阅读说明：本技术 一种巨霸杨wrky转录因子基因及其应用 (Populus giganteus WRKY transcription factor gene and application thereof ) 是由 董研 张超 杨敏生 于 2019-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种巨霸杨WRKY转录因子基因及其应用,属于植物基因工程领域。该基因是从杨柳科杨属优良品种巨霸杨中克隆出的WRKY转录因子,即W12基因,其具有的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。首先对获得的W12基因进行扩增,然后酶切回收目的片段；其次,将目的片段与pBI121构建重组原核表达载体并转化烟草,得到抗虫性烟草植株。再次,选择生长健壮的转基因烟草株系(B5、B12、A12)和野生型烟草,进行饲虫试验。本发明的目的基因成功高效表达、构建的载体可用于转基因改造植株,获得高抗虫性品种。(The invention discloses a Kbayanus WRKY transcription factor gene and application thereof, belonging to the field of plant genetic engineering. The gene is a WRKY transcription factor cloned from a Populus juba of a superior variety of Populus of Salicaceae, namely a W12 gene, and the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID NO. 1. Firstly, amplifying the obtained W12 gene, and then carrying out enzyme digestion to recover a target fragment; secondly, constructing a recombinant prokaryotic expression vector by the target fragment and pBI121 and transforming tobacco to obtain an insect-resistant tobacco plant. Again, the strongly growing transgenic tobacco lines (B5, B12, A12) and wild type tobacco were selected for the feeding worm test. The vector successfully and efficiently expressed and constructed by the target gene can be used for transgenic transformation of plants to obtain high-insect-resistance varieties.)

一种巨霸杨WRKY转录因子基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种巨霸杨WRKY转录因子基因及其应用。

背景技术

转录因子(transcription factor，TF)，又叫反式作用因子(trans actingfactor)，是指能够与靶基因启动子区域的顺式作用元件进行特异性识别并结合，进而调节下游基因表达的一类蛋白质。转录因子广泛存在于植物中，其家族如NAC，AP2/ERF和WRKY等对植物的调控有着至关重要的作用(Jiang Y et al.Genome-wide transcription factorgene prediction and their expressional tissue-specificities in maize.Journalof Integrative Plant Biology,2012,54(9):616-630.)。经研究证实，这些转录因子能够与多种防御相关基因的启动子顺式作用元件相互作用，并诱导其表达以增强对胁迫的抗性(Agarwal M et al.A R2R3 type MYB transcription factor is involved in the coldregulation of CBF genes and in acquired freezing tolerance.Journal ofBiological Chemistry,2006,281(49):37636–37645.)。

WRKY家族是最大的转录因子家族之一。WRKY转录因子参与植物多种生物学过程，如响应生物和非生物胁迫、转导激素信号、调节生长发育等。WRKY转录因子因含有一段高度保守的七肽序列WRKYGQK而被定义，该序列由60多个氨基酸残基组成，后来简称为WRKY转录因子家族。1994年，从双子叶植物甘薯(Ipomoea batatas)中鉴定出来首个WRKY成员SPF1基因，它编码549个氨基酸(Ishiguro S,Nakamura K.Characterization of a cDNAencoding a novel DNA-binding protein,SPF1,that recognizes SP8 sequences inthe 5’upstream regions of genes coding for sporamin and betaamylase fromsweet potato.Molecular Genetics and Genomics,1994,244(6):563-571.)。随后，从单子叶植物野燕麦(Avena fatua)中分离到两种WRKY蛋白ABF1和ABF2(Rushton PJ,etal.Members of a new family of DNA binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters ofα-Amy2 genes.Plant Molecular Biology,1995,29(4):691-702.)，又在欧芹(Petroselinum crispum)中鉴定出三种能被诱导子诱导并调控核糖体蛋白的WRKY基因(Rushton PJ et al.Interaction of elicitor induced DNA-bindingproteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1genes.The EMBO Journal,1996,15(20):5690-5700.)。

干旱、高盐和低温等非生物逆境是影响农作物产量的重要因素。WRKY转录因子由于其过量表达能够提高植物抗旱、耐盐、耐低温、抗冻甚至抵抗重金属等逆境胁迫的能力，因此被作为应用基因工程途径进行植物抗逆性状改良的理想候选基因(司爱君等WRKY转录因子在植物非生物胁迫抗逆育种中的应用.江苏农业科学:1-5[2019-09-27].https://doi.org/10.15889/j.issn.1002-1302.2019.16.003.)，但未见报道WRKY转录因子在提高杨树抗虫性方面的作用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种巨霸杨WRKY转录因子基因，该基因能够增强其抗虫性；本发明的目的之二在于提供含有巨霸杨WRKY转录因子基因的重组植物表达载体；本发明的目的之三在于提供所述巨霸杨WRKY转录因子基因或所述重组植物表达载体在提高植物抗虫中的应用；本发明的目的之四在于提供一种提高植物抗虫性的方法，利用转基因技术将巨霸杨WRKY转录因子超表达载体遗传转化植物能够提高植物的抗虫性。

为达上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的目的之一在于提供巨霸杨WRKY转录因子基因，所述巨霸杨WRKY转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述巨霸杨WRKY转录因子基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之二在于提供含有巨霸杨WRKY转录因子基因的重组植物表达载体。

进一步的，所述重组植物表达载体由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列连入pBI121载体制得。

本发明的目的之三在于提供所述巨霸杨WRKY转录因子基因或所述重组植物表达载体在提高植物抗虫中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种提高植物抗虫性的方法，包括如下步骤：通过在植物中过量表达巨霸杨WRKY转录因子基因，所述巨霸杨WRKY转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，在植物中过量表达巨霸杨WRKY转录因子基因的方法如下：克隆巨霸杨WRKY转录因子基因，然后构建植物表达载体，获得含有巨霸杨WRKY转录因子基因的重组植物表达载体，再将获得重组植物表达载体转化农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化需要增强抗虫性的植物，获得抗虫性增强的植株。

进一步的，克隆巨霸杨WRKY转录因子基因的方法为：以巨霸杨cDNA为模板，SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示序列为引物进行PCR扩增，电泳检测，回收，获得巨霸杨WRKY转录因子基因。

进一步的，所述重组植物表达载体为将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连入pBI121载体制得。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在生产本发明的巨霸杨WRKY蛋白多肽时，可将巨霸杨WRKY蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成巨霸杨WRKY蛋白表达载体。

如本发明所用“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过将巨霸杨WRKY转录因子编码序列连于植物表达载体上，构建含有所述编码序列的植物表达载体，将该载体转入农杆菌，将农杆菌转入烟草中，获得的阳性植株与野生型烟草同时进行饲虫试验，各转基因烟草株系和野生型烟草损失的叶面积差异显著，说明转W12基因能提高植物的抗虫性。

附图说明

图1为实施例1中基因W12的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为实施例1中重组原核表达载体pW12#op+121的结构示意图。

图3为实施例1中转基因植株和野生型植株的饲虫试验结果图。

具体实施方式

实施例1

1、从已测定的昆虫取食巨霸杨转录组数据(未发表)中，筛选出W12转录因子并得到其拼接序列，同时选定XbaI和SacI为酶切位点，以此为依据设计特异性引物，包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

上游引物SEQ ID NO.3：5’-ATGGCCAAAGGAAGTGGTGGACTCT-3’；

下游引物SEQ ID NO.4：5’-TTAATCGCTCGGAAAACTTGAATTG-3’。

2、采用多糖多酚植物RNA提取试剂盒提取巨霸杨RNA，步骤如下：

①将研钵和药匙用乙醇燃烧灭菌晾至常温后，取0.1g巨霸杨叶片用液氮迅速研磨成粉末，装入离心管中；

②向管中加入570μLBuffer RSP和30μLβ-巯基乙醇，56℃温育1-3min；

③漩涡震荡30s，再将裂解液离心10min，14000rpm；

④将上步所得液体转吸到DNA清除柱中，离心1min，10000rpm，弃柱；

⑤向收集管中加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，再将液体加入到RNA纯化柱上，离心1min，10000rpm，弃液；

⑥将RNA柱放入新收集管中，加入700μL Buffer RP，离心1min，10000rpm，弃液；

⑦加入700μL Buffer WB，离心2min，14000rpm，弃液；

⑧将RNA纯化柱加入到新离心管中，悬空滴加100μL Buffer EB到柱膜上，30℃温育5min，离心1min，10000rpm，弃柱，离心管中为RNA溶液。

3、参照cDNA反转录试剂盒说明书将所提RNA反转录成cDNA，具体步骤如下：

②反应体系16μL：RNA 2μL，4×gDNA wiper Mix 4μL，RNase free ddH₂O 10μL；

②用移液器轻轻吹打混匀，42℃孵育2min；

③向上述反应体系中加入5×HiScript II qRT SuperMix II 4μL；

④轻轻吹打混匀，50℃孵育15min；85℃变性5s；

⑤回收得到cDNA。

4、以cDNA为模板用特异性引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4进行PCR扩增目的片段，将上述PCR产物与pUCm-T载体置于16℃水浴连接12得到pW12+T载体，测序验证序列的正确性。

5、测序正确的重组克隆载体pW12+T转化大肠杆菌，通过摇菌的方式克隆以及扩增目的基因，具体方法为：

①于-80℃冰箱取出制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰水混合物中；

②在超净台内，吸取10μL连接产物于感受态细胞中，混匀后置于冰中30min；

③42℃水浴150s后，立即置于冰水中2min；

④在超净台内，加入400μL LB液体培养基，混匀，37℃、150rpm振荡培养1h；

⑤吸取120μL菌液滴加到LB(40ml LB+40mg·L^-1Amp)固体培养基上，均匀涂抹，菌板置于37℃培养箱中培养24h，至长出单菌落；

⑥在超净工作台内挑取单菌落，用于PCR检测及摇菌保存。将电泳验证后的菌液送去测序，测序结果与本课题组已有转录组数据进行比对两者一致即为目的序列，测序正确的菌液记为pW12+T存于-80℃保存。

6、从pW12+T菌液中通过质粒提取、双酶切(XbaI和SacI)以及胶回收得到带有粘性末端的目的基因W12，其中琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，该目的基因测序结果如序列表SEQ ID NO：1所示。将载体pBI121用XbaI和SacI双酶切，将酶切后的质粒与胶回收得到带有粘性末端W12基因连接，得到重组原核表达载体pW12#op+121，其结构示意图如图2所示，并将其转化入大肠杆菌中。具体步骤如下：

①从测序符合要求的pW12+T菌液和pBI121菌液中提取质粒pW12+T和pBI121，均用XbaI和SacI双酶切pW12+T和pBI121质粒，pW12+T胶回收小片段，pBI121质粒胶回收大片段，连接两种胶回收产物，合成载体pW12#op+121，转化大肠杆菌感受态，标记为pW12#op+121菌液。。

7、从pW12#op+121大肠杆菌中提取质粒pW12#op+121，转化农杆菌，具体步骤如下：

①于-80℃冰箱取出制备好的农杆菌感受态细胞，置于冰水混合物中融化5min；

②在超净台内，吸取10μL的pW12#op+121质粒于感受态细胞中，混匀后置于冰水30min；

③取出置于液氮中，冷却5min；

④37℃水浴5min后，立即置于冰水中5min；

⑤加入600μL LB液体培养基，混匀，于27℃、150rpm振荡培养4h～6h；

⑥转入含抗生素的LB液体培养基(40ml LB+20mg·L^-1Kan+20mg·L^-1Rif)，27℃、150rpm振荡培养72h；

⑦用无菌枪头沾取菌，并在LB固体培养基(40ml LB+20mg·L^-1Kan+20mg·L^-1Rif)上划板，27℃培养箱中培养至长出单菌落；

⑧在超净台内，挑取单菌落，可用于PCR检测及摇菌保存，标记为pW12#op+121农杆菌。

8、通过农杆菌介导法侵染烟草，具体步骤如下：

①摇菌：于-80℃冰箱取出pW12#op+121农杆菌过表达载体，在超净台内吸取200μL菌液加入到含有抗生素的40mL LB液体培养基中(40mL LB+20μL Kan+20μL Rif)，于27℃、150rpm的摇床上振荡培养，至OD₆₀₀＝0.4～0.6时，用于转化烟草；

②侵染：选取生长健壮且鲜绿的烟草组培苗，将叶片剪成约1cm²，置于菌液:糖水＝1:1(v/v)的混合液中侵染10min；

③共培养：浸染过的叶片取出后，用灭菌纸吸去叶片表面菌液，平铺于MS培养基上，置于避光处暗培养36h。

④筛选培养：共培养结束后，将烟草叶片转至筛选培养基(MS+2.0mg·L^-16-BA+0.1mg·L^-1IBA+800mg·L^-1Cef+50mg·L^-1Kan)上继续培养，每20d更换一次培养基，于25℃、光照强度2000Lx、光/暗周期16h/8h条件下培养。

⑤转基因烟草苗的获得：经过30d-50d的抗性芽筛选，将嫩绿的抗性芽移接至生根培养基(MS+800mg·L^-1Cef+50mg·L^-1Kan)进行生根筛选。若幼苗长出根系，初步确定得到超表达W12基因的烟草植株，可用于后续试验。

9、选择生长健壮的转基因烟草株系(B5、B12、A12)和野生型烟草，分别剪取约为20cm²相同叶面积的叶片进行饲虫试验。购买二龄棉铃虫，喂食饲料于培养箱中培养24h。次日剪取烟草叶片，正面朝上置于铺有滤纸的培养皿中，滤纸上喷滴清水保湿，于培养皿中饲喂棉铃虫幼虫。同一培养皿中同时放有相同叶面积转基因烟草株系(B5、B12、A12)和野生型烟草的叶片，挑选生长一致的虫体，每个皿中放置15只棉铃虫进行偏好性饲虫试验，于0h、4h、8h拍照记录各株系叶面积损失情况，结果如图3所示。

由图3可知，开始时将棉铃虫放置培养皿中心，4h时观察到各个株系均有叶面积损失，但虫子主要集中在野生型烟草叶片上，其叶片被啃食的面积较多；饲虫8h时，野生型烟草叶面积损失近50％，而各转基因株系叶面积损失均不足10％，各转基因烟草株系和野生型烟草损失的叶面积差异显著，说明转WRKY31基因能提高植物的抗虫性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种巨霸杨WRKY转录因子基因及其应用

<130> 2019.12.17

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1632

<212> DNA

<213> 巨霸杨（Populus deltoids cv.JuBa）

<400> 1

atggccaaag gaagtggtgg actctccatt gattcagatc caatcgctac cagtggctac 60

tttctacaca aatcaactgt gctcacttct ttccctgaag agaacatcaa tcccaagtgg 120

aaacatcttg ctgcaactag cgcgagacaa tccatggatg tcaaagcgaa tagatctcct 180

ccttctactt tccaattccc tgtcaaactt ataaacacca atgaacatga ccacgatcat 240

gatcctgatt cttctttgcc atctgataat agacgacgga cagtcatcga tgagatggac 300

ttttttgctg acaagaaaca tgatgttgat cgcatgacca tcataaacaa tggtactggt 360

gatttaaaag actctggaag tcccgctgga ttggagctaa acgtcaacac tggtttgaat 420

cttcttacta ccaatactag cagcgaacaa tcgactgtgg atgatggcgt atcgtcgaac 480

atggaagata aaagagccaa gagtgagcta gcagttctgc gagctgaggt agaacgaatg 540

aaagtggaga atctacggtt gaaaggcatg ttaaatcatg ttactagtaa ttacaatgca 600

ttgcagatgg atttagttac acttatgcag gaccaaaatt ctcatcacaa gaatgaacag 660

cgtgatggca aaaacaaaga tgatggggta gttccaaggc agtgtatgga tcttggtcta 720

gttgctgctg cgggtggcga tgacacggat gaccattctc tatctacatc agaaggagga 780

aggaggcgtg atcgatcaag atcatctgga aataatgcag agaataacaa tgaagatggg 840

acagtctttg aacaagataa gaaaggaacc gatcaacgag aggagagccc agatcaaggt 900

tggggctcta ataaggctgc tagatttaac tcgacgaaaa ctgttgatca aacggaggct 960

acaataagga aggctcgtgt gtctgttcga gctagatcag aggatgctac gatatcggat 1020

ggatgccaat ggcgaaagta tggacagaag atggcaaaag gaaatccatg tcctcgagct 1080

tattatcggt gcaccatggc tgctggttgc ccagtacaga gatgcgcaga agatcggacc 1140

atcctcacaa ctacatacga gggtaaccac agccaccctt tgcctccggc tgccacggca 1200

atggcatcaa ccacatcatc ggcggcaaga atgctgttgt caggctccat gtctagtact 1260

gatggactga tgaactcaaa tttccttacc agaacgatcc tcccatgctc ctctagtctt 1320

gccactatat ctgcttcagc tccatttcct actgttacat tggacctaac ccaaaatccc 1380

agccctctac agctcccaaa gcaaccaatt caatttcaat tcccatttcc aaacccacct 1440

caaaatcttg ccaccgcttc agctgcagca ttgctgcctc agattcttgg acaagcactc 1500

tacaatcaat caaagtcctt tggcctgcaa atgtctcaag aaatgcagcc taatcgattg 1560

gaccaccaat cacaacctgc attgcagcag gggcagaaaa attcattggc tgacagcttg 1620

accacagcaa ct 1632

<210> 2

<211> 617

<212> PRT

<213> Populus deltoids cv.JuBa

<400> 2

Met Ala Lys Gly Ser Gly Gly Leu Ser Ile Asp Ser Asp Pro Ile Ala

1 5 10 15

Thr Ser Gly Phe Phe Leu His Lys Pro Thr Val Leu Thr Ser Phe Pro

20 25 30

Glu Glu Asn Ile Asn Leu Lys Trp Lys Gln Leu Ala Ala Thr Ser Ala

35 40 45

Arg Gln Ser Met Asp Val Lys Ala Thr Arg Ser Pro Pro Ser Thr Phe

50 55 60

Gln Phe Pro Val Lys Leu Ile Asn Thr Asn Gly His Asp His Asp His

65 70 75 80

Asp Pro Asp Ser Ser Leu Pro Ser Asp Asn Arg Arg Arg Thr Val Ile

85 90 95

Asp Glu Met Asp Phe Phe Ala Asp Lys Lys His Asp Val Asp Arg Met

100 105 110

Thr Ile Ile Asn Asn Gly Thr Gly Asp Leu Lys Asp Ser Gly Ser Pro

115 120 125

Ala Gly Leu Glu Leu Asn Val Asn Thr Gly Leu Asn Leu Leu Thr Ala

130 135 140

Asn Thr Ser Ser Glu Gln Ser Thr Val Asp Asp Gly Val Ser Ser Asn

145 150 155 160

Met Glu Asp Lys Arg Ala Lys Ser Glu Leu Ala Val Leu Arg Ala Glu

165 170 175

Val Glu Arg Met Lys Val Glu Asn Leu Arg Leu Lys Gly Met Leu Asn

180 185 190

His Val Thr Ser Asn Tyr Asn Ala Leu Gln Met Asp Leu Val Thr Leu

195 200 205

Met Gln Asp Gln Asn Ser His His Lys Asn Glu Gln Arg Asp Gly Lys

210 215 220

Asn Lys Asp Asp Gly Ile Val Pro Arg Gln Cys Met Asp Leu Gly Leu

225 230 235 240

Val Ala Ala Ala Gly Gly Gly Asp Thr Asp Asp Leu Ser Leu Ser Thr

245 250 255

Ser Glu Gly Gly Arg Arg Arg Asp Arg Ser Arg Ser Ser Gly Asn Asn

260 265 270

Ala Glu Asn Asn Asn Glu Asp Gly Thr Val Phe Glu Gln Asp Lys Lys

275 280 285

Gly Thr Asp Gln Arg Glu Glu Ser Pro Asp Gln Gly Trp Gly Ser Asn

290 295 300

Lys Ala Ala Arg Phe Asn Ser Thr Lys Thr Val Asp Gln Thr Glu Ala

305 310 315 320

Thr Ile Arg Lys Ala Arg Val Ser Val Arg Ala Arg Ser Glu Asp Ala

325 330 335

Thr Ile Ser Asp Gly Cys Gln Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Met Ala

340 345 350

Lys Gly Asn Pro Cys Pro Arg Ala Tyr Tyr Arg Cys Thr Met Ala Ala

355 360 365

Gly Cys Pro Val Arg Lys Gln Val Gln Arg Cys Ala Glu Asp Arg Thr

370 375 380

Ile Leu Thr Thr Thr Tyr Glu Gly Asn His Ser His Pro Leu Pro Pro

385 390 395 400

Ala Ala Thr Ala Met Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ala Ala Arg Met Leu

405 410 415

Leu Ser Gly Ser Met Ser Ser Thr Asp Gly Leu Met Asn Ser Asn Phe

420 425 430

Leu Thr Arg Thr Ile Leu Pro Cys Ser Ser Ser Leu Ala Thr Ile Ser

435 440 445

Ala Ser Ala Pro Phe Pro Thr Val Thr Leu Asp Leu Thr Gln Asn Pro

450 455 460

Ser Pro Leu Gln Leu Pro Lys Gln Pro Ile Gln Phe Gln Val Pro Phe

465 470 475 480

Pro Asn Pro Pro Gln Asn Leu Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ala Leu Leu

485 490 495

Pro Gln Ile Leu Gly Gln Ala Leu Tyr Asn Gln Ser Lys Phe Ser Gly

500 505 510

Leu Gln Met Ser Gln Asp Met Gln Pro Asn Arg Leu Gly His Gln Ser

515 520 525

Gln Pro Ala Leu Gln Gln Gly Gln Gln Asn Ser Leu Ala Asp Gly Leu

530 535 540

Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ala Asp Pro Asn Phe Thr Ala Ala

545 550 555 560

Leu Ala Ala Ala Ile Thr Ser Ile Ile Gly Gly Ala His Gln Asn Asn

565 570 575

Ile Asn Ser Ile Asn Asn Val Gln Thr Thr Thr Ser Asn Asn Asn Ser

580 585 590

Asn Gly Asn Ile Thr Thr Ser Asn Asn Asn Ser Tyr Gly His Asn Lys

595 600 605

Ile Thr Asn Ser Ser Phe Pro Ser Asp

610 615

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccaaag gaagtggtgg actct 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaatcgctc ggaaaacttg aattg 25