流控式测试盒
阅读说明：本技术 流控式测试盒 (Fluidic test cartridge ) 是由 唐纳德·J·托马斯 蔡红 罗伯特·B·凯瑞 于 2018-04-20 设计创作，主要内容包括：一种用于检测核酸或执行其他测定的一次性盒。所述盒可在使用期间插入基站中。所述盒具有用于确保装置在重力下正确操作的多个特征,诸如通气口袋,所述通气口袋用于在所述通气口袋未被密封时使得样品流体能够从一个腔室流动到下一个腔室。所述通气口袋具有用于帮助防止意外再密封的突起。所述盒还可具有用于确保打开的通气口袋之间的自由空气移动的垫圈。具有设置在热稳定材料上的图案化金属电子部件的柔性电路可与所述腔室中的流体直接接触,并且具有与所述通气口袋和所述腔室对准的电阻加热元件。盒通道或腔室中的凹槽可具有用于引导流体流动以增强设置在所述凹槽中的冻干试剂的再水化的结构,诸如脊部或沟槽。所述腔室中的偏流器可降低所述样品流体的流速,并增加有效流体流动路径长度,从而实现对所述盒中流体流动的更准确控制。每个腔室的最高处可具有凸出部,所述凸出部防止横跨所述腔室的顶部的毛细管流体流动,从而减少或防止来自大部分反应溶液体积的新再悬浮试剂的截存。(A disposable cartridge for detecting nucleic acids or performing other assays. The cassette may be inserted into a base station during use. The cartridge has a number of features for ensuring proper operation of the device under gravity, such as a vent pocket for enabling sample fluid to flow from one chamber to the next when the vent pocket is not sealed. The vent pocket has a protrusion to help prevent accidental resealing. The case may also have a gasket for ensuring free air movement between the open vent pockets. A flexible circuit having a patterned metallic electronic component disposed on a thermally stable material may be in direct contact with fluid in the chamber and have a resistive heating element aligned with the vent pocket and the chamber. The grooves in the cartridge channel or chamber may have structures, such as ridges or grooves, for directing fluid flow to enhance rehydration of lyophilized reagents disposed in the grooves. Flow diverters in the chamber can reduce the flow rate of the sample fluid and increase the effective fluid flow path length, thereby enabling more accurate control of fluid flow in the cartridge. The uppermost of each chamber may have a projection that prevents capillary fluid flow across the top of the chamber, thereby reducing or preventing the entrapment of fresh resuspended reagent from the bulk of the reaction solution volume.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月21日提交的名称为“Fluidic Test Cassette”的美国临时专利申请序列号62/488,453的优先权和提交的权益，所述专利申请的说明书和权利要求以引用方式并入本文。
发明背景
发明领域(技术领域)：
本发明的实施方案涉及一种用于检测并标识核酸的一体化装置和相关方法。所述装置可以是完全一次性的或者可包括一次性部分和可重复使用部分。
背景技术：
需注意，以下讨论可涉及许多出版物和参考文献。本文中对此类出版物的讨论是为了更完整的科学原理背景而给出，并且出于专利性确定目的，不应被解释为承认此类出版物是现有技术。
随着公共卫生的影响以及对传染病和新兴疾病、生物威胁因子、遗传病和病原体环境库的认识不断提高，对更具信息性、敏感性和特异性的使用点快速测定的需要增加了对基于聚合酶链反应(PCR)的工具的需求。通过诸如基于PCR扩增的方法进行的基于核酸的分子测试极具敏感性、特异性和信息性。遗憾的是，目前可用的核酸测试不适合现场使用或对于现场使用而言实用性有限，因为它们需要精密且昂贵的仪器、专门的实验室材料和/或依赖于用户干预的多种操作。因此，大多数用于分子测试的样品被运送到集中式实验室，从而导致需要很长的周转时间才能获得所需的信息。
为了解决对快速使用点分子测试的需求，先前的努力集中于采用一次性匣和相对昂贵的相关联仪器的产品设计。使用外部仪器来实现流体移动、扩增温度控制和检测简化了整合分子测试所需的多个过程所固有的许多工程挑战。不幸的是，对精密仪器的依赖给小诊所、地方和州政府以及执法机构带来巨大的经济障碍。另外，依赖少量仪器运行测试可能在需求增加时段期间导致不必要的延误，如在可疑的生物战剂释放或新出现的流行病期间发生的那样。实际上，当爆发需要浪涌容量和增加的吞吐量时，仪器和一次性试剂匣模型存在潜在的显著瓶颈。此外，仪器依赖性使测试装置到部署地点的临时分布变得复杂化，在所述部署地点，不存在排除运输大型的相关联装备或基础设施(例如可靠电源)需求的物流约束。
在现有微流控装置中已将重力描述为流体移动的手段。然而，典型的装置不允许对这种流体移动进行编程或电子控制，或者不允许混合两种以上的流体。另外，一些装置在竖直地取向时利用由下降的惰性或预封装流体产生的压降来形成轻微的真空，并且将反应物抽吸到处理腔室中，这为了确保预封装流体的稳定性而使储存和运输复杂性增加。教导在多个不连续步骤中移动流体的现有装置在腔室之间需要易碎的密封件或阀，这使操作和制造复杂化。这些装置没有教导对每个腔室使用单独的、远距离定位的通气口。
典型的微流控装置使用比标准实验室规程中采用的小的反应体积。PCR或其他核酸扩增反应(诸如环介导扩增(LAMP)、基于核酸的序列扩增(NASBA)和其他等温和热循环方法)通常在测试和研究实验室中使用5至100微升的反应体积进行。这些反应体积容纳足以确保稀释试样中稀少测定靶标的检测的试样体积。减少反应体积的微流控系统相对于传统实验室分子测试中必须采用的那些还减少了可添加到反应的试样体积。较小反应体积的结果是容量减少到容纳足以确保稀释试样中或测定靶标稀少的情况下存在可检测量的靶标的试样体积。
发明内容
本发明是一种用于检测靶核酸的盒，所述盒包括多个腔室；连接到所述腔室的多个通气口袋；以及用于密封所述通气口袋中的一个或多个的热不稳定材料，其中至少一个所述通气口袋包括突起。所述突起优选地包括凹窝或微凸体，并且优选地足以防止熔化的热不稳定材料附着到邻近热不稳定材料设置的热稳定材料，以防止通气口袋在热不稳定材料破裂后的再密封。
本发明还是一种用于检测靶核酸的盒，所述盒包括多个腔室；连接到所述腔室的多个通气口袋；用于密封所述通气口袋中的一个或多个的热不稳定材料；热稳定材料；以及设置在热不稳定材料与热稳定材料之间的垫圈，所述垫圈包括包围所述多个通气口袋的开口。所述垫圈优选地足够厚以提供足够的空气体积来平衡压力并确保打开的通气口袋之间的自由空气移动。所述盒优选地包括柔性电路，所述柔性电路包括设置在热稳定材料上的图案化金属电子部件。所述垫圈优选地包括第二开口，或者在尺寸上受到限制，使得柔性电路将与腔室中的至少一者中的流体直接接触。所述电子部件优选地包括电阻加热元件或导电迹线。所述电阻加热元件优选地与通气口袋和腔室对准。所述盒优选地包括一个或多个环境温度传感器，用于调整腔室中的一者或多者的加热温度、加热时间和/或加热速率。
本发明还是一种用于检测靶核酸的盒，所述盒包括竖直地取向的检测腔室；侧向流动检测条带，所述侧向流动检测条带设置在所述检测腔室中、取向成使得检测条带的样品接收端位于检测条带的底端处；以及空间，所述空间在检测腔室中位于侧向流动检测条带下方用于接收包括扩增的靶核酸的流体，所述空间包括足够的容量，以便以使得流体能够通过毛细管作用向检测条带上流动而不会溢流或以其他方式绕过检测条带的区域的高度容纳整个体积的流体。所述空间优选地包括检测颗粒，诸如染料聚苯乙烯微球、胶乳、胶体金、胶体纤维素、纳米金或半导体纳米晶体。所述检测颗粒优选地包括与扩增的靶核酸或能够结合扩增的靶核酸的配体(诸如生物素、链霉抗生物素蛋白、半抗原或抗体)的序列互补的寡核苷酸。所述检测颗粒优选地已干燥、冻干或者作为载体中检测颗粒的干燥混合物(诸如多糖、去垢剂、蛋白质)存在于内表面的至少一部分上，以促进检测颗粒的再悬浮。流体的毛细管池优选地形成在空间中，其向检测颗粒提供改善的混合和分散，以促进检测颗粒与扩增的靶核酸的共混。所述盒任选地进行体积小于约200μL、优选地小于约60μL的测定。
本发明还是一种用于检测靶核酸的盒，所述盒包括用于容纳至少一种冻干或干燥试剂的一个或多个凹槽，所述凹槽中的至少一个包括用于引导流体以促进所述至少一种干燥或冻干试剂的再水化的一个或多个结构，所述凹槽设置在一个或多个检测腔室或连接到检测腔室的一个或多个通道中。所述结构优选地包括脊部、沟槽、凹窝或其组合。
本发明还是一种用于检测靶核酸的盒，所述盒包括至少一个腔室，所述至少一个腔室包括用于防止竖直地进入所述腔室顶部的流体直接流入所述腔室的出口中。所述特征优选地使流体偏转到腔室的与出口相对的侧。所得的流体流动路径优选地包括水平分量，从而充分地增加流动路径的有效长度并且充分地降低流体的流速以限制离开出口的流体的量。所述特征优选地在腔室内产生流体旋流，从而增加流体内试剂的混合。所述特征的形状优选地为三角形或梯形。所述出口任选地渐缩。位于出口下游的通道优选地包括用于增加通道的有效长度的弯部。所述特征优选地位于腔室底部附近、或腔室底部处、或腔室的中间附近。
本发明还是一种控制用于检测靶核酸的盒中的流体竖直流过腔室的方法，所述方法包括使进入腔室顶部的流体流偏转，从而防止流体直接流入腔室的出口中。所述方法优选地包括降低流体的流速，从而减小流体在流体停止之前沿连接到出口的通道向下流动的距离。所述方法优选地包括将流入腔室中的流体流分成与腔室壁接触且被向上引导的第一流体流和进入出口的第二流体流。所述第一流体流优选地在腔室中旋转，从而增加流体内试剂的混合。第二流体流优选地形成弯月面并且行进通过连接到出口的通道，所述弯月面增大流体下游通道中的闭合空气空间中的压力，直到压力停止通道中的流体流动为止。出口任选地渐缩，从而增大出口的入口处的可压缩空气体积。所述方法任选地包括在连接到出口的通道中提供弯部，从而增加通道的有效路径长度并降低通道中流体的流速。
本发明还是一种用于检测核酸的盒，所述盒包括至少一个反应腔室，其中，当所述盒竖直地取向时，所述反应腔室的顶部包括入口和凸出部，所述凸出部向下延伸到所述反应腔室中以最小化或防止横跨反应腔室的所述顶部的毛细管流体流动。所述凸出部的形状优选地为大致三角形。所述凸出部的第一侧优选地邻近所述入口基本上竖直地延伸。所述凸出部的第二侧优选地以一定角度向上朝向所述反应腔室的所述顶部延伸，所述角度为与竖直方向成小于大约60度、更优选地与竖直方向成小于大约45度、甚至更优选地与竖直方向成小于大约30度，以及任选地竖直地。所述盒优选地包括用于包含至少一种冻干或干燥试剂的凹槽，所述凹槽设置在连接到所述反应腔室的所述入口的通道中。所述凸出部优选地减少或防止来自大部分反应溶液体积的新再悬浮试剂的截存。所述凹槽优选地包括用于引导流体以促进所述至少一种冻干或干燥试剂的再水化的一个或多个结构。所述结构优选地包括脊部、沟槽、凹窝或其组合。可选地或另外地，所述反应腔室包括用于包含至少一种冻干或干燥试剂的凹槽。
本发明的目的、优点和新颖特征以及另外的适用范围将部分地在以下详细描述中结合附图进行阐述，并且在查阅以下内容之后将部分地对于本领域技术人员变得显而易见，或者可通过实践本发明来获悉。本发明的目的和优点可借助于所附权利要求中具体指出的仪器和组合来实现和获得。
附图说明
并入本说明书中并构成本说明书一部分的附图示出本发明的实施方案，并且连同描述一起用来解释本发明的原理。这些图仅用于展示本发明的某些实施方案的目的，并且不应被解释为限制本发明。在图中：
图1A是展示本发明的测试盒的实施方案的图。
图1B是显示出滑动密封件、取样端口、取样杯和膨胀腔室的内部区域的测试盒的一个实施方案的分解图。
图2A是本发明的测试盒的一个实施方案中的流控网络的图示。
图2B至图2C分别是在通气口打开之前和之后的如何可以在气密密封测试盒的背景下采用热触发通气口来与膨胀腔室通气从而实现流体流动控制的示意图。
图2D是一次性测试盒的一个实施方案的图，其示出包括电阻加热元件和温度传感器的印刷电路组件(PCA)的放置。
图2E是包括图2A中描述的特征的注射成型塑料测试盒的照片。
图3A是膨胀腔室的实施方案的操作原理的图示。
图3B是测试盒内气体膨胀之前的基于活塞的膨胀腔室的横截面。
图3C是测试盒内气体膨胀之后的基于活塞的膨胀腔室的横截面。
图4A是形成膨胀腔室的方法的图解，其中采用可膨胀囊状物来提供膨胀的内部体积。
图4B是测试盒内气体膨胀之前的基于囊状物的膨胀腔室的横截面。
图4C是测试盒内气体膨胀之后的基于囊状物的膨胀腔室的横截面。
图5A是形成膨胀腔室的方法的图解，其中采用可膨胀波纹管来提供膨胀的内部体积。
图5B是测试盒内气体膨胀之前的基于波纹管的膨胀腔室的横截面。
图5C是测试盒内气体膨胀之后的基于波纹管的膨胀腔室的横截面。
图6A展示半透性阻挡物、隔膜或材料的使用，其允许气体自由地通过，而诸如细菌、病毒或大分子(诸如如DNA或RNA)的颗粒保留在装置内。
图6B是用于替代膨胀腔室来使内部压力与环境压力相等或降低内部压力的半透性阻挡物的横截面。
图7是测试盒设计的分解图，其中膨胀腔室由一层双轴向取向聚苯乙烯(BOPS)膜之间的间隔物形成。
图8A是包括用于两个流体腔室、检测条带腔室和三个通气口的电阻加热元件以及电接触焊盘的柔性电路的实施方案的图。
图8B是包括用于两个流体腔室、检测条带腔室和三个通气口的电阻加热元件以及用于激励电阻加热元件的电接触焊盘的柔性电路的实施方案。
图8C是测试盒的实施方案的分解图。
图8D是组装好的图8C的测试盒的视图。
图9描绘在条带的样品接收端处具有和不具有毛细管池的装置的侧向流动条带。当存在毛细管池时，在条带上观察到更均匀的检测颗粒分布和更均匀的信号。
图10是展示样品分离的分层方法的图。
图11是用于多重化和样品细分的多通道流控网络的图解，其示出用于每个测试的流体流动路径。另外的流控路径或通道可并入网络中，以进一步增加可在单个一次性测试盒中同时执行的并行测试的数量。
图12是本发明的测试盒的一个实施方案中的流控网络的图示，其中样品在通过取样端口引入到取样杯之后进行分离以使得能够对相同的输入样品进行并行独立测试。来自取样杯的分叉流体路径允许样品溶液分离到测试盒的两个不同的流控通道或路径中，以允许测试同时对分离样品并行地运行。
图13A是组装好的样品制备子系统的图，其示出内部部件布置。
图13B是样品制备子系统的分解图，其示出被构造用于与测试盒整合的核酸纯化设备的部件。
图14是穿过样品制备子系统的横截面，其示出在处理样品的过程中发生的部件移动。
图15是示出具有气密密封部件、注射成型流控子系统、对应的盒背衬和PCA的样品制备子系统的分解图。
图16是具有一体化样品制备子系统的测试盒实施方案的照片。
图17A是示出具有气密密封部件和注射成型流控子系统设计的样品制备子系统的分解图。
图17B是具有被示出为接口连接到PCA的一体化样品制备子系统的测试盒实施方案的图。
图17C是测试盒实施方案的剖视图，其描绘流控路径、接口连接的电子器件和样品制备部件。
图18A是本发明的对接单元的实施方案的图，其被示出为具有处于打开位置的盖和***的测试盒。
图18B是被示出为具有处于闭合位置的盖的对接单元的图。
图19是对接单元的一个实施方案的照片，其被示出为具有处于打开位置的盖和***的测试盒。LCD显示器指示A/B型流感病毒测试盒***的检测。
图20展示本发明的盒密封机构的实施方案。
图21A是盒密封传感器放置在具有***的盒与处于打开位置的密封件的对接单元内的图。
图21B是盒密封传感器放置在具有***的盒与处于打开位置的密封件的对接单元内的剖视图。
图21C是盒密封传感器放置在具有***的盒与处于闭合位置的密封件的对接单元内的图。
图21D是盒密封传感器放置在具有***的盒与处于闭合位置的密封件的对接单元内的剖视图。
图22是盒密封机构的实施方案的图，其中采用驱动齿轮来调节使用旋转阀的密封闭合。
图23A是展示测试盒的实施方案的图，其中盖是包括O形环密封件和充当膨胀腔室的空的空气体积的铰接盖。在此图中，盖处于打开位置。
图23B是示出处于闭合位置的盖的图，其中O形环与取样端口的边沿形成气密密封。
图24A是加热器板和对接单元的形成测试盒接收子组件的测试盒座部件的分解图。
图24B是对接单元的测试盒接收子组件的实施方案的图。
图25是处于接合位置和脱离接合位置的测试盒座和加热器板安装系统的侧视图。
图26是描绘红外温度传感器放置在对接单元的一个实施方案中以监测第一加热流控腔室和第二加热流控腔室的温度的图。
图27A是示出光学传感器放置在对接单元的实施方案内以允许读取靠近测试盒的底部定位的条形码的图。
图27B是图27A的细节。
图28A和图28B分别是双加热板构型的分解图和组装图，其中测试盒夹置在两个加热器板组件之间。
图29A和图29B分别是对接单元实施方案的实体图和透明图，其中枢转门用于接收测试盒。枢转门的闭合使得测试盒的后部与安装在对接单元内的加热器板接触。
图30A和图30B分别是对接单元的内部部件的前剖视图和侧剖视图，所述内部部件包括用于致动样品制备的伺服马达和用于测试结果收集的光学系统。
图31A和图31B是用于对接单元的实施方案的光学子系统的前视图照片和侧视图照片，所述光学子系统并入测试读取器。
图32A和图32B分别是具有处于打开位置和闭合位置的枢转测试盒接收门的对接单元实施方案的照片。
图33示出用于本发明的对接单元的可重复使用子组件。
图34示出在本文所描述的实施例1中获得的测试结果。
图35示出在本文所描述的实施例2中获得的测试结果。
图36示出在本文所描述的实施例3中获得的测试结果。
图37A是包括三个腔室的盒的透视图。
图37B是图37A的盒的分解图。
图38是图37A的盒的透明图，其示出流控特征。
图39示出本发明的腔室的实施方案，其包括三角形凸出流动特征和渐缩出口。
图40示出本发明的腔室的实施方案，其包括三角形凸出流动特征和并行出口。
图41示出本发明的腔室的实施方案，其包括梯形凸出流动特征和并行出口。
图42示出本发明的腔室的实施方案，其包括堆叠的三角形流动特征和并行出口。
图43示出本发明的腔室的实施方案，其包括位于腔室的大致中间的凸出流动特征。
图44示出包括用于引导流体流动的内部特征的试剂凹槽。
图45示出本发明的通气口袋的实施方案，其包括凹窝结构。
图46A示出本发明的盒的流控层的实施方案的图，其包括设置在流体流动路径中的冻干试剂凹槽。图46B是凹槽和反应腔室的放大视图，其示出延伸到腔室中的竖直凸出部。
图47A示出本发明的盒的流控层的实施方案的图，其包括设置在一个或多个反应腔室中的冻干试剂凹槽。图47B是反应腔室中的凹槽的放大视图，其示出延伸到腔室中的竖直凸出部。
图48示出不具有竖直凸出部的反应腔室。
具体实施方式
本发明的一个实施方案是用于检测靶核酸的可密封一次性平台，所述一次性平台优选地包括：样品腔室，所述样品腔室用于接收包括所述靶核酸的样品；扩增腔室，所述扩增腔室通过第一通道连接到样品腔室并且通过第二通道连接到第一通气口袋；标记腔室，所述标记腔室通过第三通道连接到扩增腔室并且通过第四通道连接到第二通气口袋；检测子系统，所述检测子系统通过第五通道连接到标记腔室并且通过第六通道连接到第三通气口袋；多个电阻加热元件；以及一个或多个温度测量装置，其中所述通气口袋各自被位于电阻加热元件中的一个或多个附近的呈合适形式的热不稳定材料(诸如隔膜、膜或塑料片材)密封而不与空气腔室连通。一次性平台任选地包括密封件，所述密封件用于在检测测定发起之前密封平台。一次性平台优选地包括凹槽，所述凹槽沿着腔室之间的通道以将干燥或冻干的试剂并入一次性平台中。这些凹槽可任选地包括位于面向一种或多种试剂的表面中的一个或多个上的结构，所述结构优选地使用毛细效应或表面张力效应来帮助将流体引导到封闭的干燥试剂，以促进干燥试剂的再水化。此类特征可包括脊部(诸如图44的脊部7001)、沟槽、凹窝或其他结构，用于在流体通过凹槽时将流体引导到凹槽的内部空间，或者在流体流动期间以其他方式帮助流体流动到凹槽的内部空间。可选地，凹槽可直接定位在腔室中的一者(或多者)内。
一次性平台任选地还包括样品制备台，所述样品制备台包括与样品腔室的输入端直接流体连通的输出端。扩增腔室的基本上平坦表面的尺寸优选地与和扩增腔室热接触的电阻加热元件的基本上平坦表面的尺寸大致相同。扩增腔室任选地包含扩增溶液，并且位于从样品腔室到扩增腔室的通道中的凹槽任选地包括冻干的扩增试剂混合物，并且在从扩增腔室到标记腔室的通道中优选地存在包括干燥或冻干的检测颗粒的凹槽。扩增腔室和标记腔室优选地能够使用电阻加热元件进行加热。检测子系统优选地包括侧向流动条带，所述侧向流动条带包括检测颗粒。腔室、通道和通气口袋优选地定位在流体组件层上，并且装置的电子元件优选地定位在包括印刷电路板的单独层上，所述单独层结合到流体组件层或放置成通过对接单元与流体组件层接触。检测子系统优选地定位在流体组件层上或者任选地在第二流体组件层上。腔室中的至少一者的体积优选地介于大约1微升与大约150微升之间。一次性平台优选地还包括用于使一次性平台与对接单元对接的连接器，所述连接器优选地将一次性平台维持在竖直或倾斜取向，并且任选地提供电接触件、部件和/或电源。
本发明的一个实施方案是用于检测一个或多个靶核酸的方法，所述方法优选地包括：将包括所述靶核酸的样品分配在一次性平台的样品腔室中；使所述一次性平台竖直地或倾斜地取向；将连接到扩增腔室的第一通气口袋打开到封闭的空气体积，从而使得所述样品能够流动到扩增腔室中；使所述样品与位于样品腔室与扩增腔室之间的通道的凹槽中的先前冻干的扩增试剂混合物发生反应；对扩增腔室中的靶核酸进行扩增；将连接到标记腔室的第二通气口袋打开到封闭的空气体积，从而使得扩增的靶核酸能够流动到标记腔室中；使用位于扩增腔室与标记腔室之间的通道中的凹槽中的检测颗粒来标记扩增的靶核酸；将连接到检测子系统的第三通气口袋打开到封闭的空气体积，从而使得标记的靶核酸能够流动到检测子系统中；以及检测扩增的靶核酸。扩增步骤优选地包括：使用在一次性平台内位于扩增腔室附近的电阻加热元件来扩增靶核酸。方法优选地还包括：被动地冷却扩增腔室。方法优选地还包括：在标记步骤期间使用在一次性平台内位于标记腔室附近的电阻加热元件来加热标记腔室。方法优选地还包括：通过使用不是外部仪器的对接单元来控制一次性平台的操作。
本发明的实施方案包括一次性平台，其整合了进行核酸分子测定的所有必需步骤的与外部仪器无关的装置，并且补充了当前的免疫-侧向流动快速测定，其中新一代核酸测试提供更具信息性和敏感性的分析。本发明的实施方案有利于快速核酸测试在小诊所和严峻或远程环境中更广泛地使用，其中传染病、生物威胁因子、农业和环境测试最可能具有最大的影响。本发明的某些实施方案是完全独立成套的且一次性的，其通过允许在没有外部仪器施加的瓶颈的情况下运行并行测试而在需求增加时实现“浪涌容量”。另外，在其中与廉价的电池供电或AC适配器激励的对接单元联接的低成本一次性匣是优选的那些应用领域中，本发明的采用简单的对接单元的实施方案通过将可重复使用部件放置在可重复使用但廉价的基座中进一步减少测试成本。本文所公开的平台技术提供类似于基于实验室核酸扩增的方法的灵敏度、最少的用户干预和培训要求、通过扩增和检测两者赋予的序列特异性、多重化能力、稳定的试剂、与低成本大规模制造的兼容性、允许在严峻环境中使用的电池或太阳能供电操作、以及允许并入另外的或另选的生物标记而无需重新设计装置的灵活的平台技术。
本发明的实施方案使用于低成本、使用点核酸检测和标识的系统和方法适于在远离通常进行测试的实验室环境的位置进行分析。有利地，核酸扩增反应体积可在传统实验室测试中常用的相同体积范围(例如5μL-150μL)内。因此，在本发明的实施方案中进行的反应直接相当于认可的实验室测定，并且允许容纳通常在传统分子测试中采用的相同试样体积。此外，核酸的扩增优选地在气密密封的测试盒中进行，所述测试盒优选地在扩增发起之前被永久密封。将扩增的核酸保留在密封系统内防止了测试环境和周围区域被扩增产物污染，并且因此降低后续测试将产生假阳性结果的可能性。将密封系统整合到测试盒中使得能够在对接单元中使用对应的密封接合系统以在测定发起时强制形成密封。在本发明的一个实施方案中，采用齿条齿轮机构将整合测试盒的密封机构滑动就位，以确保在扩增之前密封闭合。在发起测试反应之前，放置在对接单元中的传感器询问测试盒以确认已形成密封。
本发明的实施方案可使用注射成型工艺和超声焊接来生产，以实现高吞吐量制造和低成本的一次性部件。在一些实施方案中，在流控部件中提供一个或多个凹槽，用于各自容纳干燥的试剂丸粒。当可以使用超声焊接而丸粒在焊接期间不会被引入系统的任何能量破坏时，凹槽使得能够在最终组装期间使用待存在于流控部件中的冻干或以其他方式干燥的材料。
本发明的实施方案可用于检测样品中一个或多个靶核酸序列的存在。靶序列可以是DNA(诸如染色体DNA或染色体外DNA(例如，线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA等))或RNA(例如，rRNA、mRNA、小RNA或病毒RNA)。类似地，本发明的实施方案可用于标识核酸多态性，包括单核苷酸多态性、缺失、***、倒位和序列重复。另外，本发明的实施方案可用于检测基因调控事件，诸如在转录水平上的基因上调和下调。因此，本发明的实施方案可用于此类应用，如：1)农业、临床、食品、环境和兽医样品中病原体核酸的检测和标识；2)疾病的基因生物标记的检测；以及3)通过检测疾病或代谢状态的相关生物标记进行的疾病存在或代谢状态的诊断，诸如响应于病原体、毒素、其他病原体、环境刺激或代谢状态的存在而发生的基因调控事件(mRNA上调或下调、或诱导在疾病或代谢状态期间产生或抑制的小RNA或其他核酸分子)。
本发明的实施方案包括添加核酸样品后的靶核酸样品制备、扩增和检测的手段，其包括流体控制、温度控制和试剂混合的所有方面。在本发明的一些实施方案中，装置提供使用诸如电池的便携式电源进行核酸测试的手段，并且是完全一次性的。在本发明的其他实施方案中，一次性核酸测试匣结合简单的可重复使用电子部件进行工作，所述电子部件可执行实验室仪器(诸如通常核酸测试所需的外部仪器)的所有功能而无需使用这种实验室仪器或外部仪器。
本发明的实施方案提供核酸扩增和检测装置，其包括但不限于外壳、电路板和流控或微流控部件。在某些实施方案中，电路板可包含各种表面安装部件，诸如电阻器、热敏电阻器、发光二极管(LED)、光电二极管和微控制器。在某些实施方案中，电路板可包括柔性电路板，所述柔性电路板包括诸如聚酰亚胺的热稳定基板。在一些实施方案中，柔性电路可包括沉积到热稳定基板上或结合到热稳定基板的铜或其他导电涂层或层。这些涂层可被蚀刻或以其他方式图案化，以便包括用于生化反应温度控制的电阻加热元件和/或用于容纳此类加热器和/或表面安装部件(诸如电阻器、热敏电阻器、发光二极管(LED)、光电二极管和微控制器)的导电迹线。流控或微流控部件是接收、包含和移动水性样品的装置部分，并且可由各种塑料和各种制造技术制成，包括超声焊接、粘结、熔合或层合、激光切割、水射流切割和/或注射成型。流控部件和电路板部件可逆地或不可逆地保持在一起，并且它们的热耦合可通过导热材料或化合物来增强。外壳优选地部分充当美观且具保护性的护套，从而隐藏微流控层和电路板层的精巧部件，并且还可用于促进样品输入、缓冲剂释放、核酸洗脱、密封形成和装置功能所需的过程的发起。例如，外壳可并入样品输入端口、用于密封形成或接合的机械系统、允许用户激活、缓冲剂释放、样品流动发起、核酸洗脱、以及电子部件与流控部件之间的热形成或其他物理接口形成的按钮或类似的机械特征。
在本发明的一些实施方案中，流控或微流控部件包括处于受控流体连通的一系列腔室，其中腔室任选地受温度控制，从而使其中包含的流体经受可编程的温度方案。在本发明的一些实施方案中，流控或微流控部件包括五个腔室，优选地包括膨胀腔室、样品输入腔室、逆转录腔室、扩增腔室和检测腔室。所述样品输入腔室优选地包括通向膨胀腔室的导管、可添加含核酸样品的样品输入孔口、在制造期间干燥的材料可放置在其中用于与输入样品混合的第一凹槽、通向在制造期间干燥的材料可放置在其中的第二凹槽的出口导管、以及从出口导管通向逆转录腔室的导管。在其他实施方案中，腔室中的两者或更多者的功能被合并到单个腔室中，从而使得能够使用更少的腔室。
第一凹槽和第二凹槽还可包括冻干试剂，其可包括例如合适的缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、寡核苷酸引物以及酶(诸如DNA聚合酶和逆转录酶)。此类冻干试剂优选地在核酸样品进入凹槽中时溶解。在本发明的一些实施方案中，第一凹槽包括存在于输入样品中的可用于裂解生物剂和/或稳定核酸的盐、化学品和缓冲剂。在本发明的一些实施方案中，输入样品在样品输入腔室中进行加热以实现样品中存在的细胞或病毒的裂解。在本发明的一些实施方案中，第二凹槽包括冻干试剂和酶，诸如可用于从RNA合成cDNA的逆转录酶。在本发明的一个实施方案中，第二凹槽与样品输入腔室充分隔离，以允许第二凹槽内的材料在加热期间维持比样品输入腔室的温度低的温度。在本发明的一些实施方案中，逆转录腔室包括导管，所述导管包括第三凹槽，所述第三凹槽包括用于核酸扩增的冻干试剂。样品输入腔室、逆转录腔室、扩增腔室和检测腔室优选地定位成与加热器电路板上的加热器元件对准并且足够接近，以在直接或通过将流控或微流控部件或盒***对接单元中而安装到加热器板时提供热传导。类似地，存在于加热器电路板上的电子部件优选地放置成物理接触或接近流控部件中的通气口袋，以通过打开通气口实现电子控制。加热器电路板物理布局被设计来提供与流控或微流控部件的元件对准，使得加热器电路板的用于裂解、逆转录、扩增、杂交和/或流体流动控制的电阻加热元件定位成与流控部件的和电阻加热元件相互作用的元件形成热界面。
在本发明的实施方案中，流控或微流控部件优选地包括五个腔室，包括样品输入腔室、裂解腔室、逆转录腔室、扩增腔室和检测腔室，以及沿着每个腔室之间的通道定位的用于干燥或冻干的试剂的凹槽。在此实施方案中，RNA到cDNA的逆转录和cDNA的扩增在单独的腔室中发生。在此实施方案中，沿着从样品输入杯通向裂解腔室的导管定位的第一凹槽包括存在于输入样品中的可用于裂解生物剂和/或稳定核酸的盐、化学品(例如，二硫苏糖醇)和缓冲剂(例如，用于稳定、升高或降低pH)。在本发明的实施方案中，输入样品在热裂解腔室中进行加热，使得首先从样品输入杯流过第一凹槽，在第一凹槽中样品已经任选地与包括第一凹槽的物质共混。在本发明的其他实施方案中，通过化学处理来实现裂解，这是由于样品在第一凹槽中与化学品共混、并且样品在这些化学品的存在下在裂解腔室中孵育所致。
在裂解腔室中的处理基本完成后，通过对加热器的电子控制来释放样品溶液，所述加热器非机械地使通气口破裂，以允许样品溶液通过通道流过第二凹槽并进入逆转录腔室中。所述第二凹槽可任选地包括冻干试剂，所述冻干试剂可包括合适的缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、寡核苷酸引物以及酶(诸如DNA聚合酶和实现样品中RNA逆转录为cDNA所需的逆转录酶)。在逆转录反应基本完成后，打开第二通气口以释放样品溶液以流过通道和包括核酸扩增所需的试剂(诸如冻干试剂，其可包括合适的缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、寡核苷酸引物以及酶(诸如DNA聚合酶))的第三凹槽，并且进入扩增腔室中。
在扩增腔室中的核酸扩增基本完成后，打开第三通气口以将样品溶液释放到通向检测腔室的通道。所述通道可任选地但优选地包括第四凹槽，所述第四凹槽包括可用于检测检测腔室中的核酸的干燥或冻干的检测试剂(诸如化学品)和/或检测颗粒缀合物。检测腔室优选地包括毛细管池、用于检测扩增的核酸的试剂和侧向流动检测条带。毛细管池优选地提供具有足够容量的空间，以便以使得流体能够通过毛细管作用向检测条带上流动而不会溢流或以其他方式绕过检测条带的区域的高度容纳检测腔室中的全部体积的流体，所述区域被设计来接收流体以实现正确的向检测条带上的毛细管迁移。在本发明的一些实施方案中，检测试剂是冻干试剂。在本发明的一些实施方案中，检测试剂包括染色的聚苯乙烯微球、胶体金、半导体纳米晶体或纤维素纳米颗粒。样品溶液与检测腔室中的检测试剂共混，并通过毛细管作用向检测条带上流动。与检测腔室对准的微加热器可任选地用于在溶液向检测条带上迁移时控制溶液的温度。
在本发明的一些实施方案中，扩增反应是不对称扩增反应，其中反应中每个引物对中的一个引物以不同于给定对中的另一个引物的浓度存在。不对称反应可用于单链核酸的产生，以便于杂交检测。不对称反应还可用于在线性扩增反应中产生扩增子，从而允许定量或半定量分析样品中的靶水平。
本发明的其他实施方案包括与样品制备装置整合的核酸逆转录、扩增和检测装置。包括样品制备装置的实施方案提供用于连通样品制备子系统输出端口或阀与装置的流控或微流控部件的一个或多个输入端口之间的流体的手段。
本发明的其他实施方案包括使输入样品分离到流控或微流控部件中的两个或更多个流体路径中的装置。使输入样品分离的装置包括分支导管，所述分支导管用于将输入流体输送到具有一定体积的计量腔室，所述计量腔室被设计来横跨多个流体路径划分离体。每个计量腔室包括通向通气口袋的通道导管和通向流体路径中的下一个腔室(例如裂解腔室或逆转录腔室或扩增腔室)的通道导管。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语、注释和其他科学术语或专门名词意图具有本发明所属的领域的技术人员所通常理解的含义。本文描述或提及的许多技术和规程通常是熟知的并且常常可由本领域的技术人员通过使用常规方法加以采用，诸如以下中描述的广泛使用的分子克隆方法：Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第3版(2001)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons,Inc.2001)。适当时，除非另外指出，否则涉及使用商用试剂盒和试剂的规程通常根据制造商限定的协议和/或参数进行。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语‘靶核酸’或‘模板核酸’意指意图检测的单链或双链DNA或RNA片段或序列。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语‘微粒’或‘检测颗粒’意指用于标记扩增反应期间产生的核酸产物的任何化合物，包括对双链核酸特异的荧光染料、荧光修饰的寡核苷酸和寡核苷酸缀合的量子点或固相元素(诸如聚苯乙烯、乳胶、纤维素或顺磁颗粒或微球)。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语‘腔室’意指其中流体驻留一段时间的流控隔室。例如，腔室可以是样品腔室、扩增腔室、标记腔室或检测腔室。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语‘盒’被定义为用于进行测定或其他化学或生物化学分析的一次性或可消耗的盒、外壳、部件或匣。盒可以是单次使用或多次使用的。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语‘口袋’意指充当排放机构的隔室。口袋优选地邻近或上覆于电阻器或打开口袋的其他机构上。例如，与如上描述的流控腔室不同，在盒的流控部件中形成的口袋可具有一个开口面，所述开口面与PCA上的电阻器对准。此开口面优选地由薄隔膜、膜或其他材料覆盖以形成密封腔体，所述密封腔体通过激励下伏的电阻器而容易地破裂。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语‘通道’意指流控组件内的狭窄导管，其通常连接两个或更多个腔室和/或口袋或其组合，包括例如入口通道、出口通道或通气口通道。就入口通道或出口通道而言，流体样品通过通道迁移。就通气口通道而言，导管优选地保持没有流体，并且将流控腔室连接到通气口袋。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语“外部仪器”意指具有以下特性中的一个或多个的可重复使用仪器：在一次性测定或盒上执行除密封盒之外的机械动作，包括但不限于刺穿缓冲剂口袋和/或泵送或以其他方式主动地为流体提供输送力；包括用于控制阀和用于盒或一次性测定中的流体流动控制的其他部件的活动零件；控制流体流动而非通过选择性加热测定；或者需要定期校准。
如贯穿本说明书和权利要求所使用的，术语“对接单元”意指控制测定但不具有以上针对外部仪器列出的特性中的任何一个的可重复使用装置。
本发明的实施方案是用于低成本、使用点核酸测试的装置，其适于在远离通常进行测试的实验室环境的位置进行分析。某些装置包括流控部件或层和电子部件或层，其任选地由保护性外壳包封。在本发明的实施方案中，流控部件由塑料构成，并且包括由狭窄通道连接的一系列腔室和口袋，在操作期间，腔室在狭窄通道中相对于彼此竖直地取向。流控部件上覆有电子部件或以其他方式与电子部件物理接触，优选地通过微控制器进行控制，诸如包含现成的表面安装装置的印刷电路板(SMD)、和/或包括蚀刻的导电材料以形成电阻加热元件并且任选地包含SMD的柔性电路。在所述装置的实施方案中，整个组件是一次性的。在其他实施方案中，流控层和物理结合的电子层是一次性的，而小型廉价的控制单元是可重复使用的。在另一个实施方案中，流控部件是一次性的，而小型控制对接单元或对接单元是可重复使用的。对于所有实施方案，本发明可与诸如名称为“Highly SimplifiedLateral Flow-Based Nucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid FlowControl”的国际公布号WO 2009/137059 A1(以引用方式并入本文)中公开的核酸样品制备装置整合，并且/或者使用所述公布中描述的方法。
本发明的实施方案包括一体化核酸测试装置，其可以用已建立的制造方法廉价地制造。本发明提供分子测试数据，同时保留广泛认可的手持式免疫测定的最终用户视角的简单性，从而克服以下挑战：调控装置内的流体温度、以连续步骤输送小样品体积、试剂添加、试剂混合、检测核酸。在本发明的一些实施方案中，用于收集、解释、报告和/或传输测定结果的子系统并入本发明中。本发明的实施方案独特地适用于利用现成的电子元件，所述电子元件可通过标准组装技术构造，并且不需要或很少需要活动零件。此外，流体层设计使得能够使用容易获得的塑料和制造技术。结果是廉价、一次性且可靠的装置，其能够进行核酸隔离、扩增和检测，而无需专用的实验室基础设施。
现有的核酸测试装置通常使用复杂的加热元件，诸如沉积膜加热器和珀尔帖(Peltier)装置，所述加热元件显著增加了成本并且/或者需要专门的制造方法。在本发明的实施方案中，反应溶液的加热优选地通过使用简单的电阻表面安装装置来实现，所述电阻表面安装装置可用数便士或更少来购买，并且通过普通的制造标准来组装和测试。通过在这些电阻元件和相关联的传感器元件上分层流控腔室，可方便地调控反应溶液的流体温度。在电子工业中广泛使用SMD电阻器和柔性电路确保了本发明能够采用成熟的质量控制方法。在本发明的其他实施方案中，使用由在柔性电路基板的导电层中制造的图案形成的加热元件来实现电阻加热。许多核酸扩增技术，诸如PCR，不仅需要快速加热反应溶液，还需要快速冷却。本发明中的反应腔室优选地对一侧加热，并且横跨相对面的环境温度用于帮助降低流体温度。另外，装置的实施方案的竖直取向与装置水平取向的情况相比允许通过被动对流进行更快速的冷却，因此，在不使用诸如珀尔帖装置的昂贵装置的情况下减少热循环周期。在本发明的一些实施方案中，使用风扇来促进冷却。
流体控制是与低成本核酸测试装置设计相关联的另一个挑战。本领域已知的装置通常采用机电、电动或压电泵送机构来在装置操作期间操纵流体。这些泵送元件既增加装置复杂性又增加成本。类似地，使用复杂的微机械设计或活动零件的阀可能由于诸如活动零件故障或生物污垢的并发症而增加制造成本并降低可靠性。与先前描述的核酸测试装置不同，本发明的实施方案利用微控制器控制下的液体静压力以及毛细管力和表面张力来操纵流体体积。本发明的一些实施方案的竖直取向允许反应溶液在微控制器控制下从一个腔室级联到另一个腔室，以适应所需的测定操纵。流体可通过通道尺寸、液体静压力和表面张力的平衡保持在各个反应腔室中，其中表面张力和液体静压力通过气体置换来禁止流体前进。样品优选地仅在微控制器控制下激活简单的排放机构之后前进到下部腔室。一旦打开，通气口就允许流体从第一腔室移动到第二腔室，其方式为在流体进入时提供用于经置换的空气从第二腔室逸出的路径。流控部件内的每个腔室(或腔室之间的每个通道)优选地通过狭窄的通气口通道连接到密封的通气口袋。通气口袋优选地用薄的热不稳定塑料隔膜或片材对一个面进行密封，所述塑料隔膜或片材通过加热下伏于隔膜或片材、在其附近或与其相邻的小型表面安装电阻器而容易破裂。一旦下部腔室的通气口打开，流体前进就继续进行，即使在低液体静压力下也是如此。
如下文更具体描述的，本发明的一些实施方案中使用的流控或微流控排放机构优选地采用与热不稳定密封件进行热接触和(任选的)物理接触的加热元件，以使得能够通过对较低高度的腔室进行通气而允许来自较高高度的腔室的流体流入下部腔室来电子控制流体移动。在一个实施方案中，电阻器使用广泛使用且成熟的电子器件制造方法安装在印刷电路板上，并且放置成与包括热不稳定材料的通道密封件物理接触。当经激励的表面安装电阻器产生足以使密封件破裂的热量时，这导致腔室的通气，以允许其中流体移动的区域或腔室与其中在排放之前流体所驻留的区域或腔室中的压力平衡。腔室之间的压力平衡允许流体从较高高度的腔室移动到较低高度的腔室。优选地不采用较高高度的腔室与较低高度的腔室之间的直接密封。通道和通气口密封件可远离流体腔室定位，从而有利于在构型上对制造有效的流控装置布局。密封材料可包括能够密封通气口通道并且如所描述的那样因加热而破裂的任何材料，诸如薄塑料片材。用于设备中的流体移动控制的这种方法受益于低材料成本，使用已建立的制造技术的制造适用性，同时提供在诸如微处理器或微控制器的电子控制电路的控制下使流体移动通过一系列腔室的能力。使用通气口、热不稳定材料来密封通气口(但不密封流体腔室或流体微通道本身)和用热量破坏所述密封的电子装置提供了控制流体流过装置的装置，以使得流体能够在预定时间或特定事件(例如，达到一定温度、温度变化或一系列的温度变化、或一个或多个孵育时间的完成或其他事件)完成后移动。在一些实施方案中，当气相水必须与通过所述通道连接的腔室隔离时，可将堵塞物引入腔室之间的通道。堵塞物可以是在通气口打开后与液态水接触时溶解的可溶性材料、或通过将热量引入堵塞物位点可除去的易于熔化的材料(诸如石蜡)。
此外，与密封流体腔室本身相比，通气口方法具有许多优点。通气口袋可位于流控布局上的任何位置，并且简单地通过通气口通道与它们调控的腔室连通。从制造的角度来看，通气口袋可定位成使得仅单个用于所有通气口袋的密封隔膜(其可包括通气口袋歧管)附连到流控部件，优选地通过诸如粘合剂、热层合、超声焊接、激光焊接等成熟的方法。相比之下，直接密封流体腔室需要将密封材料放置在对应于每个腔室位置的不同位置处，这使得制造更加困难。相较于由单个隔膜密封的单个通气口袋歧管，这在制造期间呈现出更具挑战性的情况。另外，如果直接密封腔室，那么熔化的密封材料可保留在腔室之间的通道中，从而阻塞流动。密封材料的粘度在流体柱中可能需要比在小型化重力驱动设备中获得的压力大的压力。
在本发明的实施方案中，试剂混合并不需要比其他系统多的复杂性。优选地通过使用冻干的丸粒或饼块稳定掺入核酸扩增所必需的试剂，诸如缓冲剂、盐、脱氧核糖核苷酸、寡核苷酸引物和酶。密封在流控腔室、流控腔室中的凹槽或通道中的凹槽中的这些冻干的试剂可在与水性溶液接触时容易地溶解。在需要另外混合的情况下，本发明的实施方案的竖直取向为混合溶液的新颖方法提供了机会。通过利用下伏于流控腔室的加热器，当溶液包含热敏组分时，可加热气体，从而将气泡递送到上述腔室中的反应溶液。可选地，在溶液不含热敏组分的情况下，可使用加热器将溶液直接加热至沸点发生的程度。在先前公开的流控和微流控装置中通常不期望出现气泡，因为它们可能积聚在流控腔室和通道中并置换反应溶液或阻碍装置内的流体移动。本文提出的本发明的实施方案的竖直设计允许气泡上升到流体表面，从而导致仅最少且瞬时的流体置换，有效地改善气泡对流控或微流控系统的任何不利影响。通过沸腾进行的混合对这种竖直设计也是方便的，因为在关闭加热元件之后，在过程期间置换的流体由于重力只返回到初始流控腔室。
在本发明的实施方案中，使用比色检测条带来检测扩增的核酸。由于易于使用、可靠性和低成本，侧向流动测定通常用于免疫测定测试。现有技术包含对使用多孔材料作为样品接收区来检测核酸的侧向流动条带的使用的描述，所述样品接收区位于也包含多孔材料的标记区处或其附近并且放置在侧向流动测定装置的一个末端处或其附近。在这些现有发明中，标记部分位于标记区中。使用多孔材料作为样品接收区和标记区导致一些样品溶液以及检测颗粒保留在多孔材料中。尽管在本发明的实施方案中可使用包含具有检测所需的可逆固定部分的多孔材料的标记区，但本发明的实施方案优选地利用检测颗粒、或保存在装置的不同于侧向流动条带的样品接收区的区域中并且包含具有低流体保留特性的无孔材料的部分。这种方法允许在引入到装置的侧向流动部件的样品接收端的多孔部件之前标记含核酸靶标的样品，并且由此消除多孔标记区中样品材料和检测颗粒的保留和/或损失。这种方法进一步使得能够在检测部分的存在下对样品使用各种处理(诸如高温处理)，以实现双链靶或单链靶内的二级结构的变性，而无需考虑温度对多孔样品接收或标记区材料或侧向流动条带材料的影响。此外，使用不与样品接收区侧向流动接触但受流控部件(诸如通气口)控制的标记区允许靶和标记在由流体流动控制系统控制的时间段内保持接触。因此，本发明的实施方案可不同于传统的侧向流动测试条带，其中样品和检测颗粒的相互作用时间和条件由材料的毛细管输送性质决定。通过将检测颗粒并入温度调控腔室中，双链核酸的变性是可能的，从而允许有效的基于杂交的检测。在另选的实施方案中，使用荧光来检测使用LED、光电二极管和滤光器的组合的核酸扩增。这些光学检测系统可用于在扩增和扩增后的终点检测期间进行实时核酸检测和定量。
本发明的实施方案包括提供低成本的使用点系统，其中可选择性地扩增和检测核酸样品。另外的实施方案包括与诸如名称为“Highly Simplified Lateral Flow-BasedNucleic Acid Sample Preparation and Passive Fluid Flow Control”的国际公布号WO2009/137059 A1中描述的核酸样品制备装置整合。所述装置的一个实施方案优选地包括塑料流控部件和印刷电路组件(PCA)和/或柔性电路两者，并且任选地包封在保护有源部件的外壳中。优选地由微控制器协调温度调控、流体和试剂混合。反应盒优选地竖直取向并且在竖直方向上运行，使得重力、流体静压力、毛细管力和表面张力与微控制器触发的通气口结合控制装置内的流体移动。
在本发明的实施方案中，制备的或粗的样品流体进入取样端口并填充或部分地填充取样杯。样品可在取样杯中保留达不同的时间段，在取样杯中干燥或冻干的试剂可与样品混合。可通过以干燥、液体或冻干形式包含在取样杯中来将此类试剂(诸如阳性对照试剂、对照模板或有益于测试的性能的化学试剂)引入到样品溶液。其他处理(诸如受控温度孵育或细菌或病毒分析物的热裂解)可任选地通过与温控电子器件接口连接的下伏的微加热器和温度传感器系统在取样杯中实现。流体网络包括取样端口，通过所述取样端口，样品由用户手动地或通过自动化系统(例如，与对接单元为一体的子系统或样品处理子系统)引入到盒；取样杯，样品保存在所述取样杯中以用于促进样品引入期间的积聚并添加试剂、组分以在样品进一步移动到流控网络的下游部分中之前进行所需的处理(例如，进行细菌细胞或病毒的裂解的热处理)；再循环排放通路，用于使流控通道和/或腔室的空气、气体或溶液压力与盒的膨胀腔室的压力平衡；珠状凹槽，在所述珠状凹槽中，呈干燥/脱水或冻干或半干燥状态的试剂珠(例如，由材料、试剂、化学品、生物剂、蛋白质、酶或其他物质或这些物质的混合物制成的珠或丸粒)可通过样品溶液再水化，或者在添加样品之前将缓冲溶液引入到盒以使其中包含的珠或丸粒再水化，并且因此使其中的材料与样品溶液共混；一组一个或多个通气口，所述一组一个或多个通气口可打开以控制盒内的流控移动；第一腔室，在所述第一腔室中样品可经受温度方案；任选阻挡物，所述任选阻挡物位于连接第一腔室和第二腔室的流控通道内以避免液体和/或气体过早侵入第二腔室中或暂时控制溶液或气体到第二腔室中的移动；第二腔室，在所述第二腔室中样品溶液可任选地在从任选地位于第一腔室与第二腔室之间的任选试剂珠状凹槽添加试剂之后经受另外的温度方案；测试条带凹槽，所述测试条带凹槽形成其中安装测试条带以检测分析物或报告分子或指示分析物存在的其他物质的腔室。在一些实施方案中，盒***对接单元中，所述对接单元执行密封盒、洗脱、检测和数据传输的功能。优选地，一旦盒***对接单元中、样品装载好并且盖已闭合，就不需要用户干预。
参考图1至图2中的盒2500的代表性附图，核酸样品通过取样端口20添加到流控部件5中的取样杯10。滑动式密封件91通过在测定发起时闭合对接单元盖而移动到闭合位置。盖件25将滑动件91保持在适当位置，以便密封膨胀腔室52。核酸样品可来源于线上(即，一体化核酸制备子系统)、单独的核酸制备工艺(诸如许多商用方法中的一种，例如旋转柱)，之后通过移液管将纯化的核酸或未经处理的含核酸样品添加到装置。试剂混合物16已经存在于取样杯中或优选地在取样杯内或邻近取样杯的凹槽13中，所述试剂混合物16可呈液体或干燥形式、包含可用于促进细胞和病毒裂解和/或使释放的核酸稳定的组分。例如，可采用二硫苏糖醇和/或pH缓冲试剂来使核酸稳定并抑制RNA酶。类似地，可使用实现酸或碱介导的裂解的试剂。在一些实施方案中，试剂混合物被冻干以形成冻干试剂。在一些实施方案中，试剂混合物中存在阳性对照，诸如病毒、细菌或核酸。样品到取样杯的引入导致试剂和样品共混，使得试剂对样品起作用。可任选地进行用于进一步将样品与试剂混合或使试剂再悬浮的任选的气泡混合步骤。流体然后任选地在取样杯10中加热以裂解细胞和病毒颗粒。流体随后优选地通过通道40引导到第一腔室30，所述第一腔室30在装置处于竖直取向时位于取样杯下方。试剂凹陷部15优选地沿着入口通道定位，使得流体在进入第一腔室30之前穿过凹陷部以与其中包含的干燥或冻干的试剂共混。在其中第一腔室是逆转录腔室的实施方案中，优选地存在于试剂凹陷部15中的是逆转录反应所必需的所有组分，诸如呈干燥或冻干形式的缓冲试剂、dNTP、寡核苷酸引物和/或酶(例如逆转录酶)。逆转录腔室优选地与加热器元件接触，以提供支持将RNA逆转录成cDNA所必需的温度调控手段。通道35将腔室30连接到试剂凹陷部37。在腔室30中进行cDNA合成后，打开排放口50以允许逆转录反应物通过通道35流入试剂凹陷部37中。当流体穿过凹陷部通过入口39到达第二腔室90时，存在于试剂凹陷部37中的干燥或冻干试剂与流体共混以使得试剂对第二腔室中的样品起作用，所述第二腔室优选地是扩增腔室。优选地存在于试剂凹陷部37中的是扩增反应所必需的所有组分，诸如缓冲剂、盐、dNTP、rNTP、寡核苷酸引物和/或酶。在一些实施方案中，试剂混合物被冻干以形成冻干试剂。为了促进其中产生多个扩增子的多重测试，可通过将多个引物组沉积在一个或多个扩增腔室内或优选地沉积在所述一个或多个扩增腔室的上游的试剂凹陷部内来实现多重扩增。另外，其中多个扩增腔室和检测腔室并入装置中的电路板和流控设计支持可以是单重或多重反应的多个并行扩增反应。这种方法减少或消除了本领域技术人员已知的由在同一反应中使用多对引物的多重扩增引起的复杂化。此外，使用多个扩增反应腔室允许在不同温度方案下同时进行扩增以适应最佳扩增的需求，诸如不同靶和/或引物序列所需的不同熔化或退火温度。
在核酸扩增后，打开通气口袋150以允许扩增反应产物通过通道135流入腔室230中。位于腔室230中的检测条带235使得能够检测由位于检测条带235的区域上或任选地在毛细管池93中的检测颗粒标记的靶核酸。
因为腔室30通过开口51与膨胀腔室52通气而发生从取样杯10到第一腔室30的流体移动。从装置的第一腔室到第二腔室的流体移动优选地通过打开连接到第二腔室的通气口来实现。当流体进入第一腔室30时，密封连接到下游腔室的通气口袋50，并且因此流体将不会通过连接两个腔室的通道35。现在参考图2A，流体从腔室30到腔室90的移动可通过使上覆于通气口袋50上的密封件破裂而允许腔室90内的空气与膨胀腔室52中的空气连通来实现。通气口袋50处的密封件的破裂允许腔室90中的空气通过通气口通道60与膨胀腔室52中的空气连通，膨胀腔室52通过开口51连接到通气口袋54。通气口袋54处的密封件优选地是打开的，或者是预先破裂的，如图2B所示。如图2C所示，通气口袋50的密封件的破裂允许通气口袋50(以及因此腔室90)与通气口袋54(以及因此膨胀腔室52)连通。这种流体移动方法优选地在气密密封的空间内具体体现，以在测试盒内包含生物危险样品和扩增的核酸。为了实现气密密封的盒，以图2B至图2C中的横截面示意性表示的方式对选择性耐热且热不稳定的材料分层。现在参考图2B至图2C，热源70(其优选地包括电阻器)在印刷电路板或PCA75上被放置成与通气口袋50、54对准并且在热不稳定通气口袋密封材料80附近。通气口袋密封件可包括诸如聚烯烃或聚苯乙烯的热不稳定材料。热不稳定材料(诸如聚酰亚胺)72优选地设置在热源70与热不稳定的通气口袋密封材料80之间，以形成气密的阻挡物。在一些实施方案中，通过包括任选的垫圈或垫片56来增加通气口袋之间或周围的密封空间55，任选的垫圈或垫片56包括粘合剂层，所述粘合剂层将热稳定材料72粘合到热不稳定材料80和/或流控部件5，并且在打开通气口中的一个或多个之后维持测试盒在通气口区域中的气密密封，同时优选地还提供气隙，用于使在打开的通气口和/或任选的膨胀腔室之间空气连通。在此实施方案中，热量从热源70通过热稳定材料72和密封空间55传递到热不稳定通气口袋密封材料80，从而使其破裂并打开通气口袋50。微控制器优选地负责将电流发送到热源70。通气口袋50优选地通向封闭空间，使得测试盒内的气体可相对于测试盒外部的环境保持密封。封闭空间可包括测试盒内的空气，任选地包括允许气体膨胀的空的空气腔室，诸如膨胀腔室。如图2C所示，通气口袋50的打开导致通气流体腔室中的气体与膨胀腔室的气体连通，因为热源71先前已使通气口袋54破裂，并且通气口袋54与膨胀腔室气体连通。所得的通气流体腔室中的减压允许流体通过重力从位于上方的腔室流入通气腔室中。通气口袋的其他实施方案可包括除热敏隔膜之外的密封件，并且可利用其他破坏密封件的方法，诸如穿刺、撕裂或溶解。在图2E中示出这种盒的照片。
与通气口袋的开口面相对的面可任选地包括凹窝、突起、微凸体或其他类似结构(诸如图45的凹窝7004)，以便于在通气口密封材料破裂期间形成开口。这种结构还优选地防止密封件破裂后通气口的再密封。这可发生在包括电路板与表面安装部件的实施方案中。在此类实施方案中，表面安装电阻器可拉伸聚酰亚胺膜，从而将其推入垫圈中的开口并抵靠热不稳定材料。一旦密封件破裂，熔化的密封材料就可与聚酰亚胺形成二次密封，从而闭合通气口。在具有包括形成加热元件的金属迹线的柔性电路的实施方案中，加热器可致使聚酰亚胺柔性电路局部变形，通常形成延伸到垫圈中的开口中的突起(通常包括加热器材料)，从而可能由于熔化的密封材料而阻碍通气口打开。凹窝7004可帮助防止这些发生。
密封空间55任选地提供通向其他通气口、通气口袋或腔室(诸如膨胀腔室52)的导管。在通气口打开后，流控部件5保持与外部环境59密封。膨胀腔室52优选地通过缓冲空气/水蒸气体积、或提供足够大的体积以使得来自温度变化的气体膨胀不显著影响系统的压力来适应加热期间的气体膨胀，或者通过活塞(图3)、柔性囊状物(图4)、波纹管(图5)或允许气体而非大分子自由地穿过阻挡物(图6)的疏水阻挡物的移位来适应气体膨胀。在图3中，膨胀腔室利用活塞，所述活塞通过密封流控系统内的压力增加来移位。膨胀腔室用于减少或消除密封系统内的压力积聚。活塞的移位响应于气密密封测试盒内的压力增加而发生，从而降低测试盒内由诸如加热期间的气体膨胀的过程所致的内部压力。在图4中，响应于气密密封测试盒内的压力增加而发生囊状物的偏转。囊状物的移位降低测试盒内由诸如加热期间的气体膨胀的过程所致的内部压力。在图5中，波纹管的拉伸响应于气密密封测试盒内的压力增加而发生。波纹管的拉伸降低测试盒内由诸如加热期间的气体膨胀的过程所致的内部压力。
膨胀腔室可作为空的空气体积并入，诸如图1所展示的测试盒顶部处的膨胀腔室52中所示的所包括的体积。如图7所展示，为了便于制造最小厚度的盒，膨胀腔室还可并入由适当设计的垫圈420在密封到热不稳定材料410和热稳定材料430以形成流控部件400的背衬时形成的气隙440中。最小化测试盒的物理尺寸是期望的，以减少运输成本、减少热质量并提供美观且方便的设计。除了形成用于气体膨胀的空气体积之外，垫圈420在热稳定材料430与热不稳定材料410之间产生空间，以促进空气通过打开的通气口自由移动，同时维持密封系统以防止暴露于环境。垫圈420优选地足够厚以提供足够的气隙来使打开的通气口之间的压力平衡，但也足够薄以基本上不影响加热器与对应的通气口袋之间的界面或通过热稳定材料进行的盒密封。在本发明的包括柔性电路的实施方案中，柔性电路可包括热稳定材料(诸如聚酰亚胺)，在这种情况下，不需要单独的热稳定材料片材430，例如如图8C所示。使用膨胀腔室来降低或平衡密封测试盒内的压力确保压力不平衡不会导致测试盒内的不利或过早的溶液移动，并且压力积聚不会不利地影响所需的流体移动，诸如腔室之间的或通过通道的移动。此压力控制(即，在整个装置中建立指定的压力分布)使得系统能够按设计工作而不管大气压力如何。膨胀腔室因此实现受控的流体移动(这取决于所采用的系统内的稳定压力)，并且还使得能够使用气密密封的测试盒，从而避免使测试盒与大气压通气的缺点，例如扩增子可能释放到大气。此外，通过减少流体下游的压力(诸如通过打开通向膨胀腔室的通气口)来实现流体流动的方法消除了对泵(诸如在流体上游产生正压力的那些泵)或具有活动零件的其他装置的需要。有可能通过以下方式获得类似的优点：使位于流体下游的区域与处于与下游区域基本上相同的压力下的相对较大的贮存器(诸如膨胀腔室)通气，从而使得流体能够在重力下流动(假设装置处于适当的取向)。膨胀腔室的大小优选地足够大以容纳测定期间产生的反应蒸气，而不将系统的压力增加至克服流体流动所必需的毛细管力或重力的程度。
在其中第二腔室为扩增腔室的实施方案中，腔室优选地与加热器元件接触以提供用于支持核酸扩增所必需的温度调控的装置。在本发明的一些实施方案中，扩增腔室可在内表面的至少一部分上包含寡核苷酸。在腔室30的壁95与一个或多个加热元件100之间的界面处(如图2D所展示)，放置导热材料(诸如导热脂或导热化合物)可能是有利的。微控制器优选地基于从PCA 75上的温度传感器110收集的数据，使用简单的开/关或比例-积分-微分(PID)温度控制方法或本领域技术人员已知的其他算法温度控制来通过金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)调制到一个或多个电阻加热元件的电流。
将加热元件和在一些实施方案中对应的一个或多个温度传感器放置在一次性部件上使得能够在温控子系统与它们所接口连接的扩增腔室和检测腔室之间制造高度可再现的热耦合。这种方法实现了通过在制造期间形成导热界面而将流控子系统耦合到电子热控制子系统的高度可靠的装置。所得的电子温控部件与流控子系统之间的优异热接触产生快速的温度平衡，并且因此快速地测定。使用柔性电路提供直接或通过中间垫圈熔合到流控部件背衬的后部的一次性电阻加热元件允许获得优异的热接触、快速温度循环和可再现制造的低成本装置。用于逆转录、扩增和流体流通气口控制的电阻加热元件可通过以下方式直接形成在柔性电路上：蚀刻柔性电路的导电层以形成表现出所需电阻的几何形状。这种方法消除了对另外电子部件的需求，并且简化了制造，同时减少了成本。
在本发明的一个实施方案中，用于电阻加热和通气口打开的柔性电路799在图8中示出。使用柔性加热器作为一次性盒的部件允许盒背衬构造成使得加热的流体腔室中的流体能够与包括柔性加热器电路的材料直接接触。例如，如图8C所示，形成盒后部的热不稳定材料807(优选地包括BOPS)中的窗口806可位于流体腔室上方，以允许流体与柔性电路799直接接触。柔性电路层与要由柔性电路上的加热器进行温度控制的流体之间的直接接触提供了能够进行快速温度变化的低热质量系统。为了能够收集用于温度调控的温度数据，可任选地将温度传感器并入柔性电路中，和/或可采用诸如红外传感器的非接触式温度监测装置。当柔性电路中的电阻加热元件(诸如加热元件800)与通气口袋对准时，可利用柔性电路中的电阻加热元件来使通气口破裂。电焊盘812向加热元件800提供电流。类似地，一个或多个柔性电路可包括用于加热流体腔室的电阻加热元件802和803，以及用于调控检测条带温度的任选电阻加热元件804。
在此实施方案中，柔性电路799还优选地充当类似于上述的热稳定材料72的热稳定密封件以维持气密密封盒。任选地，可在柔性电路799与后外壳或面板805之间放置另外的热稳定层(例如包括聚酰亚胺)。垫片或垫圈808优选地围绕通气口电阻器800放置在热不稳定材料807与柔性电路799之间，以确保通过打开的通气口的自由空气移动，同时维持密封盒。后外壳或面板805优选地包括薄塑料，并且优选地放置在柔性电路的暴露表面上方以在处理期间保护它。后外壳或面板805可包括在柔性电路799上的加热器元件上方的窗口，以便于冷却和温度监测。与对接单元的控制电子器件(在下文进行描述)的电接触可任选地由一组电焊盘810提供，电焊盘810优选地包括边缘连接器或连接器引脚(诸如弹簧加载的引脚)。
测试盒腔室的实施方案优选地包括能够经受反复加热和冷却至在大约30℃至大约110℃范围内的温度的材料。甚至更优选地，腔室包括能够承受反复加热和冷却至在大约30℃至大约110℃范围内的温度的材料，其温度变化速率为每秒大约10℃至大约50℃。腔室优选地能够将其中的溶液维持在适于热介导的裂解和生化反应(诸如逆转录、热循环或等温扩增协议)的温度下，这优选地通过微控制器的编程来控制。在一些核酸扩增应用中，期望提供在升高的温度(例如介于大约37℃与大约110℃之间的温度)下初始孵育达1秒至5分钟的时段，以使靶核酸变性和/或激活热启动聚合酶。随后，将反应溶液在扩增腔室中保持在扩增温度下用于等温扩增、或用于基于热循环的扩增，使反应溶液的温度在至少两个温度之间变化，包括但不限于导致核酸双链体变性的温度和适于通过与靶标杂交进行引物退火和通过聚合酶催化的核酸聚合延伸引物的温度。在热循环方案中的每个必需温度下的孵育持续时间可随靶核酸的序列组成和反应混合物的组成而变化，但优选地在大约0.1秒与大约20秒之间。反复加热和冷却通常进行大约20个循环至大约50个循环。在涉及等温扩增方法的实施方案中，取决于所用的扩增技术，将反应溶液的温度维持在恒定温度(在某些情况下，在升高的温度下初始孵育后)达大约3分钟至大约90分钟。一旦扩增反应完成，通过打开与用于扩增的腔室下方的腔室连通的通气口，将扩增反应溶液输送到下部腔室来完成对扩增的核酸的进一步操纵。在本发明的一些实施方案中，操纵包括扩增的核酸的变性和与缀合至检测颗粒的检测寡核苷酸的杂交。在本发明的一些实施方案中，扩增的核酸与缀合至检测颗粒的检测寡核苷酸杂交，并且与固定在检测条带上的捕获探针杂交。
在一些实施方案中，可在扩增反应之前、期间或之后在扩增腔室中进行另外的生化反应。此类过程可包括但不限于其中RNA转录成cDNA的逆转录、其中多个引物对同时扩增多个靶核酸的多重化以及其中在扩增反应过程期间检测扩增产物的实时扩增。就后者而言，扩增腔室可不含阀或出口通道，并且扩增腔室将优选地包括光学窗口或以其他方式被构造成使得能够在扩增反应过程期间询问扩增子浓度。在一个实时扩增实施方案中，通过激发光源(诸如LED或一个或多个二极管激光器)和检测器(诸如光电二极管)以及适当的光学部件(包括但不限于光学滤光器)监测与靶核酸互补的荧光标记的寡核苷酸或对双链体DNA特异的荧光染料的荧光强度。
检测
检测腔室230的实施方案优选地提供对在扩增腔室中产生的扩增的靶核酸的特异性标记。如图2A所示，检测腔室230优选地包括毛细管池或空间93和检测条带235。包括染料聚苯乙烯微球、胶乳、胶体金、胶体纤维素、纳米金或半导体纳米晶体的检测颗粒优选存在于毛细管池93中。所述检测颗粒可包括与靶分析物互补的寡核苷酸，或者可包括能够结合扩增的靶核酸的配体，诸如生物素、链霉抗生物素蛋白、半抗原或针对标记物(诸如靶扩增核酸上存在的半抗原)的抗体。检测腔室230可包含检测颗粒，所述检测颗粒是干燥的、冻干的或者作为载体中检测颗粒的干燥混合物(例如多糖、去垢剂、蛋白质或本领域技术人员已知的其他化合物)存在于内表面的至少一部分上，以促进检测颗粒的再悬浮。在一些实施方案中，侧向流动检测条带可包含检测颗粒。在其他实施方案中，通向检测腔室的试剂凹槽通道135可包含检测颗粒。检测腔室可能够被加热和/或冷却。
合适的检测颗粒包括但不限于对双链核酸特异的荧光染料、荧光修饰的寡核苷酸、或寡核苷酸缀合的染色微粒或胶体金或胶体纤维素。扩增子的检测涉及‘检测寡核苷酸’或其他‘检测探针’，其与待检测的扩增子是互补的或者能够与其特异性结合。检测寡核苷酸与微粒的缀合可通过使用链霉抗生物素蛋白包被的颗粒和生物素化的寡核苷酸，或者通过碳二亚胺化学发生，由此羧化的颗粒在碳二亚胺的存在下活化并与存在于检测寡核苷酸上的伯胺发生特异性反应。检测寡核苷酸与可检测部分的缀合可在内部或在5'末端或3'末端发生。检测寡核苷酸可直接或更优选地通过间隔物部分诸如乙二醇或多核苷酸附着到微粒。在本发明的一些实施方案中，检测颗粒可结合到由诸如多重扩增的过程所致的多种扩增核酸。在这些实施方案中，每种扩增核酸的特异性检测可通过使用对待检测的每个物种特异的方法在检测条带上进行检测来实现。在这种实施方案中，在扩增期间引入到靶核酸的标签可用于标记存在的所有扩增物种，同时使用标记的核酸与固定在检测条带上的物种特异性捕获探针的后续杂交来确定存在哪种特定种类的扩增DNA。
就双链DNA扩增产物而言，在引入到检测腔室后加热反应溶液可促进检测。使双链DNA熔化或使单链DNA的二级结构变性、并且然后在检测寡核苷酸的存在下进行冷却导致扩增的靶核酸的序列特异性标记。可使用下伏于检测腔室的加热元件来加热流体体积达大约1秒至大约120秒，以使双链DNA熔化或引发单链DNA二级结构的变性。当溶液被允许冷却至室温时，扩增的靶核酸可与检测微粒特异性杂交。然后，通过打开检测腔室的通气口，优选地将反应体积引导到标记腔室下方的检测腔室的区域。
为了有效地进行标记，优选地使溶解的检测颗粒与反应溶液充分混合。在本发明的实施方案中，检测颗粒可定位在通道135出口处的毛细管池93中，以便在溶液进入腔室230时促进与溶液混合。毛细管池93中的检测颗粒可任选地为冻干检测颗粒。毛细管池提供改善的颗粒混合和分散，以促进检测颗粒与检测颗粒所结合的核酸的共混。毛细管池还增加检测条带上颗粒迁移的均匀性，如图9所示。毛细管池对于低体积测定尤其有利，诸如体积小于200μL、或更具体地小于约100μL、或甚至更特别地小于约60μL、或甚至更特别地约40μL。
本发明的检测腔室的实施方案提供对扩增的靶核酸的特异性检测。在本发明的某些实施方案中，检测是通过吸收条带毛细芯吸包含标记的扩增子的溶液来实现的，所述吸收条带包含用线、点、微阵列或其他视觉上可辨别的元素图案化、包含能够直接或间接特异性结合到标记的扩增子的结合部分的多孔材料(诸如纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙或聚四氟乙烯)。在一些实施方案中，装置的吸收条带部件包括多达三个物理接触的多孔基板：表面活性剂垫，所述表面活性剂垫包含两亲性试剂以增强芯吸；检测区，所述检测区包含能够选择性结合标记的扩增子的至少一个结合部分所固定到的多孔材料(诸如纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙或聚四氟乙烯)；和/或吸收垫，所述吸收垫用于提供另外的吸收能力。尽管检测颗粒可任选地并入检测腔室中的侧向流动多孔材料内，但是与先前描述的侧向流动检测装置不同，检测颗粒优选地保持在毛细管池的上游，在毛细管池中可在将所得的标记的核酸引入到装置的多孔部件之前或同时进行扩增子与检测颗粒之间的结合复合物的基本上增强的形成。
‘捕获寡核苷酸’或‘捕获探针’优选地通过本领域技术人员已知的各种手段中的任一种(诸如UV照射)固定到装置的检测条带元件上。捕获探针被设计来在包含标记的核酸芯的溶液通过捕获区而导致捕获探针固定位点处的标记物浓度增加，从而产生指示一个或多个标记的靶核酸扩增子存在的可检测信号时捕获标记的核酸。单个检测条带可用一个或多个捕获探针图案化，以实现多个扩增子的多重检测、扩增子序列的确定、通过扩展检测信号的线性进行的扩增子定量、以及测定质量控制(阳性和阴性对照)。
流控部件
流控部件的实施方案优选地包括塑料，诸如丙烯酸、聚碳酸酯、PETG、聚苯乙烯、聚酯、聚丙烯和/或其他类似材料。这些材料易于获得并且能够通过标准方法制造。流控部件包括腔室和通道两者。流控腔室包括壁、两个面，并且连接到一个或多个通道(诸如入口、出口、凹槽或通气口)。通道可连接两个流控腔室或一个流控腔室和一个凹槽，并且包括壁和两个面。流控腔室设计优选地使表面积与体积比最大化以促进加热和冷却。腔室的内部体积优选地介于大约1μL与大约200μL之间。与溶液接触的腔室面的区域优选地对应于加热元件所接口连接到的区域，以确保加热期间均匀的流体温度。流控腔室的形状可选择成与加热元件配合并为溶液进出提供有利的几何形状。在一些实施方案中，腔室的体积可大于流体体积，以便为在装置操作过程中出现的气泡提供空间。流控腔室可具有通向通气口通道的扩大的延伸部，以确保流体不会通过毛细管作用侵入通道或以其他方式堵塞排放机构。
在一些实施方案中，可能期望在溶液释放之前减少或消除液相或气相水到腔室中的侵入。一些实施方案的过程中使用的升高的温度产生蒸气(例如气相水)，其可导致水分过早侵入通道、腔室或凹槽中。可能需要减少液相或气相侵入以保持例如存在于腔室或凹槽中的干燥试剂或冻干试剂的干燥状态。在一些实施方案中，可用可通过诸如热量、水分和/或压力的外力移除的材料暂时完全地或部分地堵塞通道。适于暂时堵塞通道的材料包括但不限于胶乳、纤维素、聚苯乙烯、热胶、石蜡、蜡和油。
在一些实施方案中，测试盒包括优选注射成型的流控部件，包括取样杯、腔室、通道、通气口袋和导能器。注射成型的测试盒流控部件优选地由适于超声焊接到类似组合物的背衬塑料的塑料构成。在本发明的一个实施方案中，测试盒流控部件包括超声焊接到背衬材料的单个注射成型件。导能器是流控部件的任选特征，其将超声能量仅引导到热不稳定层的意图结合到流控部件的那些区域。注射成型的流控部件可任选地容纳在外壳中。图7展示盒，其包括优选的注射成型流控部件400(优选地包括聚合物，诸如高抗冲聚苯乙烯(HIPS)、聚乙烯、聚丙烯或NAS 30、苯乙烯丙烯酸共聚物)；热不稳定材料410(其包括例如BOPS，所述BOPS具有约239℃的相对低的熔化温度和约100℃的玻璃化转变温度，这足以承受变性期间的升高的温度，或聚碳酸酯，所述聚碳酸酯具有265℃的熔化温度和150℃的玻璃化转变温度)；粘合间隔物420(其包括例如优选不并入载体的有机硅转移粘合剂、具有聚酯载体的丙烯酸系粘合剂、或可承受装置的升高温度的任何粘合剂)；以及耐热层430。热不稳定材料410通过热量进行破裂，热量优选地通过上覆的耐热层430(其包括例如聚酰亚胺或具有高耐热性的另一种聚合物)传输。在盒的通气口特征上方的热不稳定材料的熔化打开通向膨胀腔室的通气口和通气口通道，从而允许盒内的压力平衡。上覆的耐热层430优选地保持完整，从而使得盒在通气口打开后能够维持气密密封。
在一些实施方案中，粘合间隔物包括空区域440，其可充当膨胀腔室以在加热期间缓冲气体膨胀以降低密封盒的内部压力。热不稳定层410通过结合方法或工艺(诸如超声焊接或使用粘合剂)结合到流控部件400。然后将所得部分结合到间隔物和耐热层。在一些实施方案中，耐热层以使得它不存在于加热腔室上方的方式构造。在其他实施方案中，耐热层存在于加热器腔室上方。在又一些实施方案中，粘合间隔物和耐热层仅存在于与流控部件的通气口袋特征对准的区域上方。在此实施方案中，耐热层可任选地放置在与加热腔室对准的区域中的热不稳定材料正上方。
在本发明的一些实施方案中，流控腔室和通道壁的厚度在大约0.025mm至大约1mm的范围内，并且优选地在大约0.1mm至大约0.5mm的范围内。此厚度优选地既满足流控部件的结构完整性的要求，又支持在高温和相关压力下闭合腔室的密封。通道壁、特别地通气口通道壁的厚度优选地小于腔室的厚度，并且在大约0.025mm至大约0.25mm的范围内。入口通道和出口通道的宽度优选地选择成增强毛细管作用。浅的通气口通道赋予流控部件改善的刚性，而不会对排放产生不利影响。形成流控部件的面的塑料优选地比形成壁的塑料薄，以便使热传递最大化。任选的热断开切穿流控部件的一些部件，并且围绕扩增腔室和检测腔室，从而有助于温控腔室的热隔离。
在本发明的一些实施方案中，在将流控部件400结合到热不稳定的背衬材料410之前，可并入测试盒的另外部件，诸如冻干试剂16、检测条带组件230和检测颗粒。在一些实施方案中，所述部件可通过施加压力来层合以确保良好的粘合性。在一些实施方案中，部件可通过诸如压敏粘合剂和超声焊接的方法的组合来结合。必须避免已知或发现对核酸扩增反应的性能产生不利影响的粘合剂。丙烯酸基粘合剂或硅基粘合剂已成功用于本发明中。一种优选的粘合剂膜是Advanced Adhesives Research提供的SI7876。如果被发现与使用的缓冲剂、塑料和反应化学品在化学上相容，同时在装置操作期间遇到的温度内提供稳固的密封，那么可以使用其他粘合剂。
参考图2和图7，通气口袋优选地在其结构方面与其他腔室不同。在构造如上所述的流控部件之后，通气口袋在流控部件的侧上具有开口面，所述开口面将直接或在一些实施方案中通过中间气隙420或通气口袋54和耐热材料430间接地与PCA 75相接。为了形成通气口袋，结合另外的塑料部件来密封腔室，优选地包括与PCA的通气口电阻器70相邻的薄型热不稳定隔膜410。膜410包括适于超声焊接到注射成型的流控部件的材料(诸如聚苯乙烯)，但也可使用其他类似的材料。这种膜非常适合于密封通气口袋并允许容易地穿孔，并且因此在电流通过通气口电阻器产生快速温度升高时与较低压力腔室通气。优选地，膜在加热时足够稳定，使得材料可承受测试盒的其他操作(诸如热裂解、逆转录和核酸扩增)中使用的温度。使用在用于变性、标记、逆转录、核酸扩增和检测的温度范围内具有稳定性但具有通过电阻器70容易获得的熔化温度的材料允许单个材料用于注射成型的流控部件400的背衬，以充当腔室的面和通气口袋的面。在一些实施方案中，温控腔室的区域中的另外温度稳定性可通过诸如聚酰亚胺的耐热材料的上覆膜来实现。在本发明的其他实施方案中，热不稳定膜中的窗口与温控腔室对准，以允许腔室中的流体与熔合到测试盒后部的柔性电路的基板之间的直接接触。
流控部件的另外部件
如上所述，在最终结合之前优选地将若干另外的部件并入本发明的流控部件内。可在装置组装之前将包括缓冲剂、盐、dNTP、NTP、寡核苷酸引物和酶(诸如DNA聚合酶和逆转录酶)的试剂冻干或冷冻干燥成丸粒、球体或饼块。试剂冻干在本领域中是众所周知的，并且涉及在施加的真空下通过升华使冷冻试剂等分试样脱水。通过在冷冻之前向试剂添加冻干保护剂(诸如糖(二糖和多糖)和多元醇)的特定制剂，可保存酶的活性并且可增大再水化的速率。冻干试剂丸粒、球体或饼块通过标准方法制造，并且一旦形成，就相当耐用并且可在层合最终面之前容易地放入流控部件的特定腔室中。更优选地，将凹槽并入流控网络中以允许在将流控部件结合到背衬材料之前将冻干试剂的丸粒、球体或饼块放置在流控部件中。通过选择流控网络几何形状和凹槽位置和顺序，样品可在期望的时间与期望的冻干试剂发生反应以使性能最佳。例如，通过将冻干(或干燥)逆转录(RT)和扩增试剂球体沉积到RT反应腔室和扩增腔室的流体路径中的两个单独的凹槽中，使得能够实现最佳的逆转录反应而不受扩增酶的干扰。此外，为了使RT酶对随后的扩增反应的干扰最小化，可在引入扩增试剂之前对RT反应中存在的RT反应后的RT酶进行热灭活以使它们对扩增的干扰最小化。任选地，可将其他盐、表面活性剂和其他增强型化学品添加到不同的凹槽来调制测定的性能。另外，这些凹槽在液体通过凹槽时促进冻干试剂与液体的共混，并且还用于在超声焊接期间将冻干材料与超声能量隔离，以及在溶解之前在测试的加热步骤期间将冻干试剂与极端温度隔离。此外，凹槽确保冻干丸粒在制造期间不被压缩或压碎，从而使得它们保持多孔以使再水化时间最小化。
在本发明的一些实施方案中，检测微粒是流控部件的另一另外部件。在一些实施方案中，这些微粒可以是冻干的，如上针对反应试剂所述。在其他实施方案中，可直接将液体缓冲剂中的微粒施加到流控腔室的内面并在测试盒的最终组装之前进行干燥。包含微粒的液体缓冲剂优选地还包含有助于再水化的糖或多元醇。在干燥之前将水性缓冲剂中的微粒直接并入流控部件中可简化制造并减少制造的最终成本，并且冻干颗粒与反应溶液的完全共混以及核酸的双链核酸或双链区域变性成单链核酸可通过加热或核态沸腾来促进。在一些实施方案中，冻干的检测颗粒放置在流控网络中的凹槽中。在其他实施方案中，冻干或干燥的检测颗粒放置在检测条带正下方的空间93中。在其他实施方案中，将检测颗粒干燥或冻干成与检测条带毛细管连通的吸水基质，或者直接在检测条带上进行干燥或冻干。毛细管连通可以是所述吸水基质与检测条带的直接物理接触，或者是间接的，其中毛细管连通是在由通道或腔室区域构成的中间距离上，通过所述通道或腔室区域实现毛细管输送以将流体从载有检测颗粒的吸水基质输送到检测条带。
在本发明的一些实施方案中，还将侧向流动检测条带组件并入流控部件中。所述检测条带优选地包括隔膜组件，其包括至少一个多孔部件，并且任选地可包括吸收垫、检测隔膜、表面活性剂垫和背衬膜。检测隔膜优选地由硝化纤维素、纤维素、聚醚砜、聚偏二氟乙烯、尼龙、电荷改性尼龙或聚四氟乙烯制成，并且可用塑料膜加背衬。如上所述，捕获探针可以线、点、微阵列或可由肉眼或诸如成像系统的自动化检测系统可视的任何图案沉积并且不可逆地固定在检测隔膜上。在捕获探针沉积后，可通过UV照射检测隔膜永久地固定沉积的寡核苷酸。表面活性剂垫可包括多孔基板，优选地具有最小的核酸结合和流体保留性质，其允许核酸产物和检测微粒的无阻碍迁移。表面活性剂垫可包含诸如玻璃纤维、纤维素或聚酯的材料。在本发明的实施方案中，在表面活性剂垫上对包含至少一种两亲性试剂的制剂进行干燥以允许样品均匀迁移通过检测隔膜。吸收垫可包含吸收材料，并且有助于诱导样品芯吸通过检测隔膜组件。使用粘合剂背衬膜(诸如双面粘合剂膜)作为基底，通过首先放置检测隔膜，之后进行使任选的吸收垫和/或表面活性剂垫以介于大约1mm与大约2mm之间的重叠与检测隔膜物理接触来组装检测隔膜部件。在本发明的一些实施方案中，检测隔膜可与表面活性剂垫间接地毛细管连通，其中在表面活性剂垫与检测垫之间存在物理分离，中间空间包括其中流体可通过毛细管作用遍历空间的毛细管空间。在一些实施方案中，表面活性剂垫或表面活性剂垫的区域可包含检测颗粒、干燥的检测颗粒或冻干的检测颗粒。
三腔室盒
在本发明的一些实施方案中，可并入另外的反应腔室和/或另外的凹槽以用于干燥或冻干的试剂。在一些实施方案中，这种设计有利于期望在逆转录和扩增之前提供初始单独裂解反应的测试。如图37A、图37B和图38所示，盒5000包括密封膨胀腔室5021的盖件5020、优选地设置成与流控部件5023紧密接触的柔性加热器电路5022、以及对用户隐藏电路的后盖5024。包含核酸的样品通过取样端口5001引入到取样杯5002中。样品自由地流入凹槽5003中，其在沿通道5005向下流入第一反应腔室5006中之前在所述凹槽中重构第一冻干珠5004(其优选地包含裂解试剂)。这种自由流动通过连接到取样杯5002的顶部的通气口通道5007得以促进。通气口通道5007可另外地通过孔洞5008连接到膨胀腔室5021。反应腔室5006下方的密封空气空间由于流体流动而略微加压，并使流动停止在第一反应腔室5006的正下方。然后优选地将第一反应腔室5006加热至一定温度以促进与裂解试剂的适当反应，从而裂解样品中的生物颗粒和/或细胞，暴露其中存在的任何核酸。
连接到第二反应腔室5011顶部的通气口阀5009的打开然后促进样品流入第二凹槽中，在所述第二凹槽中重构第二冻干珠5010(其优选地包含用于逆转录的试剂)。接着流体进入第二反应腔室5011，在所述第二反应腔室中流体的流动由于流动下方的闭合空气体积中增加的空气压力而停止。然后优选地随后将第二反应腔室5011加热至合适的温度以促进逆转录过程。
连接到第三反应腔室5013顶部的下一个通气口阀5009的打开使样品从第二反应腔室5011流过第三凹槽，在所述第三凹槽中重构冻干珠5012(其优选地包含冻干的PCR扩增试剂)。然后样品流入第三反应腔室5013中，在所述第三反应腔室中样品经历热循环以扩增样品中存在的靶分析物。
随后，连接到侧向流动条带5014的远端的最终通气口阀5009的打开使得现在包含扩增的分析物的样品能够流到侧向流动条带5014，用于检测如先前所描述的分析物。
流动控制特征
流控部件的设计可任选地在反应腔室内或其出口处包括流动控制特征。在流动进入出口之前，这些特征使进入腔室的流偏转到腔室的与出口相对的侧。结果，流以较低的速度进入出口通道，从而减少流体在停止之前沿通道向下流动的距离。此外，流动路径的水平分量增加通道的长度而不增加腔室之间的竖直间距，从而增加流动路径的有效长度，因此足以基于降低的流速来使流停止在期望位置处。这使得盒的腔室之间的竖直间距更紧密，因为需要更少的竖直通道。另外，对横跨反应腔室的流的重定向在腔室内的流中产生旋流作用，从而改善试剂与样品流体的混合。流动控制特征可包括任何形状。
在图39所示的实施方案中，流体从入口通道4002进入反应腔室4003并流动到反应腔室的底部，在所述反应腔室的底部处通过三角形流动控制特征4001将流体偏转到反应腔室4003的与入口通道4002的开口相对的侧。当流继续进行到相对的拐角4004时，流分离，其中一些进入出口4005，而其余部分接触壁并被向上引导，从而产生旋流效应，这改善了混合。进入出口中的流优选地形成弯月面并且通过出口通道4006朝向下一个反应腔室或冻干珠凹槽行进。由于出口通道4006在反应腔室4003下方被密封，因此当流体沿着出口通道4006行进时，空气压力在流下方的通道中增大直到与流控压力头达到平衡为止，从而停止流动。在此实施方案中，出口4005从反应腔室4003到出口通道4006渐缩，以便有效地形成弯月面，所述弯月面随后可增大流下游的闭合空气空间中的压力。这种通向出口通道的较大开口优选地提供增大的可压缩空气体积，使得可在较宽开口处可靠地形成弯月面。
在图40所示的实施方案中，流体从入口通道4102进入反应腔室4103并流动到反应腔室的底部，在所述反应腔室的底部处通过三角形流动控制特征4101将流体偏转到反应腔室4103的与入口通道4102的开口相对的侧。当流继续进行到相对的拐角4104时，流分离，其中一些进入出口4105，而其余部分接触壁并被向上引导，从而产生旋流效应，这改善了混合。进入出口中的流优选地形成弯月面并且通过出口通道4106朝向下一个反应腔室或冻干珠凹槽行进。由于出口通道4106在反应腔室4103下方被密封，因此当流体沿着出口通道4106行进时，空气压力在流下方的通道中增大直到与流控压力头达到平衡为止，从而停止流动。在此实施方案中，出口4105和出口通道4106具有均匀的宽度。在此实施方案中，由于较窄的通道，在反应腔室处形成弯月面可能稍微更可靠。弯月面随后增大流下游的闭合空气空间中的压力。
在图41所示的实施方案中，流体从入口通道4202进入反应腔室4103并流动到反应腔室的底部，在所述反应腔室的底部处通过梯形流动控制特征4201将流体偏转到反应腔室4203的与入口通道4202的开口相对的侧。当流继续进行到相对的拐角4204时，流分离，其中一些进入出口4205，而其余部分接触壁并被向上引导，从而产生旋流效应，这改善了混合。在此实施方案中，出口4205基本上竖直地取向。进入出口中的流优选地形成弯月面并且通过出口通道4106朝向下一个反应腔室或冻干珠凹槽行进。由于出口通道4206在反应腔室4203下方被密封，因此当流体沿着出口通道4206行进时，空气压力在流下方的通道中增大直到与流控压力头达到平衡为止，从而停止流动。在此实施方案中，出口4205和出口通道4206具有均匀的宽度。在此实施方案中，由于较窄的通道，在反应腔室处形成弯月面可能稍微更可靠。弯月面随后增大流下游的闭合空气空间中的压力。
在图42所示的实施方案中，流体从入口通道4304进入反应腔室4305并流动到反应腔室的底部，在所述反应腔室的底部处通过三角形流动控制特征4303将流体偏转到反应腔室4305的与入口通道4304的开口相对的侧。当流继续进行到相对的拐角4306时，流分离，其中一些进入出口4307，而其余部分接触壁并被向上引导，从而产生旋流效应，这改善了混合。进入出口中的流优选地形成弯月面并且通过出口通道4306朝向下一个反应腔室或冻干珠凹槽行进。在此实施方案中，出口通道4306行进通过堆叠的串联流动控制特征4303、4302和4301，所述控制特征为流体流动提供曲折的路径，从而在小的竖直空间中提供增加的出口通道长度。
在图43所示的实施方案中，流体从入口通道4402进入反应腔室4403，并通过优选地沿反应腔室4403的长度的大约一半设置在反应腔室底部上方的流动控制特征4401重新引导到反应腔室4403的与通向入口通道4402的开口相对的侧。与先前的实施方案相比，流量控制特征4401不形成反应腔室4403的出口。流动控制特征4401使流远离出口通道4405偏转到相对的拐角4404中，从而在离开腔室之前降低流速。类似于先前的实施方案，流控式重定向促进湍流和试剂混合。
为了促进反应溶液与冻干试剂的有效共混，包括流体流动路径的测试盒部分的实施方案可包括并入腔室之间的流体流动路径中的专用试剂凹槽4600，如图46A和图46B所示。在另选的实施方案中，试剂凹槽4700设置在反应腔室本身内，如图47A和图47B所示。冻干的试剂丸粒优选地在制造期间设置在试剂凹槽中。在试剂凹槽位于流体腔室内的情况下，流体腔室中反应溶液的存在导致在制造期间放置在凹槽内的一种或多种冻干试剂的再悬浮。当试剂再悬浮需要比在溶液从一个腔室流动到另一个腔室期间流体瞬时通过通道定位的凹槽所提供时间长的再悬浮时间时，将一种或多种冻干试剂放置在流体腔室的凹槽内可能优于将一种或多种试剂放置在流体通路中的试剂凹槽中。通过在流体腔室内包含冻干试剂，延长了反应溶液与试剂的停留时间，增加了冻干材料对流体的暴露，并确保了冻干试剂更完全的再悬浮以及试剂与反应溶液的更完全共混。此外，设置在流体路径中的凹槽中的冻干试剂可能在反应完成之前易于从上面的腔室渗漏(或毛细管滴流)。这可赋予试剂浆料稠度，从而在大部分溶液从上部腔室输送通过凹槽时引起流体流动问题。当凹槽设置在下部腔室本身中时，优选地避免此问题。
在期望将试剂凹槽放置在流体通道内(诸如图48所示的标准实施方案中示出的那样)的应用中，可通过将凸出部(诸如图46B中所示的凸出部4605、或图47B中所示的凸出部4705)并入流体腔室中来实现试剂再悬浮和试剂与反应溶液的共混的改善。腔室内凸出部的一侧上的急剧竖直上升阻止横跨流体腔室的顶部或最高处的毛细管流体流动，从而减少或防止来自大部分反应溶液体积的新再悬浮试剂的截存。
测定的多重化
在本发明的一些实施方案中，可通过采用使得输入流体样品能够分离成穿过装置的两个或更多个并行流控路径的流控设计并行地进行多个独立测定。图10是将例如80uL的流体体积在两个连续步骤中首先分离成两个单独的40uL体积并且随后分离成四个20uL体积的示意图。所展示的方案可用于使得单独的独立操纵(诸如生化反应)能够在分离体积上进行。通过促进多个靶标(诸如多重核酸逆转录和/或扩增反应中的核酸序列)的多重检测，这种构型可用于增加可在单个装置中检测的分析物的数量。类似地，在独立流体路径的末端使用多个检测条带可提供条带的增强的可读性，以用于检测多个靶标或区分核酸分析物中的序列差异或突变。此外，提供用于独立询问多种扩增反应产物的另外检测条带可通过在测试的检测步骤期间降低假交叉反应(例如交叉杂交)的可能性来增强特异性。图11展示在单个测试盒中包括两个流体路径的测试盒。每个流体路径可在时间、反应类型等方面独立控制。现在参考图12，引入到取样杯1000的样品被分成大约相等的体积并流入体积分离腔室1001和1002中，流入其中的流由通气口阀1003和1004调控。分离腔室1001和1002通过被动平衡每个腔室中的样品量来控制每个测试路径中的样品体积。在体积分离之后，通过打开通气口1005和1006来允许溶液流过试剂凹槽1007和1008。诸如冻干试剂的试剂设置在凹槽1007、1008中，并且在样品流过凹槽并进入第一组优选温控腔室1009和1010时与样品共混。由试剂凹槽1007、1008中提供的试剂促进的诸如热裂解、逆转录和/或核酸扩增的反应在第一组加热腔室中的每一个中进行。此类试剂可包括但不限于冻干的阳性对照剂(例如核酸、病毒、细菌细胞等)、冻干的逆转录酶和相关联的辅助试剂(诸如将RNA逆转录成DNA和/或使用冻干的DNA聚合酶或热稳定的冻干的DNA聚合酶进行DNA扩增所需的核苷酸、缓冲剂、DTT、盐等，以及所需的辅助试剂(诸如核苷酸、缓冲剂和盐))。
在第一组腔室中完成诸如逆转录、核酸扩增或伴随的增加逆转录和核酸扩增(例如，单管逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或一步法RT-PCR或一步法RT Oscar)的生化反应后，使用于通气口袋1011和1012的密封件破裂以允许流体从第一组腔室流过第二组试剂凹槽1013和1014、并流入第二组优选温控腔室1015和1016中。诸如冻干试剂的试剂可设置在凹槽1013和1014中，使得试剂在流体从腔室1009和1010流动到腔室1015和1016时与样品溶液共混。试剂(诸如用于核酸扩增的冻干试剂)或干燥或冻干的检测颗粒(诸如探针缀合的染色的聚苯乙烯微球或探针缀合的胶体金)可任选地放置在试剂凹槽1013和/或1014中。在完成反应或其他操纵(诸如在加热腔室中与探针缀合的检测颗粒结合或杂交)后，通过打开通气口阀1019和1020来允许溶液流入检测条带腔室1017和1018中。在一些实施方案中，第三组试剂凹槽可放置在来自腔室1015和1016的流体路径中，使得另外的试剂(诸如包含检测颗粒、盐和/或表面活性剂以及可用于促进杂交或其他检测方式的其他物质的检测试剂)可与流入条带腔室1017和1018中的溶液共混。检测条带腔室1017和1018可被加热，并且优选地包括用于检测分析物(诸如扩增的核酸)的检测条带(诸如侧向流动条带)。检测条带可包括掺杂或图案化有干燥或冻干的检测试剂的一系列吸收材料，所述检测试剂诸如检测颗粒(例如，染色的微球缀合物和/或胶体金缀合物)、用于捕获分析物的捕获探针(诸如用于通过序列特异性杂交捕获核酸分析物的杂交捕获寡核苷酸)、用于捕获适当改性的分析物的配体(诸如生物素或链霉抗生物素蛋白)；以及用于提供足以确保样品溶液体积通过诸如毛细管作用或芯吸的方式完全迁移通过检测条带的吸收能力的吸收材料。
样品制备
在本发明的实施方案中，可能期望将样品制备系统并入盒中。样品制备系统(诸如核酸纯化系统)可包含用于完成样品制备和将纯化的分子(诸如纯化的DNA、RNA或蛋白质)洗脱到测试盒中的包封溶液。图13描绘被设计用于与测试盒整合的核酸样品制备子系统1300。样品制备子系统包括用于容纳子系统的部件的主外壳1302和外壳盖1301。溶液隔室化部件1303包括粗样品贮存器1312，其优选地在上部面上开口但由下部密封件1305在下方密封。溶液隔室化部件1303还优选地包括含有第一洗涤缓冲剂的贮存器1314和含有第二洗涤缓冲剂的贮存器1315，两者优选地通过上部密封件1304和下部密封件1305密封。将核酸结合基质1306放置在由吸收材料1307和1308提供的溶液毛细管流动路径中。表现出核酸结合性质和芯吸性质的玻璃纤维或硅胶是适于用作结合基质1306的材料的实例。多种吸收性材料可包括吸收材料1307和1308，包括聚酯、玻璃纤维、硝化纤维素、聚砜、纤维素、棉或其组合以及其他芯吸材料，条件是它们提供足够的毛细管作用并且与子系统要纯化的分子的结合最小。能够被密封到溶液隔室化部件1303并且与包封溶液化学相容的任何易于破裂或易碎的材料都适于用作密封材料1304和1305。密封材料1305与样品或样品裂解物接触，并且另外地必须与样品或样品裂解物溶液化学相容。合适的密封材料的实例为可热密封的金属膜或塑料膜。密封材料1305在供置换溶液隔室化部件1303使用时破裂，使得密封件1305被存在于外壳1302中的结构1311刺穿。粗样品或与裂解缓冲剂(诸如包含离液剂的缓冲剂)混合的粗样品在用于样品贮存器1312时通过盖1301中的取样端口1309引入。在一些实施方案中，裂解缓冲剂可任选地通过延伸密封件1304以覆盖贮存器1312的上部孔口而包封在贮存器1312中。在此类实施方案中，可能期望包括用于部分移除密封件1304的覆盖贮存器1312的区域的突片或其他装置，以允许将粗样品添加到贮存器1312使得粗样品可与包含在其中的裂解缓冲剂共混或混合。将样品溶液或含有裂解物的样品材料引入到样品添加端口1309并保留在缓冲剂贮存器1303的样品贮存器1312中，直到发起样品制备过程为止。
在发起样品制备时，将溶液隔室化部件1303推到密封刺穿结构1311上，从而导致同时释放在贮存器1312中的样品溶液或裂解物和分别在贮存器1314和1315中的第一洗涤缓冲剂和第二洗涤缓冲剂。部件1303的机械移位可手动实现，或者通过使用存在于可重复使用仪器中的一个或多个致动器来实现，一次性测试盒在使用时放置在所述可重复使用仪器中。优选地通过外壳盖1301的进入端口1310提供对贮存器1303的致动器进入或手动移位机构进入。通过毛细管作用使样品或裂解物溶液以及第一洗涤缓冲剂和第二洗涤缓冲剂移动通过材料1307、1306和1308。贮存器的物理布置和吸收材料1307的几何构型确保粗裂解物、第一洗涤缓冲剂和第二洗涤缓冲剂顺序地流过结合基质1306。通过与芯1308接触放置的吸收垫1313提供另外的吸收能力以确保所有溶液体积通过系统的持续毛细管输送。在通过吸收材料的溶液输送完成时，废溶液停留在吸收垫1313中。在耗尽所有溶液通过系统的毛细管输送之后，纯化的核酸与结合基质1306结合，核酸可从结合基质1306洗脱到一体化测试盒的取样杯1402中，如图15所示。
样品制备期间发生的样品制备子系统部件的移动在图14中示出，图14描绘在样品处理之前和之后的样品制备子系统实施方案的横截面。在洗脱之前，通过相关联的可重复使用测试仪器中的致动器的作用将结合基质1306移出毛细管流动路径并通过密封部件1316。密封部件1316与洗脱缓冲剂导管1318的一部分形成密封，以允许洗脱缓冲剂通过结合基质1306注入并进入取样杯1402中，而不会使溶液损失到样品制备子系统的毛细管流动路径。导管1318附接到由洗脱缓冲剂贮存器1317和柱塞1319构成的洗脱缓冲剂注射器部件或是其一部分。柱塞1319可任选地包括O形环，以促进贮存器1317内洗脱缓冲剂的密封。在纯化的核酸的洗脱期间，致动器移动洗脱贮存器部件1317，使得附接的导管1318与密封部件1316形成密封并将结合基质1306移位到腔室1321中。通过致动器进入端口1320提供用于压下洗脱贮存器1317的机械通路。在将结合基质1306移出样品制备子系统的主毛细管溶液流动路径后，结合基质1306驻留在洗脱腔室1321中。纯化的核酸到取样杯1402中的洗脱是通过由致动器通过致动器端口1322进行作用以迫使来自洗脱贮存器1317的洗脱缓冲剂使柱塞1319以类似注射器的动作移动通过贮存器1317来完成的。洗脱缓冲剂通过导管1318继续行进穿过结合基质1306，从而导致将含有洗脱的纯化核酸的洗脱缓冲剂注入取样杯1402中。
现在参考图15，样品制备子系统1300优选地通过广泛使用的制造方法(诸如超声焊接)结合到盒1500的流控部件1403，以形成一体化单次使用的样品-结果测试盒。在一些实施方案中，期望在引入含有纯化核酸的洗脱液后气密地密封测试盒流控器件，以便降低扩增的核酸从盒逸出的可能性。滑动密封件1404可任选地但优选地放置在样品制备子系统与测试盒流控外壳1403之间，以在取样杯1402的入口处密封盒。滑动密封件1404通过致动器的作用移动到密封位置，以形成包括o形环1405的气密密封。在引入干燥的试剂和测试条带后，将盒背衬1406结合到流控外壳。如上针对其他测试盒实施方案的背衬所述，背衬1406包括用于排放功能、气密密封维持、热界面、一个或多个膨胀腔室的材料，并且可任选地包括承载流体和温控电子部件的印刷电路板或柔性电路层。电子部件可任选地容纳在可重复使用对接单元中。包括电子部件的PCA 1501优选地由低热质量材料和表面安装电子部件构成。表面安装电阻器和位于近端的温度传感器的阵列提供一种调控测试盒中的腔室温度的装置。当测试盒装入对接单元中时，PCA 1501的表面安装电阻器和温度传感器阵列位于与测试盒对准的位置。在图16中示出样品-结果一体化测试盒。图17展示具有基于传统的印刷电路板和表面安装部件的下伏电子器件层的一体化盒。在一些实施方案中，可将柔性电路结合到测试盒的后部。
电子器件
在一些实施方案中，期望将可重复使用部件中的电子部件放置成使得加热器、传感器和其他电子器件通过能够与它们必须与之接口连接的一次性测试盒的上覆元件建立有利热界面和电子器件的准确对准的装置而接口连接到一次性测试盒。在其他实施方案中，期望使用可重复使用部件和一次性部件的组合来进行温度控制。例如，可用放置在可重复使用对接单元中的红外传感器来实现目标区外温度监测(stand-off temperaturemonitoring)，而用于温度控制和流体控制的电阻加热器放置在整合到一次性测试盒中的柔性电路中。
在一些实施方案中，印刷电路板(PCB)包括标准的0.062英寸厚的FR4覆铜层压材料，但也可使用其他标准板材料和厚度。诸如电阻器、热敏电阻器、LED和微控制器的电子部件优选地包括现成的表面安装装置(SMD)，并且根据工业标准方法进行放置。
在另选的实施方案中，PCA可与盒壁整合，并且包括柔性塑料电路。可使用诸如PET和聚酰亚胺的柔性电路材料，如图8所示。柔性塑料电路的使用在本领域中是众所周知的。在另一个实施方案中，可利用由诸如Soligie公司的公司开发的技术来将加热元件和温度传感器丝网印刷到塑料流控部件上。
在本发明的一些实施方案中，PCB厚度以及电阻加热器周围区域中铜的数量和放置针对流控部件中反应溶液的热管理来定制。这可通过使用已经提及的标准制造技术来实现。
在本发明的一些实施方案中，电阻器是厚膜2512封装件，但也可使用其他电阻器。流控部件中的加热腔室优选地具有与电阻器的尺寸类似的尺寸，以确保整个腔室的均匀加热。假设流控部件厚度为0.5mm，则单个此大小的电阻器足以加热约15μL的溶液。图2D中的图示出两个电阻器100，假设流控部件厚度为0.5mm，则两个电阻器100形成足以加热大约30μL溶液的加热器。在这种情况下，电阻器优选地各自为40欧姆并且以并联构型布置。
在本发明的一些实施方案中，温度传感器110优选地包括热敏电阻器(诸如0402NTC装置)或温度传感器(诸如Atmel AT30TS750)，其中的每一者具有与2512电阻器封装件的高度类似的高度。在一个电阻器或两个电阻器设置的情况下，热敏电阻器优选地分别邻近电阻器加热器对准或在电阻器加热器之间对准。通过使这些电子元件紧密对准，它们之间仅产生非常薄的气隙。此外，在将流控器件与电子层组装之前施用热化合物确保了流控部件、电阻器与热敏电阻器之间的良好热接触。
在本发明的一些实施方案中，通气口电阻器70、71包括厚膜0805封装件，但也可使用类似的电阻器。代替电阻器，也可使用小规格的镍铬合金线加热元件，诸如40规格的镍铬合金线。
在本发明的一些实施方案中，微控制器是微芯片技术PIC16F1789。微控制器优选地与流控系统的复杂性相匹配。例如，通过多重化，各个通气口和加热器的数量与微控制器I/O线的数量相当。存储器大小可选择成容纳程序大小。
在本发明的某些实施方案中，使用在ON-OFF模式下操作的SOT-23封装件中的N通道MOSFET来调制通气口电阻器和加热器电阻器的电流负载。通过微控制器发送调制信号。在另选的实施方案中，可使用脉冲宽度调制方案和/或其他控制算法来实现流控的更先进的热管理。这通常由微控制器处理，并且可能需要本领域技术人员已知的另外硬件和/或软件特征。
根据应用，一些实施方案包括其中小型控制对接单元或对接单元操作较小的一次性单元的装置，所述较小的一次性单元包括与生物材料接触的流控系统(称为测试盒)。在一个这样的实施方案中，对接单元包括电子部件。从一次性测试盒消除电子部件减少了成本，并且在某些情况下降低了环境影响。在另一个实施方案中，一些电子部件包括在对接单元和测试盒两者中。在此特定实施方案中，测试盒优选地包括低成本PCA或优选地包括柔性电路，以提供一些电功能(诸如温度控制、流体流动控制和温度感测)，所述电功能由对接单元通过适当的接口激励、控制和/或询问。如上所述，这种装置的电功能优选地分离成两个单独子组件。一次性盒2500优选地包括被设计来与对接单元的电阻加热和感测元件接口连接的后表面。优选地选择包括测试盒的后面的材料来提供合适的导热性和稳定性，同时通过通气口破裂实现流体流动控制。在一些实施方案中，测试盒的后面或测试盒的一部分包括在诸如聚酰亚胺的基板上制造的柔性电路。柔性电路可用于提供具有低热质量的低成本电阻加热元件。柔性电路基板可优选地放置成与存在于测试盒的流体网络中的溶液直接接触，以实现高效且快速的加热和冷却。如图8所示的连接器810优选地提供通向电阻加热器的电流以及通向一个或多个任选热敏电阻器的电力和信号线。
在使用柔性电路799的情况下，位于对接单元中的一个或多个IR传感器可通过背衬805中的窗口或直接从柔性电路799的后部读取信号来监测加热腔室(例如，扩增腔室或检测腔室)的温度。任选地，可在PCA或柔性电路上使用热敏电阻器来监测温度。任选地对IR传感器和热敏电阻器的输出执行加权平均改善了读数与盒中的流体温度之间的相关性。另外，传感器还可检测环境温度，从而使得系统能够对其进行校正，以确保样品流体快速平衡到期望温度。
现在参考图33，对接单元优选地包括可重复使用部件子组件3980，其包括微控制器、MOSFET、开关、电源或电源插座和/或电池、任选的冷却风扇903、任选的用户接口、红外温度传感器901、902以及与盒2500的连接器810兼容的连接器900。当子组件通过连接器810和900配合时，对接单元优选地以基本上竖直或接近竖直的取向支撑一次性盒2500。尽管在本文所述的一些实施方案中基本上竖直取向是优选的，但如果装置倾斜地操作，那么可获得类似的结果，特别是在某些通路被涂覆以减小所用溶液的浸润角的情况下。
为了使操作成本最小化，可使用所述装置的另一个实施方案，其方式为通过消除位于一次性零件上的所有电子电路来减少系统的可消耗零件的成本。微控制器、加热器、传感器、电源和所有其他电路都位于多个PCA上，并且通过高导体数工业标准带状电缆相互电连接。还可添加显示器以帮助用户操作装置。还可利用任选的串行控制端口，以便允许用户上传测试参数的变化，并监测任何测试的进度。此实施方案的一个版本包括五个不同的PCA。主板PCA包含用于连接到系统中的其他板的控制电路、串行端口、电源和连接器。加热器板PCA包含加热电阻器元件、温度传感器和排放燃烧加热元件。为了促进此加热器板与一次性流控盒之间的热界面，将此板安装在弹簧加载的载体上，所述弹簧加载的载体通过盖的闭合动作朝向流控盒的后侧移动，直到与流控盒接触为止。薄型导热加热垫附连在腔室加热器电阻器和温度传感器的顶部上，从而改善加热器板与流控盒之间的热传递。使用缠绕在小型陶瓷载体周围的镍铬合金线，可实现耐用的排放燃烧加热元件。IR传感器板PCA安装在离盒的另一侧很小的距离处，以用于监测加热腔室温度。这实现加热和冷却过程的闭环温度控制，并适应环境温度变化。多个反射感测光学耦合器也安装在IR传感器板上，其实现对盒的存在的感测，并且可用于标识由位于盒上的可构造反射图案表示的盒的类型。显示板PCA可位于IR板的大致后面，以允许用户从装置的正面看到显示器。最终的PCA，闸门板横跨盒的顶部边缘定位，并且包含开关和用于检测盒是否已被使用的反射光学耦合器，并且当盖闭合时，将盒保持在适当位置以进行测试。
系统冷却任选地使用诸如消音式风扇(muffin style fan)的风扇来增强，所述风扇仅在测试的冷却阶段期间由微控制器打开。优选地使用通风系统将较冷的外部空气引向加热腔室并将其从装置的侧排出。
为了提供完整的样品-结果分子测试，本发明的上述实施方案中的任一者可与样品制备系统1300接口连接，样品制备系统1300提供核酸作为样品腔室1402的输出。这已经使用名称为“Highly Simplified Lateral Flow-Based Nucleic Acid SamplePreparation and Passive Fluid Flow Control”的国际公布号WO 2009/137059 A1中描述的样品制备技术来展示。所得一体化装置的实施方案在图15和图16中展示。
对接单元
可重复使用对接单元包括用于实现测试盒功能的必要电子部件。已发明各种对接单元实施方案以与测试盒设计中的对应变型接口连接。在一个实施方案中，图18和图19中所示的对接单元包括运行测试所需的所有电子部件，从而消除对测试盒中电子部件的需要。现在参考图18，在添加样品之前，将盒2500***对接单元2501中。对接单元2501包括诸如LCD显示器2502的显示器，以将诸如测试协议和测试状态的信息传送给用户。在盒***对接单元2501中之后，将样品引入到盒2500的取样端口20，并且闭合对接单元盖2503以发起测试。在图19中示出具有***的测试盒的对接单元，并且在图18B中示出具有处于闭合位置的盖的对接单元2501。
在对接单元的一些实施方案中，机构并入盖2503的铰链中，所述铰链将测试盒的滑动密封件91移动到闭合位置。密封的测试盒有助于确保扩增的核酸保留在测试盒内。现在参考图20，可采用手动或自动化方法来使阀在取样端口上方滑动以密封盒。在一些实施方案中，通过接合o形环来滑动密封取样端口。膨胀腔室盖件将阀滑动件保持在取样端口o形环上方的适当位置。通过伺服马达或通过诸如闭合可重复使用对接单元盖的手动动作将密封件移动就位，这进而致动机构以闭合盒密封件。在图示的实施方案中，齿条齿轮机构2504采用滑动密封致动器3979来将滑动密封件91移动到闭合位置。齿条齿轮机构2504可通过对接单元盖2503机械耦合到盖铰链而闭合的动作被机动化或移动。任选地，可将诸如光学传感器2505的传感器定位成询问滑动密封件91的位置，以确保在测定发起之前适当地放置密封件，如图21所示。光学传感器检测盒取样端口密封件的状态(即，位置)。光学传感器允许对接单元被编程来检测先前使用的测试盒的意外***并检测测试盒密封件的成功闭合。指示密封件故障的错误消息可显示在显示器2502上，并且如果传感器2505未能检测到密封件闭合，那么中止测试程序。在测试盒和对接单元的其他实施方案中，密封机构可包括机械密封腔室的其他装置，诸如如图22所示的旋转阀。在又一实施方案中，测试盒密封件可放置在铰接的盒盖中，放置成使得在没有首先闭合盒盖并且因此安放密封件的情况下***对接单元中是不可能的。在此实施方案中，在***对接单元中之前将样品添加到测试盒。在图23中示出包括具有密封件的铰接盖的测试盒。一般来讲，在将盒***对接单元中并将样品装入盒中之后，优选的是，在优选不使用伺服机构或其他机械装置的情况下，闭合对接单元的盖既自动地密封盒又发起测定。
在一些对接单元实施方案中，一组部件优选地促进正确的测试盒***，同时确保必须与测试盒接口连接的电子部件不会物理干扰盒***，而是在测试期间形成可靠的热界面。这些部件形成用于将PCA 75保持远离盒***路径直到盖2503闭合为止的机构。现在参考图24，在对接单元内，加热器板安装在PCA座2506上，PCA座2506优选地充当低热质量支架，而测试盒装入低热质量盒座2507中，其中导轨2509将盒引导到对接单元中并将其保持在正确的位置(诸如平行于加热器板表面)，以便与安装在PCA座2506上的PCA 75接口连接。在盖打开位置中，盒座2507上的突出部2508与PCA座2506接口连接，以维持用于盒***的沿着轨道2509的开放路径。优选地，倾斜表面跨越突出部2508的表面与部件2507的下部高度之间的距离，以在盖2503闭合期间促进突出部2508平滑地移动到PCA座2506上的凹入部2511中。在对接单元盖闭合时，突出部2508与凹入部2511接合，从而使加热器板安装件移动成更靠近测试盒2500的后表面。盖2503的闭合在盒座2507上施加向下的力，从而使盒座2507移动到某个位置，在所述位置中，突出部2508停留在凹入部2511中，从而导致PCA座2506移动成使得PCA 75压靠盒2500的后部。优选地，PCA座2506处于恒定的力(诸如弹簧力)下，以使得在盖闭合后能够通过PCA 75对盒的后部施加可再生的压力。PCA 75抵靠盒2500的后部放置形成热界面，所述热界面将来自PCA上的电阻加热器元件的热量传导到测试盒的温控腔室和通气口。优选地，部件2506和2507被构造成对系统贡献最小的热质量，并且为冷却设备(诸如风扇)提供通往测试盒表面的通路并通过传感器(诸如红外传感器)提供温度监测。在盖闭合之后，加热器板因此优选地牢固地压靠在测试盒的后部，从而形成热界面，所述热界面使得加热器板上的微加热器能够根据微控制器或微处理器控制对测试盒的流体腔室中的溶液进行加热并熔化测试盒的热不稳定通气口膜。图25展示处于脱离接合(盖打开)位置和接合(盖闭合)位置两者的盒-PCA接口连接机构的横截面。
在一些实施方案中，对接单元包括用于诸如温度感测、检测测试盒的存在或移除测试盒以及检测特定测试盒的应用的另外传感器，以实现测试参数的自动化选择。现在参考图26，红外传感器2600在上覆于温控腔室(诸如腔室30和90)的区域中检测测试盒的温度。传感器使得能够收集除了由PCA 75局部温度传感器(诸如传感器110)收集的温度数据之外或代替所述温度数据的温度数据。光学传感器可任选地但优选地用于检测特定测试盒，以标识用于特定疾病或病症的盒，并允许自动选择适于特定测试的温度曲线。现在参考图27A和图27B，光学传感器或光学传感器阵列(诸如光学传感器阵列2601)可与测试盒上的条形码或条形码特征2602结合使用，以确定测试盒的类型并确认测试盒的完全***和正确安放。与传感器2505一致的传感器阵列2602可用于通过在盖闭合之前检测闭合密封来检测先前使用的测试盒的***。对接单元可包括传感器，用于检测***对接单元中的测试盒的类型和/或确认盒在对接单元内的正确***、定位和对准。在图19中描绘的对接单元和测试盒系统中展示对A/B型流感测试盒的检测。对接单元优选地还可读取每个盒上的条形码或其他符号，并根据存储的程序改变其编程以用于不同的测定。
在本发明的一些实施方案中，期望对测试盒的两侧进行加热。在图28A和图28B中描绘双加热器PCA构型，其中测试盒***两个加热器PCA之间。
在另一个实施方案中，对接单元包括伺服致动器、用于自动化结果读出的光学子系统、无线数据通信子系统、触摸屏用户接口、可充电电池电源、以及接受包括一体化样品制备子系统的测试盒的测试盒接收器。现在参考图29A、图29B和图30，对接单元2700接受测试盒1500并使测试盒与PCA 1501热接触以实现测试盒的温度控制和流体流动控制。测试盒1500***枢转对接单元门2702的盒接收器狭槽3605中。在将粗样品或裂解物添加到测试盒后，对接单元门的闭合使测试盒的后部与PCA 1501对准并接触，并且与伺服致动器对准。伺服致动器3602定位成通过盒1500的致动器端口1310进入溶液隔室化部件1303，并提供使密封材料1305破裂所需的机械力。机械密封件1305的破裂释放粗裂解物和洗涤缓冲剂，以流过如上所述的样品制备子系统的样品制备毛细管材料。在完成毛细管流体输送之后，定位成通过盒1500的致动器端口1320进入洗脱贮存器1317的伺服致动器3601提供机械力以使部件1317移动，使得附接的导管1318与密封件1316形成密封并使结合基质1306移位到洗脱隔室1321中。然后，定位成通过盒1500的致动器端口1322进入洗脱柱塞1319的伺服致动器3604向柱塞1319提供机械力，以通过结合基质1306将洗脱缓冲剂从洗脱贮存器1317排出，从而导致核酸洗脱到盒1500的取样杯1402中。在如上所述的洗脱之后，伺服致动器3603密封盒。致动器控制优选地由控制电子器件PCA 3606上的微控制器或微处理器根据固件或软件指令来提供。类似地，测试盒内的温度和流体流动控制是根据存储在微控制器或微处理器存储器中的固件或软件例程中提供的指令进行的。包括图31中所示的LED光源3608和CMOS传感器3609的光学子系统3607将检测条带信号数据数字化。将收集的检测条带图像存储到对接单元内的存储器中，在存储器中可使用机载处理器实现结果解释并将其报告给LCD显示器2701。在使用基于CMOS的数码相机进行的图像采集期间，LED环提供均匀的照明。用邮票大小的装置收集的图像可提供适于比色侧向流动信号分析的高分辨率数据(5百万像素，10位)。优选的超薄(low profile)设计(-1cm)连同短工作距离光学器件使得系统能够整合到薄型装置外壳中。
任选地，可通过并入对接单元中的使用标准WiFi或蜂窝通信网络的无线通信系统来传输数字化结果以用于离线分析、存储和/或可视化。在图32A和图32B中示出此对接单元实施方案的照片。
实施例
实施例1：纯化的病毒RNA(A/B型流感病毒)和内部阳性对照病毒的多重扩增和检 测方法
将A型和B型流感病毒测试盒放入对接单元中。将40μL样品溶液添加到取样端口。样品溶液包含浓度等于5000TCID50/mL的纯化A/Puerto Rico流感RNA、浓度等于500TCID50/mL的纯化B/Brisbane流感RNA或分子级水(无模板对照样品)。在进入取样端口时，40μL样品在其流动到测试盒的第一腔室时与冻干珠共混。冻干珠包含作为阳性内部对照的MS2噬菌体病毒颗粒以及DTT。在盒的第一腔室中，将样品加热至90℃达1分钟以促进病毒裂解，然后在打开连接第二腔室的通气口之前冷却至50℃。打开连接到第二腔室的通气口允许样品通过使第二腔室中的空气移位到膨胀腔室而流入第二腔室中。当样品移动到第二腔室时，它将寡核苷酸扩增引物与A型流感病毒、B型流感病毒和MS2噬菌体共混，并且逆转录和核酸扩增试剂和酶作为冻干丸粒存在于第一腔室与第二腔室之间的流体路径的凹槽中。
将扩增腔室加热至47℃达6分钟，在此期间将RNA模板逆转录成cDNA。在完成逆转录后，在第二腔室中进行40个循环的热循环扩增。在热循环完成后，打开连接到第三腔室的通气口以允许反应溶液流入第三腔室中。第三腔室包括测试条带和冻干珠，所述冻干珠包含用作检测颗粒的三种蓝染色的聚苯乙烯微球缀合物。缀合物包含300nm聚苯乙烯微球，所述聚乙烯微球共价连接到与A型流感病毒或B型流感病毒或MS2噬菌体的扩增序列互补的寡核苷酸探针。当溶液流入第三腔室中时，溶液重构冻干的检测颗粒。将三条捕获线固定在侧向流动隔膜上，从装置底部开始，它们为：不与任何测定的靶标互补的阴性对照寡核苷酸；与B型流感病毒的扩增产物互补的捕获探针；与A型流感病毒的扩增产物互补的捕获探针；以及与MS2噬菌体的扩增产物互补的寡核苷酸。在目测结果之前，使侧向流动条带显影达6分钟。在侧向流动条带显影时，A型流感病毒阳性样品在A型流感病毒和MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，B型流感病毒阳性样品在B型流感病毒和MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，阴性样品仅在MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，如图34所示。
实施例2：缓冲剂中的病毒裂解物和内部阳性对照病毒的多重扩增和检测方法
将A型和B型流感病毒测试盒放入对接单元中。将40μL样品溶液添加到取样端口。样品溶液包含浓度等于5000TCID50/mL的A/Puerto Rico流感病毒、浓度等于500TCID50/mL的B/Brisbane流感病毒或分子级水(无模板对照样品)。在进入取样端口时，40μL样品在其流动到测试盒的第一腔室时与冻干珠共混。冻干珠包含作为阳性内部对照的MS2噬菌体病毒颗粒以及DTT。在盒的第一腔室中，将样品加热至90℃达1分钟以促进病毒裂解，然后在打开连接第二腔室的通气口之前冷却至50℃。打开连接到第二腔室的通气口允许样品通过使第二腔室中的空气移位到膨胀腔室而流入第二腔室中。当样品移动到第二腔室时，它将寡核苷酸扩增引物与A型流感病毒、B型流感病毒和MS2噬菌体共混，并且逆转录和核酸扩增试剂和酶作为冻干丸粒存在于第一腔室与第二腔室之间的流体路径的凹槽中。
将扩增腔室加热至47℃达6分钟，在此期间将RNA模板逆转录成cDNA。在完成逆转录后，在第二腔室中进行40个循环的热循环扩增。在热循环完成后，打开连接到第三腔室的通气口以允许反应溶液流入第三腔室中。第三腔室包括测试条带和冻干珠，所述冻干珠包含用作检测颗粒的三种蓝染色的聚苯乙烯微球缀合物。缀合物包含300nm聚苯乙烯微球，所述聚乙烯微球共价连接到与A型流感病毒或B型流感病毒或MS2噬菌体的扩增序列互补的寡核苷酸探针。当溶液流入第三腔室中时，溶液重构冻干的检测颗粒。将三条捕获线固定在侧向流动隔膜上，从装置底部开始，它们为：不与任何测定的靶标互补的阴性对照寡核苷酸；与B型流感病毒的扩增产物互补的捕获探针；与A型流感病毒的扩增产物互补的捕获探针；以及与MS2噬菌体的扩增产物互补的寡核苷酸。在目测结果之前，使侧向流动条带显影达6分钟。在侧向流动条带显影时，A型流感病毒阳性样品在A型流感病毒和MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，B型流感病毒阳性样品在B型流感病毒和MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，阴性样品仅在MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，如图35所示。
实施例3：掺入阴性临床鼻腔样品中的流感病毒(纯化的)和内部阳性对照病毒的 多重扩增和检测方法
将从人类受试者收集的鼻腔拭子样品置于3mL的0.025％Triton X-100，10mMTris，pH 8.3溶液中，并使用FDA批准的实时RT-PCR测试针对A型流感病毒和B型流感病毒的存在进行测试。在本研究中使用之前，确认样品对A型流感病毒和B型流感病毒是阴性的。用浓度等于5000TCID50/mL的A/Puerto Rico流感病毒掺入所确认的流感病毒阴性鼻腔样品，或者在不添加病毒的情况下用作阴性对照。将40μL所得的掺入样品或阴性对照样品添加到A型和B型流感病毒测试盒的取样端口。在进入取样端口时，40μL样品在其流动到测试盒的第一腔室时与冻干珠共混。冻干珠包含作为阳性内部对照的MS2噬菌体病毒颗粒以及DTT。在盒的第一腔室中，将样品加热至90℃达1分钟以促进病毒裂解，然后在打开连接第二腔室的通气口之前冷却至50℃。打开连接到第二腔室的通气口允许样品通过使第二腔室中的空气移位到膨胀腔室而流入第二腔室中。当样品移动到第二腔室时，它将寡核苷酸扩增引物与A型流感病毒、B型流感病毒和MS2噬菌体共混，并且逆转录和核酸扩增试剂和酶作为冻干丸粒存在于第一腔室与第二腔室之间的流体路径的凹槽中。
将扩增腔室加热至47℃达6分钟，在此期间将RNA模板逆转录成cDNA。在完成逆转录后，在第二腔室中进行40个循环的热循环扩增。在热循环完成后，打开连接到第三腔室的通气口以允许反应溶液流入第三腔室中。第三腔室包括测试条带和冻干珠，所述冻干珠包含用作检测颗粒的三种蓝染色的聚苯乙烯微球缀合物。缀合物包含300nm聚苯乙烯微球，所述聚乙烯微球共价连接到与A型流感病毒或B型流感病毒或MS2噬菌体的扩增序列互补的寡核苷酸探针。当溶液流入第三腔室中时，溶液重构冻干的检测颗粒。将三条捕获线固定在侧向流动隔膜上，从装置底部开始，它们为：不与任何测定的靶标互补的阴性对照寡核苷酸；与B型流感病毒的扩增产物互补的捕获探针；与A型流感病毒的扩增产物互补的捕获探针；以及与MS2噬菌体的扩增产物互补的寡核苷酸。在目测结果之前，使侧向流动条带显影达6分钟。在侧向流动条带显影时，A型流感病毒阳性样品在A型流感病毒和MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，阴性对照样品仅在MS2噬菌***置处显示蓝色测试线的形成，如图36所示。
需注意，在本说明书和权利要求中，“约”或“大约”意指在所引用的数值量的百分之二十(20％)内。如本文所使用，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指代物。因此，例如，对“官能团”的引用是指一种或多种官能团，并且对“方法”的引用包括对本领域技术人员已知的等效步骤和方法的引用，诸如此类。
尽管已经具体参考所公开的实施方案详细描述本发明，但是其他实施方案可获得相同的结果。本发明的变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且意图覆盖所有此类修改和等效物。上文提及的所有专利和出版物的全部公开内容据此以引用方式并入本文。