基于aav病毒的基因编辑表达盒

文档序号：1425598 发布日期：2020-03-17 浏览：15次 >En<

阅读说明：本技术 基于aav病毒的基因编辑表达盒 (AAV virus-based gene editing expression cassette ) 是由褚贝贝杨国宇王江刘忠虎汪新建钟凯鲁维飞郭豫杰于 2018-09-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因编辑领域。具体而言,本发明涉及基于AAV病毒的基因编辑表达盒。更具体而言,本发明涉及基于AAV病毒的基因编辑表达盒,以及包括所述表达盒的载体和利用所述表达盒或载体的基因编辑方法。(The present invention relates to the field of gene editing. In particular, the invention relates to AAV virus-based gene editing expression cassettes. More particularly, the present invention relates to AAV virus-based gene editing expression cassettes, as well as vectors comprising the expression cassettes and gene editing methods using the expression cassettes or vectors.)

基于AAV病毒的基因编辑表达盒

技术领域

本发明涉及基因编辑领域。具体而言，本发明涉及基于AAV病毒的基因编辑表达盒。更具体而言，本发明涉及基于AAV病毒的基因编辑表达盒，以及包括所述表达盒的载体和利用所述表达盒或载体的基因编辑方法。

背景技术

成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白9(CRISPR-associated proteins 9，Cas9)在基础生物学研究、生物化学、农业、医药业等领域成为一种革命性的工具(Barrangou etal.,CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science,2007,315(5819):1709-1712；Doudna and Charpentier,Genome editing.Thenew frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J].Science,2014,346(6213):1258096；Hsuet al.,Development and applications of CRISPR-Cas9forgenome engineering[J].Cell,2014,157(6):1262-1278；Van Der Oost et al.,Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems[J].NatRev Microbiol,2014,12(7):479-492；Barrangou and Doudna,Applications of CRISPRtechnologies in research and beyond[J].Nat Biotechnol,2016,34(9):933-941.)。它设计简单、操作便捷且成本较低，可用来切割或结合特定的DNA或RNA序列，逐渐成为基因编辑、基因调控、基因治疗等技术的标准应用程序。2012年Doudna等将CRISPR RNA(crRNA)与反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)连接并构建成单链向导RNA(singleguide RNA，sgRNA)载体，证实与Cas9一起可在体外切割DNA片段。只需要改变sgRNA中与目的基因互补的序列，就可以造成DNA双链的断裂(double-strand break，DSB)(Jinek etal.,A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity[J].Science,2012,337(6096):816-821.)。断开的DNA一般通过两条途径进行修复：主要是非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)，造成断开位置的随机***或缺失(Insertion or deletion，Indel)碱基(Lieber,The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway[J].AnnuRev Biochem,2010,79:181-211.)从而形成移码突变，进而造成基因敲除；另一条是同源重组修复途径(homology directed repair，HDR)，可利用带有同源臂的模板对切开位点进行特定修复(San Filippo et al.,Mechanism of eukaryotic homologous recombination[J].Annu Rev Biochem,2008,77:229-257.)，行使基因的***、缺失、突变等功能。2013年Zhang团队和Church团队同时发表了将CRISPR/Cas9系统用于真核细胞中进行基因组编辑，在基因研究中具有里程碑式的意义(Cong et al.,Multiplex genome engineering usingCRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-823；Mali P et al.,RNA-guidedhuman genome engineering via Cas9[J].Science,2013,339(6121):823-826.)。

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)载体被视为最有发展潜力的病毒载体，具有不整合到宿主基因组、免疫原性较低、无致病性等优点。但是其承载量较小(约4.7kb)，限制了其使用范围。来自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9(SaCas9)，它片段较小(约3159bp)，适合于装配到腺相关病毒载体中用于在体研究。现已有研究利用融合了AAV与SaCas9技术的pX601载体进行基因编辑，但该方法的基因编辑效率较低。且由于AAV较小的承载量，也使得其在病毒包装的时候不能在载体中进一步加入报告分子(报告基因)，使包装后的病毒感染情况检测不方便。

鉴于AAV介导的CRISPR/Cas9系统基因编辑在生物医药领域的广阔前景，有必要优化AAV载体。本发明通过构建新型重组载体，克服了上述问题。

发明概述

在一方面，本发明提供了一种表达盒，其包含分别位于表达盒5'端和3'端的两个反向末端重复(ITR)，以及位于两个反向末端重复之间的第一启动子、和与第一启动子可操作地连接的编码Cas9多肽的第一多核苷酸、及第二启动子、和与第二启动子可操作地连接的编码单向导RNA(sgRNA)的第二多核苷酸，其中所述表达盒的大小不超过4.3kb。

在一些实施方案中，所述Cas9多肽为如SEQ ID NO:7所示的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)，其任选地与核定位序列(NLS)连接。

在另一些实施方案中，所述sgRNA为SaCas9对应的sgRNA。

在另一些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子的大小总共不超过400bp、390bp、380bp、370bp、360bp、350bp、340bp、330bp、320bp、310bp、300bp或290bp。

在另一些实施方案中，所述第一启动子是RNA聚合酶II的启动子，其选自：EF1α启动子、CMV启动子、CBA启动子、hSynapsin启动子、HSV-TK启动子、SV40早期启动子和LSP启动子，优选EF1α启动子，更优选SEQ ID NO:5所示的EF1α启动子。

在另一些实施方案中，第二启动子是RNA聚合酶III启动子，其选自：U6启动子或tRNA编码序列，优选tRNA编码序列。所述tRNA编码序列是任何哺乳动物tRNA，包括但不限于Gln tRNA、Pro tRNA、Gly tRNA、Asn tRNA、Cys tRNA、Glu tRNA。

在本发明的优选实施方案中，tRNA编码序列是SEQ ID NO:4所示的Gln tRNA。

在另一些实施方案中，第二启动子是小鼠γ疱疹病毒-68(MHV68)RNA。

在另一些实施方案中，位于表达盒5’端的反向末端重复AAV2 ITR 5'序列如SEQID NO:2所示，位于表达盒3’端的反向末端重复AAV2 ITR 3'序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一些实施方案中，第一多核苷酸还与报告分子(报告基因)符合读码框地连接，所述报告分子(报告基因)大小不超过800bp、不超过790bp、不超过780bp、不超过770bp、不超过760bp、不超过750bp、不超过740bp、不超过730bp或不超过720bp。

在另一些实施方案中，所述报告分子(报告基因)选自EGFP、mCherry和NanoLuc。

在另一些实施方案中，本发明的表达盒从5'-3'方向按顺序包含AAV2 ITR 5'、EF1α启动子、与EF1α启动子可操作地连接的SaCas9表达序列、tRNA编码序列、与tRNA编码序列可操作地连接的SaCas9对应的sgRNA、以及AAV2 ITR 3'。

在另一些实施方案中，本发明的表达盒包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8或SEQID NO:9所示的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含本发明的表达盒。

在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒载体。

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的表达盒或本发明的重组载体。

在另一方面，本发明提供了一种基因编辑的方法，包括将本发明的表达盒或本发明的重组载体递送至细胞的步骤。

在另一方面，本发明提供了一种提高基因编辑效率的方法，包括将本发明的表达盒或本发明的重组载体递送至对象的细胞的步骤。

在一些实施方案中，sgRNA相对于野生型表达降低。

在另一些实施方案中，在重组载体或表达盒中存在两种或更多种gRNA，并且多于一种靶标序列被修饰。

具体实施方式

图1示出pX601(EF1α-tRNA)重组载体示意图。

图2示出含有荧光报告分子(报告基因)(EGFP和mCherry)的重组载体示意图。

图3示出T7核酸内切酶I检测HEK293T细胞中内源基因编辑结果。图3a中，U6表示以U6为sgRNA的启动子组；tRNA表示以tRNA为sgRNA的启动子组；C^-为阴性对照；M为50bp DNALadder，箭头指示切开的目的片段，图3b中，EGFP表示pX601(EF1α-tRNA)EGFP重组载体组；mCherry表示pX601(EF1α-tRNA)mCherry重组载体组；C^-为阴性对照；M为50bp DNA Ladder，箭头指示切开的目的片段。

图4示出TA克隆测序鉴定U6组和tRNA组基因编辑效率结果。U6组MSTN-sgRNA1位点TA克隆测序突变序列情况如a所示；tRNA组MSTN-sgRNA1位点TA克隆测序突变序列情况如b所示；U6组MSTN-sgRNA2位点TA克隆测序突变序列情况如c所示；tRNA组MSTN-sgRNA2位点TA克隆测序突变序列情况如d所示。短横线表示缺失碱基，下划线并加粗字母表示PAM序列。

图5示出TA克隆测序鉴定pX601(EF1α-tRNA)EGFP组和pX601(EF1α-tRNA)mCherry组基因编辑效率结果。a为pX601(EF1α-tRNA)EGFP组MSTN-sgRNA1位点TA克隆测序突变序列情况；b为pX601(EF1α-tRNA)mCherry组MSTN-sgRNA1位点TA测序突变序列情况；c为pX601(EF1α-tRNA)EGFP组MSTN-sgRNA2位点TA测序突变序列情况；d为pX601(EF1α-tRNA)mCherry组MSTN-sgRNA2位点TA测序突变序列情况。短横线表示缺失碱基，下划线并加粗字母表示PAM序列。

图6为TA克隆测序比对结果。其中pX601为pX601组TA克隆测序突变比例；pX601(tRNA)为pX601(tRNA)组TA克隆测序突变比例；pX601(EF1α-tRNA)EGFP为pX601(EF1α-tRNA)EGFP组TA克隆测序突变比例；pX601(EF1α-tRNA)mCherry为pX601(EF1α-tRNA)mCherry组TA克隆测序突变比例；U6为以U6为启动子组；tRNA为以tRNA为启动子组。

图7示出AAV-DJ介导的NIH3T3细胞中基因编辑效果。图7a和图7d为HBAAV-GFP攻毒7天后荧光及明场观察结果(200×)；图7b和图7e为pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sgRNA2攻毒7天后荧光及明场观察结果(200×)；图7c和图7f为pX601-EGFP-mPcsk9-sgRNA2攻毒7天后荧光及明场观察结果(200×)；图7g为流式细胞仪检测绿色荧光百分比，其中C⁺为HBAAV-GFP组，1为pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组，2为pX601-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组；图7h为T7核酸内切酶I法检测结果，其中C^-为阴性对照组，1为pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组，2为pX601-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组，箭头指示切开的目的片段；图7i为图表说明各病毒滴度倍数及绿色荧光百分比倍数。

发明详述

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook等人,“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”(第2版),第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin,“Genes IV”，Oxford University Press,New York,(1990)；及Roitt等人,“Immunology”(第2版),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

在说明书中和权利要求中所使用的，指不同的结构或方法步骤的序数指示，比如第一、第二和第三，不应该被解释为指示任何具体的结构或步骤、或者这种结构或步骤的任何特定顺序或构型。在本文中描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除本文中另有指示，或者明显与上下文矛盾。

重组表达盒

在一方面，本发明提供了一种表达盒，其包含、或由以下组成、或基本上由以下组成：分别位于表达盒5'端和3'端的两个反向末端重复(ITR)，以及位于两个反向末端重复之间的第一启动子、和与第一启动子可操作地连接的编码Cas9多肽的第一多核苷酸、及第二启动子、和与第二启动子可操作地连接的编码单向导RNA(sgRNA)的第二多核苷酸，其中所述表达盒的大小不超过大约3.8kb、3.9kb、4.0kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb，优选不超过大约4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb，更优选不超过大约4.2kb、4.3kb、4.4kb，最优选不超过大约4.3kb。

在一些实施方案中，所述Cas9多肽为如SEQ ID NO:7所示的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)，其任选地与核定位序列(NLS)连接。

在另一些实施方案中，所述sgRNA为SaCas9对应的sgRNA。

在优选实施方案中，Cas9多肽为金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)，优选地，所述Cas9多肽后接转录终止信号PolyA。

如本文所用，术语“CRISPR”是指规律成簇间隔短回文重复，其构成的基因座家族通常由短的和高度保守的DNA重复组成，例如重复1-40次且至少部分回文结构的24-50个碱基对。重复序列通常是物种特异性的，并且通过恒定长度例如20-58个碱基对的可变序列间隔开。CRISPR基因座也可以编码一种或多种蛋白质和一种或多种不翻译成蛋白质的RNA。因此，“CRISPR-Cas”系统是与细菌或古细菌相同或衍生自细菌或古细菌并含有至少一个由CRISPR基因座编码或衍生的Cas蛋白的系统。

如本文所用，缩写“Cas”是指CRISPR相关部分，例如来自II型系统的蛋白质如Cas9或其衍生物。

如本文所用，术语“Cas9多肽”、“Cas9核酸酶”或“Cas9酶”可以互换地使用，通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶。Cas9多肽可以通过与向导RNA(如人工gRNA(如sgRNA))一起相互作用来识别和/或切割靶核酸结构。“Cas9多肽”的实例包括Cas9核酸酶或其变体。所述Cas9核酸酶可以是来自不同物种的Cas9核酸酶，例如来自葡萄球菌属(Staphylococcus)。

在本发明的实施方案中，可使用衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的SaCas9(如SEQ ID NO:7所示)及其变体，以及衍生自金黄色葡萄球菌的CRISPR系统。每种Cas9多肽依赖于不同的识别位点或PAM，SaCas9的PAM是5'-NNGRRT-3'，其中N是任意核苷酸，R是嘌呤。每种具有不同的sgRNA支架序列，形成单向导RNA的3'部分。sgRNA的靶标序列特异性的5'部分的长度也同样在Cas9酶间不同，Sa使用18至24个核苷酸靶标序列。

所述Cas9核酸酶变体的实例包括但不限于Cas9核酸酶的高特异性变体，例如PCT/US2016/049147、PCT/US2016/020756等描述的SaCas9核酸酶变体。

在CRISPR系统中，Cas9酶通过sgRNA被引导切割DNA靶标序列。sgRNA至少包括具有两种功能的两个部分。第一部分是sgRNA的靶向部分，相对于第二部分，其在sgRNA的5'端。sgRNA的第一部分与靶标序列的链互补。靶标序列紧接靶标DNA上Cas9的PAM序列5'。与靶标序列互补的sgRNA部分的长度可以在10个核苷酸、13个核苷酸、15个核苷酸、18个核苷酸、20个核苷酸、22个核苷酸或24个核苷酸之间，或者在10至30之间的任意数目的核苷酸。与靶标序列互补的sgRNA部分应该能够与在靶标链中的序列杂交，并且最佳地完全与靶标序列互补。sgRNA的互补部分的准确长度和定位取决于与其配对的Cas9酶。选择的Cas9酶需要sgRNA经过设计从而特异性地用于该酶，并且控制sgRNA的设计。

本发明可用的其他一些“Cas9多肽”可见于例如http://www.addgene.org/crispr/guide/。

如本文所用，“gRNA”和“向导RNA”、“sgRNA”和“单向导RNA”可互换使用，指的是能够与Cas9多肽形成复合物并由于与靶序列具有一定互补性而能够将所述复合物靶向靶序列的RNA分子。例如，在基于Cas9的基因编辑系统中，gRNA通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性地结合的序列。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。基于所使用的Cas9多肽和待编辑的靶序列设计合适的gRNA序列属于本领域技术人员的能力范围内。

如本文所用，术语“重组”表达盒或载体指存在彼此天然不相关的两种或多种核酸区域。在本发明中，重组表达盒或重组载体可分别与表达盒或表达载体互换地使用。

如本文所用，术语“可操作地连接”描述调控元件和基因或其编码区之间的连接。即，通常基因表达位于某种调控元件的控制下，例如不限于组成型或诱导型启动子、组织特异性调控元件和增强子。称基因或编码区域与调控元件“可操作地连接”，意思是基因或编码区域受调控元件的控制或影响。在本发明中，调控元件包括启动子、增强子、反式激活因子等。

在另一些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子的大小总共不超过400bp、390bp、380bp、370bp、360bp、350bp、340bp、330bp、320bp、310bp、300bp或290bp，优选不超过350bp、340bp、330bp、320bp、310bp、300bp或290bp，更优选不超过320bp、310bp、300bp或290bp，甚至更优选不超过300bp。

在另一些实施方案中，所述第一启动子是RNA聚合酶II的启动子，其选自：EF1α启动子、CMV启动子、CBA启动子、hSynapsin启动子、HSV-TK启动子、SV40早期启动子和LSP启动子，优选不超过580bp的启动子，更优选EF1α启动子，甚至更优选SEQ ID NO:5所示的EF1α启动子。

在另一些实施方案中，第二启动子是RNA聚合酶III启动子，其选自：U6启动子或tRNA编码序列，优选不超过240bp的启动子，更优选优选tRNA编码序列。所述tRNA编码序列是任何哺乳动物tRNA，包括但不限于Gln tRNA、Pro tRNA、Gly tRNA、Asn tRNA、Cys tRNA、Glu tRNA。在本发明的优选实施方案中，tRNA编码序列是SEQ ID NO:4所示的Gln tRNA。在另一些实施方案中，第二启动子是小鼠γ疱疹病毒-68(MHV68)RNA。

如本文所用，术语“启动子”包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列，以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个聚合酶III启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个聚合酶III启动子)、一个或多个聚合酶II启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个聚合酶II启动子)、一个或多个聚合酶I启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个聚合酶I启动子)、或其组合。聚合酶III启动子的实例包括但不限于U6启动子和tRNA编码序列。聚合酶II启动子的实例包括但不限于EF1α启动子、CMV启动子(任选地具有CMV增强子)、CBA启动子、hSynapsin启动子、HSV-TK启动子、SV40早期启动子和LSP启动子。

在本发明的实施方案中，优选片段小于U6启动子的聚合酶III启动子，包括但不限于tRNA编码序列；优选片段小于CMV启动子的聚合酶II启动子，包括但不限于EF1α启动子。任选的，本发明可利用其他较短的元件，如polyA尾等。

如本文所用，术语“tRNA”和“tRNA编码序列”可以互换地使用，是指存在于野生型tRNA编码基因中的非常短的约70bp长的依赖于RNA聚合酶III的启动子，其能够表达高水平的功能性sgRNA。如本领域技术人员已知的，tRNA转录所需的启动子位于转录起始位点下游的转录区内，因此也称为下游启动子(downwtream promoter)或内部启动子(internalpromoter)或称为内部控制区(internal contron regin，ICR)，其依赖于RNA聚合酶Ⅲ。tRNA内部启动子含有两个分开的box A和box B，且box A和box B之间的距离较宽，其中boxA相当于启动子作用，box B相当于增强子作用。TFⅢC结合box A和box B使TFⅢB依次结合在起始位点的近上游，TFⅢB结合起始位点并和TFⅢC相连，TFⅢB负责RNA聚合酶III结合的正确定位从而启动转录。因此本文所用的tRNA编码序列可以起到启动子的作用，并且可以表达至少2个全长sgRNA，留出>800bp的可用空间给Cas9转录和功能所需要的额外位点，例如依赖RNA聚合酶II的启动子、NLS、和poly(A)等，或者如本发明的实施方案所述，提供空间给报告分子。所述sgRNA特异性针对一系列的DNA标靶，并且也特异性针对比SpCas9更小的Cas9多肽，例如SaCas9。

以往的工作专注于使用U6启动子来驱动sgRNA转录。虽然非常有效，但是U6启动子约254bp长，并且因此两个U6启动子将需要超过AAV载体的整个包装容量的10％。因此期望鉴定比U6更小的、效果相同的RNA聚合酶III启动子。如本文所用，哺乳动物或病毒起源的tRNA能够驱动sgRNA的表达。本发明利用人tRNA编码序列用于表达高水平的sgRNA。在其他实施方案中，也可以使用病毒起源的tRNA编码序列。

将RNA聚合酶III启动子可操作地连接于单向导RNA(sgRNA)。在一个实施方案中，sgRNA包含与靶标DNA序列的正义链互补的5'部分和能够结合Cas9的保守的、结构化的3'末端。靶标DNA可以包含编码期望突变和/或缺失的基因的任何DNA序列。潜在的靶标序列必须恰好位于靶标DNA序列中被Cas9多肽识别的PAM序列的5'。表达盒可以仅包含一个与sgRNA可操作地连接的RNA聚合酶III启动子，或者在表达盒中可以包括两个或更多个RNA聚合酶III启动子-sgRNA组合。在单基因或靶标序列中，使用靶向两个靶标序列的两个或更多个sgRNA，足以修饰一个或更多个靶标序列。

tRNA编码序列的实例包括但不限于Gln tRNA、Pro tRNA、Gly tRNA、Asn tRNA、CystRNA、Glu tRNA、小鼠γ疱疹病毒-68(MHV68)RNA或任何哺乳动物tRNA(参见例如MefferdAL,et al.Expression of CRISPR/Cas single guide RNAs using small tRNApromoters[J].RNA,2015,21(9):1683-1689)。

如本文所用，“EF1α启动子”是衍生自pEF-BOS质粒(Mizushima和Nagata，1990)的约212bp的强哺乳动物表达启动子，其大小约为CMV启动子(584bp)的一半。EF1α启动子是组成型启动子，在细胞中表达水平十分稳定，与细胞类型无关。

在一些实施方案中，所述表达盒的反向末端重复在表达盒的两侧，用于在腺相关病毒(AAV)载体中包装。本领域技术人员可以根据本发明的精神和需要设计两个ITR之间的序列，优选不超过3700bp，更优选不超过3650bp，甚至更优选不超过3600bp。

在另一些实施方案中，位于表达盒5'端的AAV2反向末端重复(ITR)序列如SEQ IDNO:2所示，位于表达盒3'端的AAV2反向末端重复(ITR)序列如SEQ ID NO:3所示。

如本文所用，术语“反向末端重复”或“ITR”指因为它们的对称性这样命名的AAV病毒顺式元件。这些元件对于AAV基因组的高效扩增非常重要。假设ITR功能的不可缺少的最小限定元件为Rep-结合位点(RBS；对于AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3')和末端分辨位点(TRS；对于AAV2为5'-AGTTGG-3')加上允许形成发夹的可变回文序列。根据本发明，ITR包含至少这3个元件(RBS、TRS和允许形成发夹的序列)。此外，在本发明中，术语“ITR”指已知的天然AAV血清型的ITR(例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11AAV的ITR)、通过融合来源于不同血清型的ITR元件形成的嵌合ITR以及它们的功能变体。

在另一些实施方案中，所述报告分子(报告基因)选自EGFP、mCherry和NanoLuc。

如本文所用，将荧光报告分子(报告基因)掺入重组载体有助于检测病毒转导效率，以及病毒在体感染及分布情况，较为清晰的预测Cas9编辑效果。在本发明的实施方案中，由于AAV基因组大小的限制，优选较短的报告分子(报告基因)，包括但不限于EGFP、mCherry和NanoLuc等，更优选EGFP和mCherry。

在本发明的优选实施方案中，本发明的表达盒从5'-3'方向按顺序包含AAV2 ITR5'、EF1α启动子、与EF1α启动子可操作地连接的SaCas9表达序列、tRNA编码序列、与tRNA编码序列可操作地连接的SaCas9对应的sgRNA、以及AAV2 ITR 3'。

在另一些实施方案中，本发明的表达盒包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，本发明还提供了含有EGFP和mCherry的表达盒，其分别含有如SEQ ID NO:7和8所示的核苷酸序列。其中，N为特异性针对靶标序列的序列，本领域技术人员可以根据已知的技术和手段根据需要设计该特异性序列，其后接Sa sgRNA支架序列，如SEQ ID NO:6所示。

重组载体

在另一方面，本发明提供了一种重组载体，其包含本发明的表达盒、或由本发明的表达盒组成、或基本上由本发明的表达盒组成。

在一些实施方案中，所述载体是重组AAV载体。

如本文所用，术语“载体”指包括能够转移和/或运输核酸组合物至宿主细胞、进入宿主细胞和/或至宿主细胞中的特定位置的任何元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体(YAC或BAC)、病毒等。因此该术语包括克隆和表达工具，以及病毒和非病毒载体，和可能的裸的或组合的DNA。然而，该术语不包括产生基因转移载体的细胞，比如逆转录病毒包装细胞系。

对于本发明的目的，“重组病毒”、“重组载体”、或“重组病毒载体”指遗传上已经被改变的病毒，例如通过向颗粒添加或***异源性核酸组合物。在一些实施方案中，重组病毒包含AAV。因此例如“重组AAV病毒”与“重组AAV载体”也表达相同的意思。重组AAV载体包含至少一种AAV衣壳(“外壳”)，和包含在衣壳内的重组AAV(载体)基因组。

对于本发明的目的，“重组AAV基因组”或“重组AAV载体基因组”是指包含异源性序列的AAV基因组。通常，以异源性序列(例如表达盒)替换所有病毒基因的方式设计重组AAV基因组，仅保留完整的基因组必需的顺式元件，即反向末端重复(ITR)、DNA包装信号、和复制起点。可选地，基因组必需的顺式元件可以是那些如现有技术中描述的(Musatov等人，Acis-acting element that directs circular adeno-associated virus replicationand packaging，J Virol.December 2002；76(24):12792-802)。重组AAV基因组是重组AAV载体的一部分。

可以将本发明的表达盒通过本领域技术人员已知的方法直接引入待编辑的细胞中，例如将本发明的表达盒与质粒连接，或通过脂质体将本发明的表达盒直接转染细胞。可选地，可以将本发明的表达盒包装进载体中再转染细胞。

AAV载体的优势在于它们通常能够浓缩至每毫升≥10¹⁴病毒颗粒的滴度，这是具有转导所有病毒感染的细胞的潜力的载体水平。此外，基于AAV的载体具有已确立的安全性记录，不以显著的水平整合入靶标细胞基因组中，因此避免了有害基因的***激活的可能。

将本发明的表达盒掺入AAV病毒载体的技术和手段是本领域技术人员熟知的。如本发明所用，通过与包装质粒和辅助质粒共转染，将含有本发明的表达盒的质粒包装进入AAV病毒，以获得重组AAV病毒。

试剂盒

在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的表达盒和重组载体。

试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

基因编辑的方法

在另一方面，本发明提供了一种基因编辑的方法，包括将本发明的表达盒或本发明的重组载体递送至对象的细胞的步骤。在本发明的实施例中，使用本发明的方法可以将基因编辑效率提高2倍。

使用标准的转染技术将重组载体引入细胞中。将分子(如质粒或病毒)引入细胞中还可以使用本领域技术人员已知的其他技术完成，例如磷酸钙转染或电穿孔。

令人惊奇的是，虽然基因编辑效率提高2倍，但是在一些实施方案中，sgRNA相对于野生型表达降低。

如本文所用，术语“对象”是指人和非人动物。本公开的术语“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，比如非人灵长类、羊、狗、猫、马、牛、鼠、鸡、两栖动物、爬行动物等。

如本文所用，术语“引入”或“递送”指将用于重组蛋白或核苷酸表达的本发明的质粒或载体递送至细胞或者递送至对象的细胞和/或组织和/或器官。这样的引入或递送可以在体内、体外或离体进行。可以通过以下方式将用于重组蛋白或多肽表达的质粒引入细胞：转染，这通常表示通过化学方法将异源DNA***细胞(例如，磷酸钙转染、聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体转染)；物理方法(电穿孔或显微注射)；感染，这通常指通过感染性物质，即病毒引入；或者转导，这在微生物学中指用病毒稳定感染细胞，或者通过病毒性物质(例如，噬菌体)将遗传物质从一种微生物转移至另一种微生物。用于重组多肽、蛋白或寡核苷酸表达的本发明的载体可以通过物理方式递送(例如，磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂质体转染)，或者通过与药学可接受的载体(carrier)一起制备本发明的载体用于体外、离体或体内递送至细胞、组织、器官或对象。

实施例

在此描述的实施例是用于说明的目的，并不意在限制本发明的范围，本领域技术人员可以根据本发明的精神和教导对具体步骤进行修改。除非另有规定或从内容明显看出，否则所记载的与一些实施方案有关的任何特征可以与任何其他实施方案来结合使用。

实施例1构建pX601(EF1α-tRNA)载体

1.1构建pX601(tRNA)载体

本发明使用Gln tRNA编码序列(SEQ ID NO:4)作为第二启动子，所述编码序列由上海生工公司合成tRNA-SP质粒，将其作为模板(10ng/体系)，以引物：

PA-tRNA-F:

5’-AGGCATGCTGGGGAGGTACCGGTTCCATGGTGTAATGGTT-3′和

tRNA(SpCas)(VB)-R:

5′-ACAGGTCTTCTCGAAGACCCAGGTTCCACCGAGATTTGAA-3′

进行PCR扩增；

同时，以pX601质粒(购自Addgene，质粒编号61591)为模板(10ng/体系)，以引物：

tRNA(SpCas)-F:

5′-CTGGGTCTTCGAGAAGACCT-3′和

Scaf-ITR-R:

5′-CTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3′

分别用Q5 DNA聚合酶进行PCR扩增，扩增结束后，各加入Dpn I 1μL，37℃孵育30min消化质粒模板。孵育结束后，1％琼脂糖凝胶120V电泳25min，并胶回收所得目的条带，获得tRNA扩增片段和SaCas9 sgRNA支架扩增片段。

以所得tRNA扩增片段和SaCas9 sgRNA支架扩增片段各1μL为模板(各10ng)，以引物：

PA-tRNA-F:

5′-AGGCATGCTGGGGAGGTACCGGTTCCATGGTGTAATGGTT-3′和

Scaf-ITR-R:

5′-CTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAAAAAAATCTCGCCAACAAGTTG-3′

用Q5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，各加入Dpn I 1μL，37℃孵育30min消化质粒模板。孵育结束后，1％琼脂糖凝胶120V电泳25min，并胶回收所得目的条带，获得tRNA-SaCas9 sgRNA支架扩增连接片段。

以Kpn I和Not I各1μL酶切pX601质粒(1μg)，在PCR仪中，37℃孵育30min。结束后，1％琼脂糖凝胶120V电泳25min，并胶回收所得目的条带，获得pX601经Kpn I/Not I双酶切片段。

将tRNA-SaCas9 sgRNA支架片段和pX601经Kpn I/Not I双酶切片段通过

II One Step Cloning试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)按照生产商的说明书进行连接。37℃孵育30min后，立即冰中＞5min，转化进入XL10-gold感受态细胞，37℃培养过夜后，挑取单菌落摇菌并送测序鉴定，鉴定正确的样品命名为pX601(tRNA)。

1.2构建pX601(EF1α-tRNA)载体

以pLentiCRISPR V2质粒(购自Addgene，质粒编号52961)(10ng/体系)为模板，以引物：

pX601(EF1α)-F:

5′-CCTGCGGCCTCTAGACTCGAGGTGGGCAGAGCGCACATCGC-3′和

EF1α-R:

5′-TGGGGCCATGGTGGCACCGGTCCTGTGTTCTGGCGGCAAAC-3′

进行PCR扩增EF1α启动子序列，扩增结束后，用Dpn I消化质粒模板，方法同1.1，获得EF1α扩增片段。

以Xho I/Age I酶切pX601(tRNA)质粒，获得pX601(tRNA)经Xho I/Age I双酶切片段。

将EF1α扩增片段和pX601(tRNA)经Xho I/Age I双酶切片段以

IIOne Step Cloning试剂盒按照生产商的说明书进行连接。37℃孵育30min后，立即冰中＞5min，转化进入XL10-gold感受态细胞，37℃培养过夜后，挑取单菌落摇菌并送测序鉴定，鉴定阳性样品命名为pX601(EF1α-tRNA)，所得载体结构示意图如图1所示。

实施例2构建含有荧光报告分子的重组载体

将pX601以及pX601(EF1α-tRNA)中的SaCas9后面***荧光报告分子EGFP和mCherry，中间以自剪切肽相连。

首先，以Human MSTN-Insert质粒(10ng/体系)为模板，以引物：

pX601-EGFP-F:

5′-GCAAAAAAGAAAAAGGGATCCGCCACGAACTTCTCTCTGT-3′和

pX601-EGFP-R:

5′-ATCAGCGAGCTCTAGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′进行PCR扩增得到P2A-EGFP片段；

以42230-T2A-mCherry质粒(10ng/体系)为模板，以引物：

pX601-mCherry-F:

5′-GCAAAAAAGAAAAAGGGATCCGAGGGCAGAGGAAGCCTTCT-3′和

pX601-mCherry-R:

5′-ATCAGCGAGCTCTAGGAATTCCTACTTGTACAGCTCGTCCA-3′进行PCR扩增得到T2A-mCherry片段。扩增结束后，用Dpn I消化质粒模板，方法同实施例1。

以BamHI和EcoRI酶切pX601(EF1α-tRNA)和pX601，获得pX601(EF1α-tRNA)质粒经BamH I/EcoR I双酶切片段和pX601质粒经BamH I/EcoR I双酶切片段。

将P2A-EGFP和T2A-mCherry片段分别与pX601(EF1α-tRNA)质粒经BamH I/EcoR I双酶切片段和pX601质粒经BamH I/EcoR I双酶切片段按照

II One StepCloning试剂盒说明书进行连接，获得载体pX601(EF1α-tRNA)-EGFP和pX601(EF1α-tRNA)-mCherry，其结构示意图分别如图2a和图2b所示，以及pX601-EGFP和pX601-mCherry，其结构示意图分别如图2c和图2d所示。

实施例3构建和使用靶向靶标基因的重组载体

3.1设计和构建重组载体

按照SaCas9的sgRNA设计原则，设计针对人内源基因MSTN的2个sgRNA位点，命名为：MSTN-sgRNA1、MSTN-sgRNA2，设计针对小鼠内源基因Pcsk9的sgRNA位点，命名为：mPcsk9-sg2。分别设计适合于tRNA和U6为启动子的粘性末端引物及检测引物，序列如表1所示：

表1

将引物加水溶解至100μM，分别将每对引物(各2μL)进行退火杂交。

将pX601、pX601-EGFP、pX601(tRNA)、pX601(EF1α-tRNA)-EGFP和pX601(EF1α-tRNA)-mCherry分别以Bsa I和BbsI进行酶切。

将所得杂交引物分别与所得酶切片段进行连接，16℃连接5h。转化进入XL10-gold感受态细胞，37℃培养过夜后，挑取单菌落摇菌并送测序鉴定，将测序正确的样品用QIAGEN质粒中提试剂盒(批号：15704753)按照生产商说明书进行中提质粒，获得以下重组质粒载体：

pX601-MSTN-sgRNA1、pX601-MSTN-sgRNA2、

pX601(tRNA)-MSTN-sgRNA1、pX601(tRNA)-MSTN-sgRNA2、

pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-MSTN-sgRNA1、

pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-MSTN-sgRNA2、

pX601(EF1α-tRNA)-mCherry-MSTN-sgRNA1、

pX601(EF1α-tRNA)-mCherry-MSTN-sgRNA2、

pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sgRNA2和

pX601-EGFP-mPcsk9-sgRNA2。

3.2细胞转染

转染前一天，将HEK293T细胞按2×10⁵个细胞/孔轻轻加入24孔板中。将50μL DMEM培养基、2μg质粒和4μL TurboFect(购自Thermo scientific，批号00448764)充分混匀后，室温静置15-20min，按所需量加入各孔中。轻轻晃动24孔板混匀。放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂条件下培养。转染8h后，吸弃废液，各加1mL 10％胎牛血清培养液继续培养。

转染72h后，用细胞/细菌/酵母基因组小量提取试剂盒(上海莱枫，批号：J0301)，按照生产商说明书提取基因组DNA。

3.3 T7核酸内切酶I法检测基因编辑效果

以200ng基因组DNA为模板，以各sgRNA位点检测引物，用Q5高保真DNA聚合酶扩增，PCR结束后，再各加入1μL rTaq酶，37℃孵育30min。1％琼脂糖凝胶电泳，并胶回收所得目的条带。

将200ng所得PCR产物分别加入含有NEbuffer 2的管中，并设置未用质粒转染的HEK293T细胞基因组为阴性对照(C^-)。在PCR仪中进行加热变性、退火复性处理，结束后，每管加入0.4μL T7核酸内切酶I，37℃孵育1h。

各样品中加入2μL 6×Loadding Buffer，PAGE变性胶电泳110V，50min。电泳结束后，SYBR Green I染色1h，凝胶成像系统拍照(图3a、3b)。

T7核酸内切酶I识别并切割带有切割位点的产物。箭头所指为含有突变的DNA。以ImageJ软件分析同泳道内各条带(a为PCR扩增片段，b、c为T7核酸内切酶I酶切出的目的条带)灰度值，通过公式(b+c)/(a+b+c)计算Indel比例。

从图3a可知，以U6为sgRNA启动子(即pX601载体)的Indel比例均为36％，以tRNA为sgRNA启动子(即pX601(EF1α-tRNA)重组载体)的Indel比例分别为29％和30％，表明以tRNA代替U6启动子成功地靶向靶标基因并进行切割。通过图3b可知，pX601(EF1α-tRNA)-EGFP重组载体的Indel比例分别为30％和18％，pX601(EF1α-tRNA)-mCherry重组载体的Indel比例均为27％，表明添加荧光报告分子的载体可以有效地切割靶标基因。

3.4 TA克隆测序检测基因编辑效果

pMD19-T是本领域技术人员已知的一种T载体，其是一种高效克隆PCR产物(TA克隆)的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。

将3.3所得退火复性PCR产物与pMD19-T连接，4℃连接过夜。转化进入Top10感受态细胞，预先在LB(Amp⁺，100μg/mL)板中加入IPTG 10μL和X-gal 30μL，37℃培养过夜后，挑取白色菌落摇菌并送测序鉴定，鉴定结果如图4-c所示。

通过更精确的测序检测，各重组载体的基因编辑的效率结果如图4和5所示，表明用tRNA代替U6启动子明显提高基因编辑效率，并且添加荧光报告分子的载体也可以有效地编辑靶标基因。将上述结果统计归纳如图6所示，无论有无添加荧光报告分子，用tRNA代替U6启动子均可明显提高突变比例。

实施例4 AAV病毒介导的基因编辑

4.1 AAV病毒包装

1、细胞转染

转染前一天，将AAV-293细胞按每皿4×10⁶个细胞/孔轻轻加入100mm平皿中，细胞密度长至70-90％即可进行转染，转染体系如下：

转染后6h更换含新鲜的10％胎牛血清培养液。

2、细胞收集

转染后72h，收集细胞液，并将含AAV颗粒的细胞用细胞刮刀轻轻刮下，收集于15mL离心管中，150×g离心3min收集细胞，去除上清，用PBS洗一次，最后再用300μL PBS重悬细胞。

3、细胞破碎

准备37℃恒温水浴锅和液氮，将装有细胞的离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。4℃，2000×g离心5min，收集含AAV病毒颗粒的上清。

4、核酸酶处理

每1mL病毒粗提物中加入0.1μL Benonase酶，37℃水浴1h，除去病毒液中的RNA、细胞基因组及残留的质粒DNA。4℃，600×g离心10min，取上清。

5、柱纯化

用腺相关病毒纯化试剂盒(购自Biomiga，批号1369011804250101)对AAV病毒粗提物进行纯化，具体操作步骤如下：

a.将首次收集的细胞液和2所得液体经0.45μm滤器过滤；

b.滤液移入超滤管中，4℃，3000rpm离心20min，直至剩余约300μL病毒液；

c.将病毒液移入1.5mL EP管中，加100μL Buffer S到超滤管中洗一次，吸出并与病毒液混匀；

d.准备纯化柱：上下颠倒以混匀纯化柱中填料，放入50mL离心管中，4℃，1000rpm离心2min。撕掉底部并拧松顶帽，让Buffer流出。液体完全流出后，再加入4mL Buffer S，在重力作用下使其流出。

e.将c所得病毒液移入准备好的纯化柱中

f.加入4mL Buffer S，在重力作用下使其流出，收集流穿液。

6、将柱纯化得到的流穿液，加入到超滤管中，1400×g离心30min，得到约200μL浓缩病毒液。分装后，于-80℃保存。

7、病毒滴度测定(qPCR法)

a.引物设计

设计引物：

正向引物：5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′和

反向引物：5′-AGGAACCCCTAGTGATG-3′，由上海生工公司合成。

b.AAV病毒样品预处理

以DNase I及蛋白酶K处理AAV病毒，体系如下：

37℃孵育1h后，于100℃孵育10min。各加入2μL蛋白酶K，55℃孵育1h后，然后，于100℃孵育10min。

c.稀释标准品质粒

首先用微量紫外分光光度计测定标准品浓度，参考其原始浓度，用ddH₂O将标准品稀释成5个梯度：10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹。

d.qPCR检测

以qPCR方法测定标准质粒以及预处理的AAV病毒样品的拷贝数。

e.滴度计算

以标准品Ct值为纵坐标Y，拷贝数为横坐标X，做标准曲线，得到标准曲线的函数公式及R平方值。

将AAV样品Ct均值，代入标准曲线所得公式，计算所加入AAV模板拷贝数X，再换算成滴度。换算公式为：AAV病毒滴度＝10^x×40000(稀释倍数)vg/mL。

计算得到pX601-EGFP-mPcsk9-sg2和pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sg2所包装的病毒滴度分别为1.2×10¹²vg/mL和1.1×10¹²vg/mL。

4.2 AAV-DJ病毒介导的基因编辑检测

1、AAV病毒转导细胞

转染前一天，NIH3T3细胞按每孔2.5×10⁵个细胞/孔轻轻加入12孔板中。以MOI＝10⁵，按公式：

病毒量＝(转染时细胞数×MOI)/病毒滴度，计算需要加入的病毒体积数。

根据计算好的各组病毒量，加入到0.5mL 10％胎牛血清培养液中，分别加入到各孔NIH3T3细胞，每组三个重复。4h后再加入0.5mL 10％胎牛血清培养液，24h换新鲜培液。

2、AAV-DJ病毒介导的基因编辑检测

AAV-DJ病毒是常见的AAV血清型，AAV-DJ血清型对视网膜、肝脏、肺、肾脏具有亲噬性，其含有衍生自8个血清型的杂交衣壳。

用pX601-EGFP-mPcsk9-sg2和pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sg2所包装的病毒以及含有CMV启动子的对照GFP病毒HBAAV-GFP转导细胞，7天后，所得细胞的荧光成像如图7a-f所示，量化该荧光结果，得到如图7g所示的流式细胞仪检测绿色荧光百分比，其中C⁺为HBAAV-GFP组，1为pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组，2为pX601-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组；图7h为T7核酸内切酶I法检测结果，其中C^-为阴性对照组，1为pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组，2为pX601-EGFP-mPcsk9-sgRNA2组，箭头指示切开的目的片段，表明pX601(EF1α-tRNA)-EGFP-mPcsk9-sg2的效率显著高于pX601-EGFP-mPcsk9-sg2的效率。并且以T7核酸内切酶I法进行基因编辑效果检测，所得结果总结于图7i，显示出用tRNA和EF1α启动子分别代替原先的U6启动子和CMV启动子能够显著提高AAV-DJ病毒介导的基因编辑效率，达到原先的2倍。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 基于AAV病毒的基因编辑表达盒

<130> TC2267

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4284

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pX601(EF1a-tRNA)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4037)..(4054)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gactcgaggt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg 180

agaagttggg gggaggggtc ggcaattgat ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa 240

actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt 300

atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac 360

aggaccggtg ccaccatggc cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca 420

gcagccaagc ggaactacat cctgggcctg gacatcggca tcaccagcgt gggctacggc 480

atcatcgact acgagacacg ggacgtgatc gatgccggcg tgcggctgtt caaagaggcc 540

aacgtggaaa acaacgaggg caggcggagc aagagaggcg ccagaaggct gaagcggcgg 600

aggcggcata gaatccagag agtgaagaag ctgctgttcg actacaacct gctgaccgac 660

cacagcgagc tgagcggcat caacccctac gaggccagag tgaagggcct gagccagaag 720

ctgagcgagg aagagttctc tgccgccctg ctgcacctgg ccaagagaag aggcgtgcac 780

aacgtgaacg aggtggaaga ggacaccggc aacgagctgt ccaccaaaga gcagatcagc 840

cggaacagca aggccctgga agagaaatac gtggccgaac tgcagctgga acggctgaag 900

aaagacggcg aagtgcgggg cagcatcaac agattcaaga ccagcgacta cgtgaaagaa 960

gccaaacagc tgctgaaggt gcagaaggcc taccaccagc tggaccagag cttcatcgac 1020

acctacatcg acctgctgga aacccggcgg acctactatg agggacctgg cgagggcagc 1080

cccttcggct ggaaggacat caaagaatgg tacgagatgc tgatgggcca ctgcacctac 1140

ttccccgagg aactgcggag cgtgaagtac gcctacaacg ccgacctgta caacgccctg 1200

aacgacctga acaatctcgt gatcaccagg gacgagaacg agaagctgga atattacgag 1260

aagttccaga tcatcgagaa cgtgttcaag cagaagaaga agcccaccct gaagcagatc 1320

gccaaagaaa tcctcgtgaa cgaagaggat attaagggct acagagtgac cagcaccggc 1380

aagcccgagt tcaccaacct gaaggtgtac cacgacatca aggacattac cgcccggaaa 1440

gagattattg agaacgccga gctgctggat cagattgcca agatcctgac catctaccag 1500

agcagcgagg acatccagga agaactgacc aatctgaact ccgagctgac ccaggaagag 1560

atcgagcaga tctctaatct gaagggctat accggcaccc acaacctgag cctgaaggcc 1620

atcaacctga tcctggacga gctgtggcac accaacgaca accagatcgc tatcttcaac 1680

cggctgaagc tggtgcccaa gaaggtggac ctgtcccagc agaaagagat ccccaccacc 1740

ctggtggacg acttcatcct gagccccgtc gtgaagagaa gcttcatcca gagcatcaaa 1800

gtgatcaacg ccatcatcaa gaagtacggc ctgcccaacg acatcattat cgagctggcc 1860

cgcgagaaga actccaagga cgcccagaaa atgatcaacg agatgcagaa gcggaaccgg 1920

cagaccaacg agcggatcga ggaaatcatc cggaccaccg gcaaagagaa cgccaagtac 1980

ctgatcgaga agatcaagct gcacgacatg caggaaggca agtgcctgta cagcctggaa 2040

gccatccctc tggaagatct gctgaacaac cccttcaact atgaggtgga ccacatcatc 2100

cccagaagcg tgtccttcga caacagcttc aacaacaagg tgctcgtgaa gcaggaagaa 2160

aacagcaaga agggcaaccg gaccccattc cagtacctga gcagcagcga cagcaagatc 2220

agctacgaaa ccttcaagaa gcacatcctg aatctggcca agggcaaggg cagaatcagc 2280

aagaccaaga aagagtatct gctggaagaa cgggacatca acaggttctc cgtgcagaaa 2340

gacttcatca accggaacct ggtggatacc agatacgcca ccagaggcct gatgaacctg 2400

ctgcggagct acttcagagt gaacaacctg gacgtgaaag tgaagtccat caatggcggc 2460

ttcaccagct ttctgcggcg gaagtggaag tttaagaaag agcggaacaa ggggtacaag 2520

caccacgccg aggacgccct gatcattgcc aacgccgatt tcatcttcaa agagtggaag 2580

aaactggaca aggccaaaaa agtgatggaa aaccagatgt tcgaggaaaa gcaggccgag 2640

agcatgcccg agatcgaaac cgagcaggag tacaaagaga tcttcatcac cccccaccag 2700

atcaagcaca ttaaggactt caaggactac aagtacagcc accgggtgga caagaagcct 2760

aatagagagc tgattaacga caccctgtac tccacccgga aggacgacaa gggcaacacc 2820

ctgatcgtga acaatctgaa cggcctgtac gacaaggaca atgacaagct gaaaaagctg 2880

atcaacaaga gccccgaaaa gctgctgatg taccaccacg acccccagac ctaccagaaa 2940

ctgaagctga ttatggaaca gtacggcgac gagaagaatc ccctgtacaa gtactacgag 3000

gaaaccggga actacctgac caagtactcc aaaaaggaca acggccccgt gatcaagaag 3060

attaagtatt acggcaacaa actgaacgcc catctggaca tcaccgacga ctaccccaac 3120

agcagaaaca aggtcgtgaa gctgtccctg aagccctaca gattcgacgt gtacctggac 3180

aatggcgtgt acaagttcgt gaccgtgaag aatctggatg tgatcaaaaa agaaaactac 3240

tacgaagtga atagcaagtg ctatgaggaa gctaagaagc tgaagaagat cagcaaccag 3300

gccgagttta tcgcctcctt ctacaacaac gatctgatca agatcaacgg cgagctgtat 3360

agagtgatcg gcgtgaacaa cgacctgctg aaccggatcg aagtgaacat gatcgacatc 3420

acctaccgcg agtacctgga aaacatgaac gacaagaggc cccccaggat cattaagaca 3480

atcgcctcca agacccagag cattaagaag tacagcacag acattctggg caacctgtat 3540

gaagtgaaat ctaagaagca ccctcagatc atcaaaaagg gcaaaaggcc ggcggccacg 3600

aaaaaggccg gccaggcaaa aaagaaaaag ggatcctacc catacgatgt tccagattac 3660

gcttacccat acgatgttcc agattacgct tacccatacg atgttccaga ttacgcttaa 3720

gaattcctag agctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 3780

tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 3840

aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 3900

gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagg 3960

taccggttcc atggtgtaat ggttagcact ctggactctg aatccagcga tccgagttca 4020

aatctcggtg gaacctnnnn nnnnnnnnnn nnnngtttta gtactctgga aacagaatct 4080

actaaaacaa ggcaaaatgc cgtgtttatc tcgtcaactt gttggcgaga tttttgcggc 4140

cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg 4200

aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 4260

agcgagcgcg cagctgcctg cagg 4284

<210> 2

<211> 130

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV2-ITR 5′

<400> 2

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 3

<211> 141

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AAV2-ITR 3′

<400> 3

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> tRNA 编码序列

<400> 4

ggttccatgg tgtaatggtt agcactctgg actctgaatc cagcgatccg agttcaaatc 60

tcggtggaac ct 72

<210> 5

<211> 212

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EF1α启动子

<400> 5

gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgat 60

ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120

gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180

tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212

<210> 6

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sgRNA支架

<400> 6

gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 60

caacttgttg gcgaga 76

<210> 7

<211> 3156

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SaCas9

<400> 7

aagcggaact acatcctggg cctggacatc ggcatcacca gcgtgggcta cggcatcatc 60

gactacgaga cacgggacgt gatcgatgcc ggcgtgcggc tgttcaaaga ggccaacgtg 120

gaaaacaacg agggcaggcg gagcaagaga ggcgccagaa ggctgaagcg gcggaggcgg 180

catagaatcc agagagtgaa gaagctgctg ttcgactaca acctgctgac cgaccacagc 240

gagctgagcg gcatcaaccc ctacgaggcc agagtgaagg gcctgagcca gaagctgagc 300

gaggaagagt tctctgccgc cctgctgcac ctggccaaga gaagaggcgt gcacaacgtg 360

aacgaggtgg aagaggacac cggcaacgag ctgtccacca aagagcagat cagccggaac 420

agcaaggccc tggaagagaa atacgtggcc gaactgcagc tggaacggct gaagaaagac 480

ggcgaagtgc ggggcagcat caacagattc aagaccagcg actacgtgaa agaagccaaa 540

cagctgctga aggtgcagaa ggcctaccac cagctggacc agagcttcat cgacacctac 600

atcgacctgc tggaaacccg gcggacctac tatgagggac ctggcgaggg cagccccttc 660

ggctggaagg acatcaaaga atggtacgag atgctgatgg gccactgcac ctacttcccc 720

gaggaactgc ggagcgtgaa gtacgcctac aacgccgacc tgtacaacgc cctgaacgac 780

ctgaacaatc tcgtgatcac cagggacgag aacgagaagc tggaatatta cgagaagttc 840

cagatcatcg agaacgtgtt caagcagaag aagaagccca ccctgaagca gatcgccaaa 900

gaaatcctcg tgaacgaaga ggatattaag ggctacagag tgaccagcac cggcaagccc 960

gagttcacca acctgaaggt gtaccacgac atcaaggaca ttaccgcccg gaaagagatt 1020

attgagaacg ccgagctgct ggatcagatt gccaagatcc tgaccatcta ccagagcagc 1080

gaggacatcc aggaagaact gaccaatctg aactccgagc tgacccagga agagatcgag 1140

cagatctcta atctgaaggg ctataccggc acccacaacc tgagcctgaa ggccatcaac 1200

ctgatcctgg acgagctgtg gcacaccaac gacaaccaga tcgctatctt caaccggctg 1260

aagctggtgc ccaagaaggt ggacctgtcc cagcagaaag agatccccac caccctggtg 1320

gacgacttca tcctgagccc cgtcgtgaag agaagcttca tccagagcat caaagtgatc 1380

aacgccatca tcaagaagta cggcctgccc aacgacatca ttatcgagct ggcccgcgag 1440

aagaactcca aggacgccca gaaaatgatc aacgagatgc agaagcggaa ccggcagacc 1500

aacgagcgga tcgaggaaat catccggacc accggcaaag agaacgccaa gtacctgatc 1560

gagaagatca agctgcacga catgcaggaa ggcaagtgcc tgtacagcct ggaagccatc 1620

cctctggaag atctgctgaa caaccccttc aactatgagg tggaccacat catccccaga 1680

agcgtgtcct tcgacaacag cttcaacaac aaggtgctcg tgaagcagga agaaaacagc 1740

aagaagggca accggacccc attccagtac ctgagcagca gcgacagcaa gatcagctac 1800

gaaaccttca agaagcacat cctgaatctg gccaagggca agggcagaat cagcaagacc 1860

aagaaagagt atctgctgga agaacgggac atcaacaggt tctccgtgca gaaagacttc 1920

atcaaccgga acctggtgga taccagatac gccaccagag gcctgatgaa cctgctgcgg 1980

agctacttca gagtgaacaa cctggacgtg aaagtgaagt ccatcaatgg cggcttcacc 2040

agctttctgc ggcggaagtg gaagtttaag aaagagcgga acaaggggta caagcaccac 2100

gccgaggacg ccctgatcat tgccaacgcc gatttcatct tcaaagagtg gaagaaactg 2160

gacaaggcca aaaaagtgat ggaaaaccag atgttcgagg aaaagcaggc cgagagcatg 2220

cccgagatcg aaaccgagca ggagtacaaa gagatcttca tcacccccca ccagatcaag 2280

cacattaagg acttcaagga ctacaagtac agccaccggg tggacaagaa gcctaataga 2340

gagctgatta acgacaccct gtactccacc cggaaggacg acaagggcaa caccctgatc 2400

gtgaacaatc tgaacggcct gtacgacaag gacaatgaca agctgaaaaa gctgatcaac 2460

aagagccccg aaaagctgct gatgtaccac cacgaccccc agacctacca gaaactgaag 2520

ctgattatgg aacagtacgg cgacgagaag aatcccctgt acaagtacta cgaggaaacc 2580

gggaactacc tgaccaagta ctccaaaaag gacaacggcc ccgtgatcaa gaagattaag 2640

tattacggca acaaactgaa cgcccatctg gacatcaccg acgactaccc caacagcaga 2700

aacaaggtcg tgaagctgtc cctgaagccc tacagattcg acgtgtacct ggacaatggc 2760

gtgtacaagt tcgtgaccgt gaagaatctg gatgtgatca aaaaagaaaa ctactacgaa 2820

gtgaatagca agtgctatga ggaagctaag aagctgaaga agatcagcaa ccaggccgag 2880

tttatcgcct ccttctacaa caacgatctg atcaagatca acggcgagct gtatagagtg 2940

atcggcgtga acaacgacct gctgaaccgg atcgaagtga acatgatcga catcacctac 3000

cgcgagtacc tggaaaacat gaacgacaag aggcccccca ggatcattaa gacaatcgcc 3060

tccaagaccc agagcattaa gaagtacagc acagacattc tgggcaacct gtatgaagtg 3120

aaatctaaga agcaccctca gatcatcaaa aagggc 3156

<210> 8

<211> 4983

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pX601(EF1a-tRNA)EGFP

<220>

<221> misc_feature

<222> (4734)..(4751)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8