阅读说明：本技术 一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法与应用 (Method for screening hybridoma cell strain secreting pairing monoclonal antibody and application ) 是由 唐勇 王磊 金志远 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法与应用。本发明提供的方法将Oleyl-PEG4000-NHS与捕获抗体偶联,将偶联物加入待筛选的杂交瘤细胞克隆中,培养；弃上清,清洗；加入抗体封闭剂,培养；弃上清,清洗；加入能与捕获抗体结合的抗原,培养；弃上清,清洗；加入荧光物质标记的抗鼠二抗,培养；弃上清,清洗；加入不完全培养基,观察可见光和荧光下的细胞团,拍照,将产生荧光的细胞团标记为阳性克隆；分离阳性克隆细胞团的细胞,培养,得到分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该方法快速简便、准确率高,可直接筛选到分泌与捕获抗体配对抗体的阳性杂交瘤细胞株。(The invention discloses a method for screening hybridoma cell strains secreting pairing monoclonal antibodies and application. Coupling Oleyl-PEG4000-NHS with a capture antibody, adding the conjugate into a hybridoma clone to be screened, and culturing; discarding the supernatant, and cleaning; adding antibody blocking agent, and culturing; discarding the supernatant, and cleaning; adding an antigen capable of being combined with the capture antibody, and culturing; discarding the supernatant, and cleaning; adding an anti-mouse secondary antibody marked by fluorescent substance, and culturing; discarding the supernatant, and cleaning; adding an incomplete culture medium, observing cell clusters under visible light and fluorescence, taking a picture, and marking the cell clusters generating fluorescence as positive clones; separating the cells of the positive clone cell mass, and culturing to obtain the hybridoma cell strain secreting the paired monoclonal antibody. The method is rapid, simple and convenient, has high accuracy, and can directly screen out positive hybridoma cell strains secreting and capturing antibody paired antibodies.)

一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法与应用

技术领域

本发明属于免疫学检测技术领域，特别涉及一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法与应用。

背景技术

1975年，德国学者

和Milstein，首先报道了应用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞致敏的小鼠脾细胞融合，结果发现一部分融合的细胞既能生长，又能分泌抗羊红细胞抗体。这一发现使制备单一抗原决定簇的单克隆抗体的难题获得了解决，开创了利用细胞融合技术制备单克隆抗体技术先河。杂交瘤技术作为一项突破性的生物技术，为生物科学、临床医学等众多学科的研究提供了广阔应用前景。

单克隆抗体具备纯度高、特异性强、效价高等特性，目前已广泛用于免疫学检测产品开发，免疫学技术革新以及医学上治疗及诊断方法的改进。可以说单克隆抗体的应用已经成为生物学，医学上必不可少的重要手段。

目前常用的筛选单克隆抗体的方法是酶联免疫吸附试验(ELISA)及其他的方法，双抗体夹心原理大量应用于生物学基础研究领域及免疫检测产品开发领域。这些方法需要的时间长，且一次只能测一种抗体，或者需要的样本量较大。传统的筛选配对抗体需要先筛选到大量分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，然后大量制备抗体进行纯化，再通过双抗体夹心ELISA配对，过程繁杂，成功率低，耗时耗力。因而建立一种能直接筛选分泌配对单克隆抗体细胞株的方法以提高筛选效率及筛选精度十分必要。

发明内容

本发明首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，建立一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法。

本发明另一目的在于提供上述的筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法的应用。

本发明目的通过下述技术方案实现：

一种筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括如下步骤：

(1)将Oleyl-PEG4000-NHS与捕获抗体偶联，得到Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1，Ab1为捕获抗体；

(2)清洗待筛选的杂交瘤细胞克隆；加入Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1，培养；弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；

(3)加入抗体封闭剂，培养；弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；

(4)加入能与捕获抗体结合的抗原，培养；弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；

(5)加入荧光物质标记的抗鼠二抗，培养；弃上清，清洗杂交瘤细胞克隆；

(6)加入不完全培养基，观察可见光和荧光下的细胞团，拍照，将产生荧光的细胞团标记为阳性克隆，不产生荧光的细胞团标记为阴性克隆；

(7)分离阳性克隆细胞团的细胞，培养，得到分泌能与捕获抗体配对的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

步骤(1)中所述的捕获抗体优选为H7亚型禽流感病毒单克隆抗体。

步骤(1)中所述的偶联中的偶联比例优选为Oleyl-PEG4000-NHS：捕获抗体＝摩尔比5～7：5；更优选为Oleyl-PEG4000-NHS：捕获抗体＝摩尔比6：5。

步骤(1)中所述的偶联中的偶联方式为常规偶联，即Oleyl-PEG4000-NHS与捕获抗体直接按比例偶联即可。

步骤(2)中所述的Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1的加入量优选按96孔板每孔添加0.02～0.03mg计算；更优选按96孔板每孔添加0.025mg计算。

步骤(2)、(3)、(4)和(5)中所述的培养为按细胞培养条件培养，如37℃、5％CO₂。

步骤(2)中所述的培养的时间优选为30～60min；更优选择为60min。

步骤(3)中所述的抗体封闭剂优选为抗鼠二抗；更优选为羊抗鼠IgGFc二抗。

所述的抗体封闭剂的加入量优选为按96孔板每孔添加0.2～0.4mg计算；更优选为按96孔板每孔添加0.2mg计算；

步骤(3)中所述的培养的时间优选为45～60min；更优选择为60min。

步骤(4)中所述的能与捕获抗体结合的抗原的加入量优选为按96孔板每孔添加0.0625mg～0.6mg计算；更优选为按96孔板每孔添加0.3mg～0.6mg计算。抗原纯度越高，每孔添加量可减少。

步骤(4)中所述的培养时间优选为60min。

步骤(5)中所述的荧光物质包括异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)。

步骤(5)中所述的抗鼠二抗优选为羊抗鼠IgGFc二抗。

步骤(5)中所述的培养时间优选为60min。

步骤(2)、(3)、(4)和(5)中所述的清洗优选磷酸盐缓冲液(PBS)或不完全培养基进行清洗。

所述的磷酸盐缓冲液(PBS)为0.015M、pH7.4的磷酸盐缓冲液。

所述的不完全培养基的配制方法如下：链霉素和青霉素混合液与RPMI-1640培养基按照1：99体积比混合得到，其中链霉素和青霉素混合液中，链霉素和青霉素浓度均为1U/ml。

步骤(7)中所述的分离阳性克隆细胞团的细胞，具体操优选为：在含有阳性克隆细胞团的杂交瘤细胞克隆中加入半固体培养基，挑取阳性克隆细胞团的细胞，移至新的完全培养基。

所述的半固体培养基优选为甲基纤维素半固体培养基。

所述的甲基纤维素半固体培养基的配制方法如下：将不完全培养基与质量浓度为2.7％的甲基纤维素溶液按照体积比1：1混合均匀，得到甲基纤维素半固体培养基。

所述的半固体培养基的加入量以刚好覆盖培养板底为宜。96孔板每孔添加100μl。

上述直接筛选分泌配对单克隆抗体细胞株的方法在免疫学领域中应用，用于快速筛选到能分泌与捕获抗体配对的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

Oleyl-PEG4000-NHS是一种两亲性物质，一端亲脂，可***细胞膜表面，另一端PEG聚合物是亲水性的，其末端是经NHS活化过的羧基，可与抗体上的氨基结合。待细胞融合后5～6天，加入偶联好的Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1，Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1***细胞膜表面，加入抗体封闭剂(抗鼠二抗)对抗体(Ab1的Fc段)进行封闭，通过抗体与抗原特异性结合原理，加入能与Ab1特异性结合的抗原，将抗原与抗体特异性结合，抗原会捕获杂交瘤细胞分泌的能与捕获抗体(Ab1)配对的抗体(Ab2，杂交瘤细胞分泌的)，清洗掉未结合的抗体(Ab2)，再加入荧光二抗，利用荧光二抗与分泌抗体特异性结合的原理对阳性杂交瘤细胞株进行染色，定位。最后加入甲基纤维素半固体培养基，将阳性杂交瘤细胞株直接挑出，放入新的培养孔中培养。这样不仅能直接筛选到阳性杂交瘤细胞株，而且能直接筛选到分泌配对抗体的阳性杂交瘤细胞株，同时可利用该方法对筛选到的细胞进行克隆。

本发明相对现有技术具有如下优点及效果：

常规单克隆筛选一般至少需要一个月才能筛选到阳性杂交瘤细胞株，建立稳定细胞株后，还需要半个月进行单抗的定量生产，经纯化，定量，利用试剂盒进行配对抗体的筛选。本发明通过一种两亲性物质(Oleyl-PEG4000-NHS)能够快速直接筛选到分泌与捕获抗体配对的单克隆抗体的杂交瘤细胞。相比传统筛选配对抗体的方法，减少了传统的单克隆抗体制备过程中的筛选、抗体制备、抗体纯化、抗体夹心ELISA配对等过程，极大减少工作量，显著提高了成功筛选的几率。本发明方法不仅能直接筛选到阳性杂交瘤细胞株，而且能直接筛选到分泌配对抗体的阳性杂交瘤细胞株，同时可利用该方法对筛选到的细胞进行克隆，相比传统方法所使用的有限稀释法大大减少了工作量，且阳性克隆不易丢失。本发明方法10～15天内就能筛选到分泌配对抗体的杂交瘤细胞株，缩短筛选和配对鉴定的时间；可精准评价孔内每个细胞的抗体分泌情况和细胞克隆的变异情况，结合半固体培养基有利于挑选到稳定的分泌配对抗体的杂交瘤细胞。

附图说明

图1为实施例1制备的Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1溶液的SDS-PAGE检测结果图；其中，泳道1为Marker，泳道2为Oleyl-PEG4000-NHS，泳道3为Ab1，泳道4为Oley-PEG4000-NHS-Ab1。

图2为实施例1制备的Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1溶液的紫外可见分光光度计扫描结果图；其中，曲线A为Oleyl-PEG4000-NHS，曲线B为Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1，曲线C为Ab1。

图3为本实施例1制备的Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1溶液的直接免疫荧光鉴定结果照片图；其中，A1为SP2/0先加入Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1孵育1h，再加入100×FITC标记羊抗鼠IgGFc孵育45min，显微镜下200×荧光图像；A2为A1对应的400×荧光图像；B1为A1对应的200×可见光图像，B2为A2对应的400×可见光图像；A3为SP2/0细胞加入稀释100×FITC标记羊抗鼠IgGFc孵育45min时显微镜200×荧光图像，A4为A3对应的400×荧光图像；B3为A3对应的200×可见光图像，B4为A4对应的400×可见光图像。

图4为本实施例1筛选到的部分阳性克隆细胞团结果图；其中，A和B中的细胞克隆相同，C和D中的细胞克隆相同，A和C是在荧光条件下观察，B和D是在可见光条件下观察。

图5为实施例2用不同浓度的羊抗鼠IgGFc封闭抗体的直接免疫荧光结果图；其中，A为用0.125mg/ml羊抗鼠IgGFc封闭抗体的封闭结果图，B为用0.25mg/ml羊抗鼠IgGFc封闭抗体的封闭结果图，C为用0.5mg/ml羊抗鼠IgGFc封闭抗体的封闭结果图，D为用1mg/ml羊抗鼠IgGFc封闭抗体的封闭结果图，E为用2mg/ml羊抗鼠IgGFc封闭抗体的封闭结果图，F为用4mg/ml的羊抗鼠IgGFc封闭抗体的封闭结果图。

图6为实施例2用不同浓度的马血清封闭抗体的直接免疫荧光结果图；其中，A为用0.125mg/ml马血清封闭抗体的封闭结果图，B为用0.25mg/ml马血清封闭抗体的封闭结果图，C为用0.5mg/ml马血清封闭抗体的封闭结果图，D为用1mg/ml马血清封闭抗体的封闭结果图，E为用2mg/ml马血清封闭抗体的封闭结果图，F为用4mg/ml的马血清封闭抗体的封闭结果图。

图7为实施例2未用封闭剂封闭抗体的直接免疫荧光结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得，其中：

磷酸盐缓冲液(PBS，0.015mol/L，pH7.4)的配制方法如下：称取NaCl 8.0g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KCl 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g，加入去离子水溶解，调pH至7.4，定容至1000mL。

不完全培养基或基础培养基的配制方法如下：链霉素和青霉素混合液与RPMI1640培养基按照1：99体积比混合得到，其中链霉素和青霉素混合液中，链霉素和青霉素浓度均为1U/mL。

完全培养基：胎牛血清和上述不完全培养基按1：9体积比混合均匀，得到完全培养基；

HAT培养基：HAT、胎牛血清和上述不完全培养基按2：10：88体积比混合均匀，得到HAT培养基；

HT培养基：HT、胎牛血清和上述不完全培养基按2：10：88体积比混合均匀，得到HT培养基；

甲基纤维素半固体培养基的配制方法如下：将上述不完全培养基与质量浓度为2.7％的甲基纤维素溶液按照体积比1：1混合均匀，得到甲基纤维素半固体培养基。

PBST-T洗涤液：取Tween-20 0.5mL，0.015mol/L、pH 7.4PBS定容至1000mL。

实施例1筛选分泌配对单克隆抗体的杂交瘤细胞株

(1)杂交瘤细胞的获得

1)免疫：免疫原为深圳出入境检验检疫局提供的禽流感H7N9亚型标准检测抗原(哈尔滨维科生物有限公司)，按照说明书每瓶标准抗原加入2ml 0.015mol/ml的PBS溶解，然后利用BCA法测定抗原及各筛选肽浓度。用处理好的禽流感抗原免疫5周龄BALB/C雌性小鼠(购于南方医科大学，下同)，免疫策略如下表：

表1 H7亚型禽流感病毒免疫策略

小鼠四免后10天，通过尾静脉取血方式，收集50μl血液，先置于37℃恒温培养箱静置1h，然后置于冰箱4℃层过夜，让血清自然析出，第二天1500rpm离心15分钟收集上层血清，分装后置于-20℃保存。通过间接ELISA测定血清效价，取效价最高，即免疫效果最好的小鼠进行融合。

融合前摘眼球法处死小鼠，收集全部血液先置于37℃恒温培养箱静置1h，然后置于冰箱4℃层过夜，充分析出血清第二天，1500rpm离心15分钟收集上层血清，分装后置于-20℃保存。

2)融合：

融合前一天制备饲养层细胞。将剪刀、镊子、针头和泡沫盒事先放置于超净台紫外照射30min，然后摘眼球法处死小鼠，置于装有75％酒精烧杯中浸泡5min。取出小鼠置于泡沫盒上，用针头固定其四肢，用镊子轻轻挑起其腹部皮毛，可见皮毛与腹膜分离，用剪刀于皮毛上剪一小口(一定不能剪破腹膜)，用镊子沿着小口处撕开表皮。注射器吸取基础培养基5mL，注入小鼠腹腔，并用棉球轻柔腹腔1min，然后吸出基础培养基置于15ml离心管。再用注射器吸取5ml基础培养基，重复上面操作。将收集到的基础培养基于水平离心机上1000rpm，离心7min。用HAT培养基重悬腹腔细胞，计数，将细胞稀释至2×10⁸个/ml，每孔加100μl，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，融合前的一天制备好饲养细胞。

选择免疫效果最好的小鼠进行融合。事先高压灭菌剪刀，镊子各4把，玻璃皿2个，400目铁纱网一个，玻璃研磨棒1个。采用摘眼球法处死小鼠，收集小鼠血液用作阳性对照。尽量将小鼠血液放净，避免小鼠脾脏里血细胞过多，干扰融合。将处死的小鼠置于75％酒精中5min，然后同取饲养细胞方式打开腹膜，另换干净剪刀和镊子剪开腹膜，然后再另取镊子夹小鼠脾脏，用剪刀减掉上***。将脾脏放入预先装有基础培养的皿中轻轻洗涤。然后将脾脏放到铁网上，加入适量基础培养基，用剪刀将脾脏剪碎，然后用研磨棒轻轻研磨脾脏，至不见大块组织。收集细胞悬液于离心管，静置5min，去除大块组织沉淀，记录总体积，血球计数板计数。

融合前一周复苏骨髓瘤细胞SP2/0(购于上海细胞生物学研究所)，取培养的对数生长期SP2/0若干皿，用基础培养基轻轻洗涤两遍，去除死细胞。然后每块皿中加入3ml基础培养基，用1ml枪头轻轻吹下细胞，收集细胞于50ml离心管，读取细胞悬液体积，取适量细胞悬液用血球计数板计数。

根据计数结果，将脾细胞与SP2/0按照5～10:1的比例混合，置于水平离心机1000rpm，离心7min。离心后，弃去上清液，轻叩离心管使细胞松散。将离心管置于装有37℃去离子水的烧杯上，缓慢加入预先温育至37℃的PEG2000溶液(浓度为50％，Sigma)，1mlPEG2000溶液(一只老鼠的一个脾PE用量为1ml)，先慢后快，45秒内加完，然后静置90秒。提前准备15ml不完全培养基，温育至37℃，静置结束后于2～4min内加入离心管，先慢后快，边加边轻轻晃动离心管。终止完成后，于水平离心机，1000rpm，离心7min。离心结束，弃掉上清液，用HAT培养基重悬细胞，均匀铺到事先铺好饲养细胞板上。置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

(2)Oleyl-PEG4000-NHS与禽流感病毒的偶联和鉴定

称取偶联剂Oleyl-PEG4000-NHS 10mg，溶解于1ml PBS缓冲液，取100μl于小试剂瓶，放入转子于搅拌仪上边缓慢加2mg禽流感病毒抗原(哈尔滨维科生物有限公司)。将试剂瓶置于禽流感病毒抗原。将试剂瓶置于4℃，搅拌过夜。

超滤的目是为了除去未偶联上Oleyl-PEG4000-NHS分子，其分子量大约为4KD，而AIV分子量在5000KD以上，所以选择30KD孔径超滤管能除去未偶联的偶联剂，超滤过程如下：

1)取5ml PBS(0.015M，pH7.4)加入到30KD超滤管中，5000rpm离心10min。重复操作3次。

2)将样品加入超滤管中，5000rpm离心15min，待截留液剩余100μl以下，加入5mlPBS轻吹洗超滤管中膜，继续离心，重复超滤3次，收集截留液(控制在500μl以内)。

3)用PBS反复吹洗超滤管膜，充分去除残留杂质，然后离心。重操作3次。

4)用0.45μm滤膜处理过的20％乙醇装满超滤管，于4℃冰箱保存。

选用紫外可见分光度计扫描鉴定。其原理是通过观察吸收峰的偏移来判断偶联是否成功。Oleyl-PEG4000-NHS，AIV，Oleyl-PEG4000-NHS-AIV都有其特定的吸收峰，可以通过检测各自特征峰的有无及出位置来判定偶联是否成功。

用PBS将试剂盒中BSA标准蛋白浓度稀释为1.5mg/mL、1mg/mL、0.75mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0mg/mL八个梯度，将待测样本做多个梯度，然后每个样取25μl加入到酶标板孔中。显色液现配现用，A液、B液按体积50:1混匀，每孔加入200μL，置于37℃恒温箱，避光反应30min。反应结束后，将酶标板置于酶标仪中检测570nm处的吸收光值，绘制标准蛋白曲吸收光值标准曲线，根据拟合曲线公式计算待测样品的浓度。

(3)细胞表面免疫荧光法筛选阳性AIV杂交瘤细胞：

融合5～7天后使用细胞表面荧光吸附法筛选阳性杂交瘤细胞。轻轻吸走细胞培养板孔中上清，加入100μl不完全培养基轻轻洗涤，然后吸走培养基，重复操作，清洗两遍。每孔加入稀释至0.1mg/ml的Oleyl-PEG4000-NHS-AIV 100μl，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养1h。将试剂瓶置于4℃，搅拌过夜。重复第一步中清洗过程，洗涤两遍。加入稀释200倍的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，每孔100μl。置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养1h。重复第一步中清洗过程，洗涤两遍，加入100μl不完全培养基，然后将板置于荧光显微镜下，在激发状态观察。观察并标记绿色荧光团在板底位置。

半固体培养基法挑取阳性AIV杂交瘤细胞团。标记完阳性杂交瘤细胞团后，将细胞培养板移至超净工作台，移去培养基，加入100μl配置好的纤维素半固体培养基，然后用10μl枪头轻轻吸取标记位置的细胞团，移至预先加入HT培养基的细胞培养板中，作好记录。培养细胞3天左右，再次进行荧光染色操作，并结合半固体培养基法对细胞进行克隆，直至得到稳定的细胞株16株。通过间接ELISA检测挑选结果(具体过程如下)，获得特异性好的阳性细胞株11A11。

间接ELISA：

1)包被抗原：用包被液(pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液：Na₂CO₃ 1.5g、NaHCO₃ 2.9g加ddH₂O水800mL溶解，调pH9.6后加水至1000mL)将H5、H7N9、H9N2(哈尔滨维科生物有限公司)稀释至0.002mg/ml，分别加入酶标板孔中，每孔100μL，于冰箱4℃过夜(12h左右)，弃去包被液，用PBS-T洗板3次，每次3min；

2)封闭：配制5％(v/w)脱脂奶粉封闭，每孔300μL，置于37℃恒温箱孵育1h，弃去封闭液，用PBS-T洗板3次，每次3min；

3)一抗孵育：加入杂交瘤细胞上清，SP2/0细胞上清作为阴性对照，每孔加入100μL，置于37℃恒温箱孵育1h，弃去细胞上清，用PBS-T洗板3次，每次3min；

4)二抗孵育：用PBS-T将羊抗鼠IgG二抗稀释8000倍，每孔加入100μL，置于37℃恒温箱孵育45min，弃去二抗溶液，用PBS-T洗板5次，每次3min；

5)显色：加入显色液：A液(A液：将TMB粉溶于DMSO中使终浓度为11mg/ml，再加入1/10体积的甘油(全部避光操作，然后装入黑瓶避光4度保存))50μL/孔；B液(pH5.5、0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1moL/L柠檬酸缓冲液配制过氧化脲素浓度为0.74mg/mL的溶液)50μL/孔。室温避光反应10min；

6)终止：加入ELISA终止液(2％v/v硫酸)终止，每孔50μL；

7)检测：酶标仪，波长450nm处吸收值。

对抗原H5、H9N2亲和力低(OD值小)、H7N9亲和力强(OD值大)的细胞株为特异性好的细胞株。

(4)捕获抗体的制备：

1)选择8周龄以上的BALB/C小鼠，按照500μL/只的剂量，提前一周给小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，完成后轻柔小鼠腹部使其均匀分散。选择圆润光泽、状态好、间接ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞11A11。RPMI-1640洗涤一次，去除大部分死细胞；再加入一定体积的RPMI-1640轻轻吹起细胞，取定量悬液计算总细胞数，置于离心管中1000rpm离心7min，弃上清，RPMI-1640重悬细胞至1×10⁶个/mL。同样按照500μL/只的剂量给小鼠腹腔注射，轻柔腹部使细胞分布均匀，并做好标记。

2)小鼠接种细胞后7～10天腹部开始膨胀变大。当小鼠状态腹部明显胀大时，75％酒精对小鼠腹部周围进行消毒处理，用12号医用针头引流，手机腹水。继续饲养小鼠，隔天观察小鼠状态，若其腹部再次膨胀，可再次采集腹水。刚刚收集的腹水置于离心机中，4000rpm 4℃离心30min，取上清分装至-20℃保存。

3)腹水在4℃解冻后10000rpm 4℃离心15min，收集上清，并记录其体积。收集的上清液置于磁力搅拌器上冰水浴搅拌，缓慢滴加等体积的饱和硫酸铵溶液，持续搅拌15min后放入冰箱中4℃静置过夜。次日，10000rpm 4℃离心30min，弃上清，用2倍初始体积的PBS溶解沉淀，经0.2μm的滤膜过滤后进行下一步操作。经脱盐柱脱盐，Protein G亲和层析柱分离杂蛋白，由于收集洗脱下来的目标抗体体积过大，不适于保存，需经30KD超滤管浓缩抗体。收集超滤后的抗体11A11。制备完成11A11腹水型单抗作为捕获抗体，备用，并用双蒸水配成浓度为5mg/ml的11A11株抗体溶液。

(5)Oleyl-PEG4000-NHS与捕获抗体(Ab1)偶联和鉴定

1)Oleyl-PEG4000-NHS与Ab1偶联

称取2mg Oleyl-PEG4000-NHS(购于日本NF公司)溶于200μl PBS，得到Oleyl-PEG4000-NHS溶液。

取150μl Oleyl-PEG4000-NHS加入瓶中置于冰盒上搅拌；取250μl 5mg/ml 11A11株抗体溶液缓慢加入到上述溶液中，4℃搅拌过夜。30KD的超滤管超滤，得到Oleyl-PEG4000-NHS-11A11溶液。接着用0.22μm滤膜进行过滤除菌，置于4℃。

2)Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1的鉴定

将所得的工作液(即Oleyl-PEG4000-NHS-11A11溶液)通过SDS-PAGE、紫外可见分光扫描和进行鉴定。SDS-PAGE电泳鉴定如图1所示，泳道4为Oley-PEG4000-NHS-Ab1，条带相对泳道3滞后，证明偶联成功；紫外可见分光扫描鉴定如图2所示。

将所得的工作液用不完全培养基稀释至浓度为0.98mg/ml，加入SP2/0细胞100μL，37℃、5％CO₂孵育1h，不完全培养基洗两遍，加入100×FITC标记的羊抗鼠IgGFc(Solarbiolot No.20180522)孵育45min；对照组为SP2/0细胞100μL加入等体积不完全培养基。加入100×FITC标记的羊抗鼠IgGFc孵育45min；孵育结束，吸走上清，加入100μL不完全培养基清洗2次，最后加入100μL不完全培养基后，于荧光显微镜下，观察拍照。直接免疫荧光结果如图3所示。结果表明的确获得了Oleyl-PEG4000-NHS-11A11。

(6)分泌与11A11株抗体配对的单克隆抗体的杂交瘤细胞团的筛选

在进行实际挑选前，我们已对Oleyl-PEG4000-NHS-11A11工作浓度，羊抗鼠IgG(Fc)抗体工作浓度、封闭时间，抗原使用浓度，荧光二抗使用浓度进行了优化，下面操作均采用优化后的条件。

1)选择6周龄的BALB/C小鼠免疫，将H7亚型禽流感病毒(购于哈尔滨维科生物有限公司的禽流感标准检测抗原)，首次免疫：800μg，多点注射；加强免疫，600μg，多点注射；冲刺免疫：300μg，尾静脉注射，每次免疫中间间隔14天。小鼠取脾，将脾细胞与制备好的处于对数生长期的SP2/0细胞(购于上海细胞生物学研究所)按照6：1细胞比例混合，加入聚乙二醇(PEG-2000)使其融合，均匀铺到6块96孔细胞培养板培养，待融合后第5～6天开始检测。

2)加入100μl浓度为0.25mg/ml的Oleyl-PEG4000-NHS-11A11，置于细胞培养箱37℃、5％CO₂孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗两次。

3)加入100μl浓度为2mg/ml的羊抗鼠IgG FC(KPL公司，货号：5220-0341)封闭抗体，置于细胞培养箱37℃、5％CO₂孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗两次。

4)加入100μl 6mg/ml禽流感H7亚型抗原(哈尔滨维科生物科技有限公司)，置于细胞培养箱37℃、5％CO₂孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗两次(本实验使用的禽流感H7亚型抗原为禽流感标准检测抗原，有效成分很少，故使用浓度较高；使用该抗原，包板量为400ng/孔时与包被纯化后的抗原50ng/孔OD值相当，因而使用纯化较好的抗原可酌情减少使用量，可参考荧光二抗的加入量)。

5)加入100μL稀释100倍的FITC标记的羊抗鼠IgGFc(莱宝公司，货号：SF131)，置于细胞培养箱37℃、5％CO₂孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗1次。

6)加入150μl不完全培养基，用荧光显微镜观察可见光和荧光下的细胞团，并拍照做好阴阳性的标记，将产生荧光的细胞团标记为阳性克隆，不产生荧光的细胞团标记为阴性克隆。部分阳性克隆细胞团的拍照结果如图4所示。

7)将含有阳性细胞克隆的培养孔中上清去掉，加入100μl甲基纤维素半固体培养基，依据之前标记，用移液器吸取阳性标记细胞加入到新的细胞培养板中培养。

结果：筛选到5株杂交瘤细胞株，在荧光显微镜下能观测到细胞团被染上荧光，经ELISA检测，结果显示其分泌的抗体能与禽流感H7亚型抗原反应；将这5株杂交瘤细胞制备腹水(具体操作参考前述杂交瘤细胞株腹水的制备过程)并纯化，然后利用双抗夹心ELISA法将这5株抗体与捕获抗体11A11株分泌抗体进行配对，经验证，这5株抗体均与11A11株分泌抗体配对。

实施例2合适的抗体封闭剂和浓度的确定

(1)采用与实施例1中相同的方法，获得Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1(11A11)，以及杂交瘤细胞克隆。

(2)在杂交瘤细胞克隆中加入100μl 0.25mg/ml Oleyl-PEG4000-NHS-Ab1(11A11)，置于细胞培养箱37℃、5％CO₂孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗两次；A组：分别加入100μl 0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml羊抗鼠IgG FC封闭抗体，B组：分别加入100μl 0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml马血清封闭抗体，以未加入封闭剂的杂交瘤细胞克隆作为阳性对照组，置于细胞培养箱37℃、5％CO₂孵育60min，弃上清，用不完全培养基洗两次。用11A11株抗体做直接荧光免疫，A组、B组、对照组的直接免疫荧光结果分别如图5、6、7所示。

可见，选用羊抗鼠IgG FC作为封闭剂，浓度在1mg/ml以上时能达到封闭效果，在2mg/ml以上时封闭效果更佳；马血清不能达到封闭效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。