阅读说明：本技术 一种在反胶束酶体系中合成中长链甘油三酯的方法 (Method for synthesizing medium-long chain triglyceride in reverse micelle enzyme system ) 是由 邓泽元 张兵 陈孙妮 李静 李红艳 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明利用脂肪酶界面激活特性,发明了一种在反胶束酶体系中合成中长链甘油三酯的方法,具体合成方法如下：首先构建反胶束酶体系,即在2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)的异辛烷溶液中加入非固定化水溶性Sn-1,3专一性脂肪酶缓冲水溶液(50 mmol/mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠,pH 6.5~8),聚能超声获得澄清反胶束酶体系,其中[酶](mg/mL):[水](mmol/mL):[AOT](mmol/mL)=3~6:200~600:20~30,再将0.3~0.5 g/(mL反应体系)的高中链脂肪酸含量油与高长链脂肪酸含量油以质量比1:1~1.3混合加入反胶束酶体系中,在酶载量为总底物的0.5~3%、反应温度为40~55°C的条件下反应2~4 h,过程中辅以发散超声作用,反应结束后加入2倍反应液体积的水,震荡分层,4200 rpm离心5 min,取上层油相,通过二次分子蒸馏纯化,经HPLC-MS检测中长链三酯的含量为74.39~92.40%。本发明具备高效率高产率生产中长链甘油三酯的优点。(The invention discloses a method for synthesizing medium-long chain triglyceride in a reverse micelle enzyme system by utilizing the interfacial activation characteristic of lipase, which comprises the following steps: firstly, a reverse micelle enzyme system is constructed, namely, a non-immobilized water-soluble Sn-1, 3-specific lipase buffer solution (50 mmol/mL sodium dihydrogen phosphate-disodium hydrogen phosphate, pH 6.5-8) is added into an isooctane solution of 2-ethylhexyl succinate sodium sulfonate (AOT), a clear reverse micelle enzyme system is obtained by energy-gathering ultrasound, wherein [ enzyme ] (mg/mL): water ] (mmol/mL): AOT ] (mmol/mL) = 3-6: 200-600: 20-30, then high-medium-chain fatty acid content oil and high-long-chain fatty acid content oil of 0.3-0.5 g/(mL reaction system) are mixed according to the mass ratio of 1: 1-1.3 and added into the reverse micelle enzyme system, the reaction is carried out for 2-4 hours under the conditions that the enzyme loading amount is 0.5-3 percent of the total substrate and the reaction temperature is 40-55 ℃, and the ultrasonic dispersion effect is assisted in the process, and after the reaction is finished, adding water with the volume 2 times that of the reaction solution, shaking for layering, centrifuging at 4200rpm for 5min, taking an upper oil phase, purifying by secondary molecular distillation, and detecting the content of the long-chain triester in the mixture by HPLC-MS to be 74.39-92.40%. The method has the advantage of producing medium-long chain triglyceride with high efficiency and high yield.)

一种在反胶束酶体系中合成中长链甘油三酯的方法

技术领域

本发明属于粮油加工领域，具体涉及一种在反胶束酶体系中合成中长链甘油三酯的方法。

背景技术

结构脂质是一种天然油脂经过结构重组或改性而得到的具有特殊营养功效或生理功能的油脂，其具体功能随着连接上去的脂肪酸不同而有所变化，主要有促进其它脂质的吸收、增强免疫功能和防癌抗癌等。近年来，中长链甘油三酯由于具有良好的降脂减肥功能受到广泛关注，研究表明，每日向82位健康成人的早餐中添加14 g的中长链甘油三酯，12周后无论是皮下还是内脏脂肪均有减少，尤其是腰围和臀围，减少的比重分别为4.6%和2%。

中长链甘油三酯的制备主要是在催化剂的作用下通过酯交换法实现，底物一般为富含中链脂肪酸的油和富含长链脂肪酸的油，而根据催化剂不同，大致可分为化学法和酶法。

化学法是指在金属醋酸化物或钠的烷基化物等催化剂作用下催化油脂发生随机酯交换反应，是最传统也是应用最早的方法，具有成本低、工艺成熟的优点，但另一方面由于化学催化剂毒性大、反应温度高、产物选择性差等缺点使其在部分领域受到了限制。酶法是指在脂肪酶生物催化剂作用下催化油脂发生随机酯交换反应，非特异性脂肪酶可合成6种随机构成的中长链甘油三酯，而专一性脂肪酶则可选择性地催化合成特定中长链甘油三酯，以满足不同领域的需求，因此成为合成结构脂质的主要方法。事实上，自第一款酶法合成的类母乳结构脂质油酸-饱和脂肪酸-油酸甘油三酯产品问世以来，已有上百种酶法合成的结构脂质上市。常见脂肪酶，如Rhizomucormiehei脂肪酶、Aspergillusoryzae脂肪酶、Penicilliumexpansum脂肪酶等，均被证明具有优秀的催化合成结构脂质的能力，比如同时，酶反应媒介广泛，在水溶液、有机溶剂、超临界CO2流体等中均可进行有效的酯化反应。

然而随着研究的深入，酶法合成中长链甘油三酯也暴露出较多问题，其中最主要的问题就是脂肪酶催化活性低，往往需要较多的脂肪酶或较长的反应时间才可实现高产率。脂肪酶的活性位点上有一个“盖子”结构，这是其活性低的主要原因，而在油水界面上，盖子结构发生位移，暴露出活性位点，酶活性增大，此即为脂肪酶的界面活化效应。脂肪酶的固定化即利用了脂肪酶的界面活化效应，并通过载体将活化态酶加以固定，从而提高催化活性。但另一方面，若能提供一个稳定的油水界面作为酯化反应场所，同样可能提高酯化效率。反胶束是一种自发形成的纳米尺度的聚集体，是一种透明的、热力学稳定的W/O体系，由浓度超过临界胶束浓度的表面活性剂形成，其中表面活性剂极性基团朝内排列形成一个极性核，当该极性核溶解酶液后，该体系构成反胶束酶体系。反胶束酶体系具有较大的油水界面，且由于表面活性剂的辅助作用，界面稳定性良好，脂肪酶在该体系中被界面激活，加之酶溶解在极性核后呈分子水平扩散，降低扩散阻力，增大了与底物的接触机会，以上优势均可提高产物得率，因此该体系在酯化合成方面具有很好的应用前景。

已有的反胶束酶体系的制备方法较为简单，将表面活性剂溶液和酶液混合并充分震荡至澄清即可，但该法制备的反胶束体系存在液滴大小不均匀，稳定性较差等问题。一方面，稳定性差使得体系不可长时间利用；另一方面，反胶束中的液滴大小和脂肪酶的尺寸之间的关系是决定脂肪酶在反胶束体系中活性的重要因素之一，故由于液滴大小不均匀性，酶活性提高不完全且结果重复性差。超声波是一种频率高于20 kHz的声波，其机械效应可促成液体的乳化、凝胶的液化和固体的分散，研究表明超声波辅助制备的乳液具有较高的稳定性且液滴均匀，考虑到反胶束体系是一种类似于乳液的体系，故超声波可能对反胶束酶体系具有相似的影响。除此之外，超声波的空化作用还可起到搅拌作用，使底物和酶充分接触，最终提高得率。

因此，本法将反胶束体系应用到脂肪酶催合成中长链甘油三酯的反应中，并在反胶束体系制备和反应物合成过程中均辅以超声作用，在较短时间内合成高产率产品，具有高效率高产率生产中长链甘油三酯的优点.。

发明内容

本发明公开了一种在反胶束酶体系中合成中长链甘油三酯的方法，以克服现有技术在合成中长链甘油三酯上的不足，所述反胶束酶体系由脂肪酶缓冲水溶液和表面活性剂溶液混合而成，其中表面活性剂溶液由2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）和异辛烷组成，脂肪酶为非固定化水溶性Sn-1,3专一性脂肪酶，缓冲水溶液为50 mmol/mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（PBS），所述反应底物分别为中链脂肪酸含量油与高长链脂肪酸含量油，目标终产物为中长链甘油三酯。

本发明包括以下几个步骤：

（1）均一化反胶束酶体系的构建

在AOT异辛烷溶液中加入非固定化水溶性Sn-1,3专一性脂肪酶缓冲水溶液（50 mol/mLPBS，pH 6.5~8），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3~8:200~600:20~30，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为20~30 kHz，功率为200~400 W，超声温度为40~55 °C，超声总时间为35~56 s，超声方式为“超声5 s-停2 s”。

（2）在反胶束酶体系中长链甘油三酯的合成

将0.3~0.5 g/（mL反应体系）中链脂肪酸含量油与高长链脂肪酸含量油以质量比1:1~1.3为混合加入反胶束酶体系中，在酶载量为总底物的0.5~3%、反应温度为40~55 °C的条件下反应2~4 h，程中辅以发散超声作用，超声功率为30~40 kHz，功率为200~400 W，超声方式为“超声10 s-停20 s”，反应结束后加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200 rpm离心5min，取上层油相，即为产物混合物。

（3）利用分子蒸馏纯化产物

首先在进料速率为1~2 mL/min、加热温度为80~90 ℃、刮板转速为150~250 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相进行二级分子蒸馏，在进料速率为1~2 mL/min、加热温度为170~180 ℃、刮板转速为150~250r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行，除去甘油一酯和甘油二酯，通过HPLC-MS检测二级重相中中长链甘油三酯的含量为74.39~92.40%。

本发明的有益效果是：（1）采用聚能超声辅助制备含有脂肪酶的水/AOT/异辛烷反胶束酶体系，再采用发散超声辅助促进酶法催化合成中长链甘油三酯，具有生成条件温和，酯化率高，产量高的优点。（2）采用分子蒸馏法纯化产物，操作简单，纯度高，可大批量制备后进一步用于动物实验，研究其降脂减肥动能，进而研究其对人体心血管疾病的影响。（3）本方法描述的中长链甘油三酯合成方法简单，易于操作，可以适用于各类结构脂质的合成。

具体实施方式

实施例1

将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量Rhizomucormiehei脂肪酶缓冲水溶液（50 mol/mL PBS，pH 7），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=5:500:25，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为25 kHz，功率为300 W，超声温度为45 °C，超声总时间为49 s，超声方式为“超声5 s-停2 s”。然后加入0.4 g/（mL反应体系）樟树籽油和等质量的菜籽油，在酶载量为底物1.0%、反应温度45 ℃的条件下反应4 h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为35 kHz，功率为300W，超声方式为“超声10 s-停20 s”。反应结束后，加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200rpm离心5 min，取上层油相，即为产物混合物。对混合物进行分子蒸馏纯化，首先在进料速率为1 mL/min、加热温度为90 ℃、刮板转速为250 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相在进料速率为1 mL/min、加热温度为170 ℃、刮板转速为250 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行二级分子蒸馏，除去甘油一酯和甘油二酯，通过HPLC-MS检测二级重相中中长链甘油三酯的含量为92.40%。

实施例2

将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量Rhizomucormiehei脂肪酶缓冲水溶液（50 mol/mL PBS，pH 7.5），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3.5:375:25，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为20 kHz，功率为300 W，超声温度为50 °C，超声总时间为56 s，超声方式为“超声5 s-停2 s”。然后加入0.5 g/（mL反应体系）樟树籽油和1.2倍质量的菜籽油，在酶载量为底物0.8%、反应温度50 ℃的条件下反应3 h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为30 kHz，功率为350 W，超声方式为“超声10 s-停20 s”。反应结束后，加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200 rpm离心5 min，取上层油相，即为产物混合物，对混合物进行分子蒸馏纯化，首先在进料速率为1.5 mL/min、加热温度为90 ℃、刮板转速为200 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相在进料速率为2 mL/min、加热温度为180 ℃、刮板转速为200 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行二级分子蒸馏，除去甘油一酯和甘油二酯，通过HPLC-MS检测二级重相中中长链甘油三酯的含量为85.3%。

实施例3

将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量Rhizomucormiehei脂肪酶缓冲水溶液（50 mol/mL PBS，pH 8），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=4:400:20，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为35 kHz，功率为350 W，超声温度为40 °C，超声总时间为35 s，超声方式为“超声5 s-停2 s”。然后加入0.3 g/（mL反应体系）樟树籽油和1.3倍等质量的菜籽油，在酶载量为底物0.5%、反应温度40 ℃的条件下反应2 h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为35 kHz，功率为300 W，超声方式为“超声10 s-停20 s”。反应结束后，加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200 rpm离心5 min，取上层油相，即为产物混合物。对混合物进行分子蒸馏纯化，首先在进料速率为2mL/min、加热温度为80 ℃、刮板转速为150 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相在进料速率为2 mL/min、加热温度为170 ℃、刮板转速为150 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行二级分子蒸馏除去甘油一酯和甘油二酯，通过HPLC-MS检测二级重相中中长链甘油三酯的含量为80.3%。

实施例4

将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量Rhizomucormiehei脂肪酶缓冲水溶液（50 mol/mL PBS，pH 6.5），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3:400:25，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为30 kHz，功率为200 W，超声温度为45 °C，超声总时间为42 s。然后加入0.5 g/（mL反应体系）椰子油和1.3倍等质量的茶油，在酶载量为底物1.5%、反应温度45 ℃的条件下反应4 h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为40 kHz，功率为200 W，超声方式为“超声10s-停20 s”。反应结束后，加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200 rpm离心5 min，取上层油相，即为产物混合物。对混合物进行分子蒸馏纯化，首先在进料速率为1 mL/min、加热温度为90 ℃、刮板转速为250 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相在进料速率为1 mL/min、加热温度为180 ℃、刮板转速为250 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行二级分子蒸馏，除去甘油一酯和甘油二酯，通过HPLC-MS检测二级重相中中长链甘油三酯的含量为90.3%。

实施例5

将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量Aspergillusoryzae脂肪酶缓冲水溶液（50 mol/mL PBS，pH 7.5），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=5:500:20，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为30 kHz，功率为400 W，超声温度为55 °C，超声总时间为42 s。然后加入0.4 g/（mL反应体系）樟树籽油和1.1倍等质量的菜籽油，在酶载量为底物2%、反应温度55 ℃的条件下反应4 h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为40 kHz，功率为400 W，超声方式为“超声10s-停20 s”。反应结束后，加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200 rpm离心5 min，取上层油相，即为产物混合物。对混合物进行分子蒸馏纯化，首先在进料速率为1.5 mL/min、加热温度为90 ℃、刮板转速为250 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相在进料速率为1.5 mL/min、加热温度为180 ℃、刮板转速为250 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行二级分子蒸馏，除去甘油一酯和甘油二酯，通过HPLC-MS检测二级重相中中长链甘油三酯的含量为86.63%。

实施例6

将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量Penicilliumexpansum脂肪酶缓冲水溶液（50 mol/mL PBS，pH 8），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=6:500:30，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为20 kHz，功率为200 W，超声温度为50 °C，超声总时间为35 s。然后加入0.3 g/（mL反应体系）樟树籽油和等质量的菜籽油，在酶载量为底物3%、反应温度50 ℃的条件下反应2h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为30 kHz，功率为200 W，超声方式为“超声10 s-停20 s”。反应结束后，加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200 rpm离心5 min，取上层油相，即为产物混合物。对混合物进行分子蒸馏纯化，首先在进料速率为2 mL/min、加热温度为80℃、刮板转速为150 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相在进料速率为1 mL/min、加热温度为180 ℃、刮板转速为200 r/min、真空度为0.5 Pa的条件下进行二级分子蒸馏，除去甘油一酯和甘油二酯，通过HPLC-MS检测二级重相中中长链甘油三酯的含量为74.3%。