手术组相比，非Muse细胞给药组的落下时间明显短。判明在出生后经过超过1个月的长时间的大鼠中，通过Muse细胞的给药，脑损伤明显改善。

实施例3：使用AC(0.45mm)情况下的脑功能改善(出生后4个月后)的评价

(1)旷场试验

将大鼠放入新的具有一定的空间的箱子，观察被测动物的情绪行为(多动性等)。用摄像机(室町机械株式会公司制ANY－maze Video Tracking Software)对被测动物的行为进行摄像，测定一定时间内被测动物的移动距离(distance)(图3A)、不动时间(timeimmobile)(图3B)和自发运动开始次数(mobile episodes)(图3C)。被放置在新的空间的大鼠由于不安而移动的距离变长，由于对该空间的适应而移动距离变小。对大鼠组进行比较，Muse细胞给药组和非Muse细胞给药组中可观察到改善效果，但Muse细胞给药组的效果更显著。这提示通过Muse细胞的给药，能够改善被测动物的情绪行为。

上文中使用出生4个月后的大鼠，进一步使用长期(出生5个月后)的大鼠进行同样的试验(图11)。空白对照组与其他组相比确认到过度活动，频繁向明亮的位置移动。该倾向在第2天和第3天也得到确认。而在其他组(假手术组、Muse细胞给药组和非Muse细胞给药组)中未确认到过度活动。

(2)Y迷宫试验

使用Y迷宫装置对大鼠(出生后1个月)的自发性运动活动和空间工作记忆进行评价。结果，将用3次连续进入不同臂的次数除以进入臂的总次数减1而得的值后的比例(交替反应)数值化，对各组进行作图(图9)。Muse细胞给药组与假手术组同等程度地、与空白对照组相比，大鼠的空间记忆和认知明显改善，但非Muse细胞给药组中未确认到明显的改善。

实施例4：使用AC(0.40mm)情况下的脑功能改善(出生后1个月后)的评价

(1)负向趋地试验

与实施例2同样地进行负向趋地试验。将结果示于图4和5。图4与图1同样地显示利用直至做出反应而爬上来的时间(秒)进行评价的结果，图5显示的是，基于下述基准，以0～5点进行计分的结果。

0＝无反应

1＝60秒以内未达到或中途落下

2＝低于60秒时达到

3＝低于45秒时达到

4＝低于30秒时达到

5＝低于15秒时达到

基于实测的时间进行评价，将AC的内径设为0.45mm时(图1A)的倾向在将AC的内径设为0.40mm时也被观察到(图4A)。与对照组相比，Muse细胞给药组中，与空白对照组相比，可观察到对反射运动障碍的显著改善，观察到这与非Muse细胞给药组相比也是明显的效果。此外，与图1B同样地对于各组设为4天的平均测量时间进行重绘图的情况下，也表现出Muse细胞给药组的明显效果(图4B)。

接下来，将用上述计分对该负向趋地试验进行评价的结果示于图5。与图4同样地，可观察到Muse细胞给药组对于反射运动障碍的显著改善，其他组也观察到同样的倾向。这提示通过Muse细胞的给药，能够改善被测动物的反射运动。

(2)新物体识别试验

进行新物体识别试验。将结果示于图6。对于新物体识别试验，使用一般使用的装置(室町机械株式会公司制ANY－maze Video Tracking Software)来进行。使大鼠在放有两个物体(熟识物体)的空间内自由探索一定时间，然后，将其中一个更换为新物体，测定大鼠对这种不同的新物体的探索时间。作为评价的指标，使用识别率(Recognition Index)(探索指向性)。具体地，利用RI＝(TN×100)/(TN+TF)(式中，TF：对熟识物体的探索时间，TN：对新物体的探索时间)算出。RI的数值越高则表示对该物体的兴趣度越高。将结果示于图6。该试验结果提示，通过Muse细胞的给药，能够改善记忆学习、视觉认知记忆。

(3)转棒试验

与实施例2同样地进行转棒试验。将其结果示于图12。

此外，与上述进行的试验同样地、使用出生后5个月的大鼠进行试验。将其结果示于图13。将各次试验测得的数据示于图12左侧和图13左侧，将各次的测量值合计后的平均值示于图12右侧和图13右侧。出生后1个月的大鼠中，Muse细胞给药组与假手术组同等程度地、与空白对照组相比，直至落下的时间明显延长，但在非Muse细胞给药组中未观察到这样的作用(图12右侧)。此外，在长期(5个月)的大鼠中也观察到了Muse细胞给药组的显著效果，与非Muse细胞给药组相比观察到明显的效果(图13右侧)。

产业可利用性

本发明细胞制剂和医药组合物可以通过对胎儿生长迟缓模型大鼠进行给药而应用于运动质量异常、神经发展异常等伴随胎儿生长迟缓的脑损伤的改善和治疗。

本说明书中引用的全部出版物和专利文献整体通过参照引用至本说明书中。需要说明的是，出于例示的目的，在本说明书中对本发明特定的实施方式进行了说明，但本领域技术人员容易理解，存在不脱离本发明精神和范围地进行各种改变的情况。