阅读说明：本技术 一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法 (Preparation and application method of biological stimulin for improving salt tolerance of corn seed germination ) 是由 江绪文 李贺勤 于 2019-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及种子科学领域,特别是关于一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法。从青岛崂山藿香植株根系中分离筛选、纯化鉴定获得重要菌株<I>Pantoea agglomerans</I> strain HX-1,研究发现其具有产吲哚乙酸、溶磷、耐盐等能力,其菌液浸种能有效提高玉米种子活力,与菌株<I>Bacillus megaterium</I> HX-2制备的生物刺激素能有效提高盐碱地玉米种子萌发出苗能力。本发明基于生物刺激素可对植物的自然进程起到刺激作用,特别是具有能够提高非生物胁迫抗力等功效,从藿香植株根系成功获得菌株HX-1,并用于目标生物刺激素的制备及应用方法研究。本发明可广泛应用于盐碱地玉米生产中。(The invention relates to the field of seed science, in particular to a preparation method and an application method of biological stimulin for improving the salt tolerance of corn seed germination. Important bacterial strain is obtained by separating, screening, purifying and identifying from roots of Laoshan agastache rugosus Pantoea agglomerans The strain HX-1 is researched and found to have the capabilities of producing indoleacetic acid, dissolving phosphorus, resisting salt and the like,the bacterial liquid can effectively improve the activity of corn seeds by soaking seeds, and the bacterial strain Bacillus megaterium The biological stimulator prepared by HX-2 can effectively improve the germination and seedling emergence capability of the corn seeds in the saline-alkali soil. The invention can stimulate the natural process of plants based on the biological stimulin, particularly has the efficacy of improving abiotic stress resistance and the like, successfully obtains the strain HX-1 from the root system of the agastache rugosus plants, and is used for the research of the preparation and application methods of the target biological stimulin. The invention can be widely applied to the production of the corn in the saline-alkali soil.)

一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法

技术领域

本发明涉及种子科学领域，特别是关于一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法。

背景技术

生物刺激素是近年来在全球农资市场上出现一个极其时尚的名词。按照国际组织的定义，生物刺激素是一种包含某些成分和微生物的物质，这些成分和微生物在施用于植物或者根际时，其功效是对植物的自然进程起到刺激作用，包括加强/有益于营养吸收、营养功效、非生物胁迫抗力及作物品质，而与营养成分无关。在欧洲，生物刺激素的使用已涉及果树(柑橘、橄榄、葡萄等)、蔬菜和水果(西兰花、辣椒、黄瓜、草莓、西红柿、甜瓜等)、粮食作物(土豆、小麦、玉米、油菜等)和花卉、苗圃等，并取得了良好的效果。

种子活力是指在广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗和长成正常幼苗潜在能力的总称（McDonald，1980）。种子处理、包衣是指在种子收获后到播种前，采用各种有效的处理，包括杀菌消毒、温汤浸种，肥料浸拌种、微量元素，低温层积、生长调节剂处理和包衣等强化方法，具有防止种子携带病菌的危害和土壤中的病虫害，保护种子正常发芽和出苗生长；提高种子对不利土壤和气候条件的抗逆能力，增加成苗率；提高种子的耐藏性，防止种子劣变；改变种子大小和形状，便于机械播种；增加种子活力，促进全苗、壮苗，提高作物产量和改善产品质量等功效。前期研究发现生物刺激素能够有效提高种子活力，以保障田间播种后实现苗齐、苗匀、苗壮，并可持续影响植株后期的产量和品质，特别是种子生物刺激素是非常值得研发的产业，具有广阔的应用前景。

近年来我国旱薄地、盐碱地等中低产田的开发、改良和利用是扩大作物种植面积提高产量的有效途径之一，特别是高质量种子又是盐碱地等绿色开发利用提高单产的重要基础和保障，故深入提高种子质量已成为新时代种业发展最重要的主题之一。玉米作为我国的第一大粮食作物，农业农村部部长***在《玉米论略》一文中就特别强调了“抓好玉米生产就抓好了粮食持续稳定发展的关键”。故不断研发种子生物刺激素新产品并应用于玉米等作物生产中，进而提高作物种子逆境出苗等能力以保障作物产量和品质，对加快我国新旧动能转换、保障我国未来粮食有效供给具有重大意义。

目前我国利用种子生物刺激素产品提高玉米种子逆境萌发出苗能力的报道甚少。土壤盐渍化是世界范围内农业生产上最常见的问题, 它产生的离子毒害和渗透胁迫对植物的生长和发育造成重大影响，直接影响产量和品质。选育耐盐作物是一个切实可行的解决途径，但目前成功的例子并不多，而提高现有栽培作物的耐盐生长能力成为一种有效的策略。通过分离微生物等物质成分研发生物刺激素产品以提高玉米等作物抗盐碱能力的报道较少，尚有巨大的市场空间和发展潜力。

发明内容

本发明的目的是为满足种子生物刺激素市场需求和克服现有技术不足，提供一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法，该生物刺激素的制备及应用能够有效提高玉米种子萌发出苗抗盐胁迫能力，以满足盐碱地玉米生产需要。

为了实现上述目的，本发明基于生物次激素对植物的自然进程起到刺激作用，特别是具有提高植物生长对非生物胁迫抗力等功效。围绕“提高玉米种子萌发抗盐能力”这一目标，广泛收集目标有益微生物的可能来源样本，并通过分离鉴定等一系列作业完成提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素研发及应用工作。本发明采用以下技术方案获得一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法，主要包括以下作业：（1）菌源样品收集；（2）菌株分离筛选；（3）菌株纯化；（4）菌株促生能力测定；（5）菌株鉴定；（6）生物刺激素制备；（7）生物刺激素应用实效检测。

所述作业（1）中，根据研发目标，收集菌源样品，样品标识和保存；本发明菌源为青岛崂山藿香植株根系。

所述作业（2）中，采用匀浆法在含不同浓度NaCl的固体牛肉膏蛋白胨上对藿香根系内生细菌进行逐级分离筛选耐盐菌株。

所述作业（3）中，采取平板划线法进行菌株纯化获得候选菌株，并对候选菌株的耐盐性、耐酸碱性等进行测定。

所述作业（4）中，对候选菌株进行产激素吲哚乙酸、溶磷能力测定等；制备菌液，对试验玉米种子浸种处理后进行标准发芽试验、幼苗生长测定、模拟田间出苗率测定等以鉴定促生效果。

所述作业（5）中，对目标菌落进行形态特征鉴定和16S rDNA种属分子鉴定。

所述作业（6）中，以目标菌液为主效成分制备目标生物刺激素。

所述作业（7）中，目标生物刺激素盐碱地玉米生产应用实效验证及使用方法研究。

本发明的有益效果是：基于生物刺激素可对植物的自然进程起到刺激作用，特别是具有能够提高非生物胁迫抗力等功效。为提高玉米种子萌发抗盐能力，通过菌源样品收集、菌株分离筛选、菌株纯化、菌株促生能力测定、菌株鉴定等制备目标生物刺激素，并结合盐碱地应用实效验证建立使用方法；本发明可广泛应用于盐碱地玉米生产中，以提高玉米种子活力，保障种子在盐胁迫条件下快速整齐出苗，助力盐碱地玉米增产增效。

附图说明

图1为本发明的作业流程图。

图2为本发明的NaCl和pH对菌株HX-1生长的影响。

图3为本发明的盐胁迫下HX-1菌液处理对玉米种子发芽势和发芽率的影响。

图4为本发明的盐胁迫下HX-1菌液处理对玉米种子幼苗生长的影响。

图5为本发明的盐胁迫下HX-1菌液处理对玉米种子模拟田间出苗率的影响。

图6为本发明的菌株HX-1的16S rDNA基因序列。

图7为本发明的菌株HX-1的系统发育树。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1所示，本发明基于生物刺激素可对植物的自然进程起到刺激作用，微生物有益菌等物质作为生物刺激素一种重要的组成形式，对其开发利用将有利于种子活力提高，并持续影响植株后期的产量和品质。本发明涉及的提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法包括菌源样品收集、菌株分离筛选、菌株纯化、菌株促生能力测定、菌株鉴定、生物刺激素制备、生物刺激素应用实效检测等作业。

本发明涉及的提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法具体实施方式如下。

（1）菌源样品收集：根据生物刺激素研发目标，选择植物内生菌来源，对收集的样品名称、具体时间、地点等信息进行登记；本发明菌源为2015年9月青岛崂山（经度120.47；维度36.10）收集到的新鲜藿香植株组织（样品经原青岛农业大学现广西中医药大学谭勇教授鉴定为藿香植株）。

（2）菌株分离筛选：采用匀浆法在含不同浓度 NaCl的固体牛肉膏蛋白胨上对细菌进行分离筛选。首先将新鲜的藿香植株组织样品（包括根、茎、叶、花等）表面清洗干净；其次在无菌环境下，将样品用70%乙醇浸泡1min后取出，用无菌水清洗3遍；然后将样品放入含0.5 mL/L Tween-20的2% NaClO₃溶液中摇晃浸泡20min后，取出用无菌水清洗3遍（收集第3遍清洗液），并用无菌吸水纸吸干样品表面浮水备用；最后取第3遍冲洗液100µL 涂布于固体牛肉膏蛋白胨培养基平板上，培养 48h 观察培养基有无细菌生长，若无则表明样品表面灭菌成功，反之需重新灭菌。将表面灭菌的藿香植株不同组织样品（包括根、茎、叶、花等）分别放入无菌研钵中充分研磨，随后将研磨液逐级进行10倍系列稀释，分别取根、茎、叶、花等组织的匀浆液100µL 涂布于含0.5%、1%、3%、5%、7%、9%等6个不同浓度NaCl的固体牛肉膏蛋白胨培养基平板上，置于恒温培养箱 28℃培养48h后进行细菌生长情况观察。

（3）菌株纯化：基于平板细菌生长情况观察，根系组织样品备受关注，包括含7%NaCl的固体牛肉膏蛋白胨上有少量菌落生长，含9% NaCl的固体牛肉膏蛋白胨上未见菌落生长。选择含7% NaCl的固体牛肉膏蛋白胨上生长的菌落，采取平板划线法对该菌落进行纯化，30℃下培养48h，得到菌株HX-1（HuoXiang-1），并针对该菌株开展耐盐性、耐酸碱性等补充试验。

耐盐性：将生长对数期的HX-1菌液0.1mL加入40 mL NaCl含量为0.5％、1.0％、3.0％、5.0％、7.0％、9.0％的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃恒温摇床200 r/min培养24h，测菌液OD600nm的吸光值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作对照，重复3次。

结果表明菌株HX-1具有一定的耐盐性，耐盐范围为0.5％—7.0％（见图2）。

耐酸碱性：将生长对数期的HX-1菌液0.1 mL加入40 mL pH为4，5，6，7，8，9，10的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 °C恒温摇床200 r/min培养24h，测菌液OD600nm的吸光值，以未接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作对照，重复3次。

结果表明菌株HX-1适宜生长的pH范围是4.0—8.0（见图2）。

菌株HX-1以25％甘油作冷冻保护剂，HX-1菌株在-80℃超低温冰箱保存，保存地点为：青岛农业大学农学院种子科学与工程实验室。

（4）菌株促生能力测定：首先对菌株HX-1进行产激素吲哚乙酸和溶磷能力测定；其次采用HX-1菌液处理玉米种子，对处理后的玉米种子进行标准发芽试验、幼苗生长测定、模拟田间出苗率测定等；结果数据统计分析采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan法检验各参数不同处理间的差异显著性（P<0.05）。

产激素吲哚乙酸测定：首先将在金氏B液体培养基上30℃恒温200 r/min摇培48h的菌液按照Kovacs氏靛基质试剂盒（青岛海博生物技术有限公司）说明书进行操作，颜色变红表明内生细菌HX-1能产生吲哚乙酸，颜色越深，表明产生的吲哚乙酸越多，3次重复；其次以吲哚乙酸标准品制作标准曲线，将培养48h的菌悬液和对照10000 r/min离心10 min后取上清，加入等体积的Salkowsk显色剂，室温下避光显色20min，测定其OD530nm吸光值；最后根据标准曲线计算内生细菌分泌吲哚乙酸的含量。

产激素吲哚乙酸测定结果表明在含100 mg/L色氨酸的金氏B液体培养基中，加入该菌培养后Kovacs氏靛基质试剂变红，说明内生菌HX-1具有产生吲哚乙酸的能力。Salkowsk显色后OD530nm为0.151，由标准曲线方程y=0.005x+0.006（R2=0.9994，y代表吸光值，x代表浓度）计算得吲哚乙酸的含量为29 mg/L。

溶磷能力测定：将HX-1菌株点接于固体有机磷培养基上，30℃培养7d，观察有无溶磷圈，并测定溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)的比值，比值为1表示无解磷能力，3次重复。

溶磷能力测定结果为：在有机磷培养基平板上产生透明圈，溶磷圈直径（D）与菌落直径（d）的比值为1.5，表明内生菌HX-1具有溶解有机磷的能力。

标准发芽试验及幼苗生长测定：以郑单958、登海618、鲁单981玉米品种样品为材料（2017年收集，无包衣），参照农作物种子检验规程和国际种子检验规程进行卷纸发芽；选取大小均一、健康饱满的种子，用1％NaClO溶液消毒10min后，用无菌蒸馏水清洗3遍，然后用吸水纸吸去种子表面浮水，备用；将30°C恒温200 r/min摇培48h的HX-1菌液浓度调为1.0×108—1.5×108cfu/mL；将消毒后的玉米种子在菌液中浸种12h（Treatment，T）后取出，基于前期研究，选用200mmol/L的NaCl溶液润湿发芽纸（美国Anchor安科发芽纸）交错置床后卷起放入自封袋，垂直置于人工气候箱中25℃下避光发芽，3次重复，每重复100粒（3卷），以未浸泡处理的为对照1（Control1，C1），液体培养基浸泡处理为对照2（Control2，C2），第4d统计发芽势（Germination Energy，GE），第7d统计发芽率（Germination Percentage，GP）；GE＝4d内发芽种子数/供试种子数×100%；GP＝7d内发芽种子数/供试种子数×100%；统计发芽率的同时，从各重复随机选取10株苗，进行苗（芽）长、主根长、苗（芽）鲜重/10株、根鲜重/10株、苗（芽）干重/10株（105℃，8h）和根干重/10株（105℃，8h）等指标的测定。

模拟田间出苗率测定：从山东东营市运取足够盐碱土，用塑料发芽箱室温下进行模拟田间试验。首次在发芽箱中放入盐碱土，用平基板将土床制平，土深约10cm；其次通过置种板上的置种孔将种子整齐置床，种胚朝下，移去置种板后，覆土3cm；最后再用平基板将覆土制平（注：本步骤使用的平基板、置种板、置种孔介绍见实用新型专利：江绪文,李贺勤.一种玉米种子发芽盒.专利号201320432096.X），并用保鲜膜将发芽箱封口。每处理3次重复，各重复100粒种子，第15天统计出苗率。

试验于2017年8月—9月在青岛农业大学种子科学与工程实验室进行。

从标准发芽试验结果来看（见图3）：与C1、C2相比，T均能显著提高3个玉米品种样品种子盐胁迫条件下的发芽势和发芽率，且差异均显著。

从幼苗生长试验结果来看（见图4）：与C1、C2相比，T均能显著提高3个玉米品种样品种子盐胁迫条件下的芽（苗）长、主根长、芽（苗）鲜重/10株、根鲜重/10株、芽（苗）干重/10株和根干重/10株等6项指标，3个玉米品种中除鲁单981根干重/10株指标，T与C1和C2差异不显著外，其他指标差异均显著。

从标准发芽试验及幼苗生长测定结果可见，对采取HX-1菌液浸种处理12h后可有效促进盐胁迫条件下玉米种子萌发和幼苗生长能力。

模拟田间出苗率测定结果来看（见图5）：与C1、C2相比，T均能显著提高3个玉米品种样品种子模拟田间出苗率，且差异均显著。

（5）菌株鉴定：从形态和分子两方面对菌株HX-1进行鉴定。

形态鉴定：菌株HX-1在牛肉膏蛋白胨固体培养基上30 ℃培养48 h，观察记录菌落的形态、光泽、质地、边缘特征、表面特征、***形状及菌落颜色等特征。

形态鉴定结果表明，菌落圆形，黄色，边缘整齐，表面湿润、光滑，革兰氏染色呈阴性，短杆状。

分子鉴定：将接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基30℃恒温200r•min-1摇培48h的菌液进行16SrDNA分子鉴定，3次重复；采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（购于生工生物工程（上海）股份有限公司）提取HX-1基因组，以基因组为模板进行PCR扩增，通用引物为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGT-3’)，反应体系为20uL，PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min后存于4℃；PCR反应产物测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成；将PCR反应产物测序结果在GeneBank上进行Blast比对，获得与目标菌株相似性较高的序列，再用Clustalx比对，采用MEGA5.1工具构建NJ系统发育树。

分子鉴定结果表明，HX-1菌株16SrDNA基因序列片段大小为1444bp（见图6）；登录NCBI进行Blast比对，选取10个相似度较高的菌株16SrDNA基因序列构建NJ系统发育树，HX-1与成团泛菌Pantoea agglomerans（FJ592996.1）聚在一个分支，相似率达99.0%，说明HX-1与该菌株亲缘关系最近（见图7）。

结合形态特征和16S rDNA基因序列分析结果，判定HX-1为成团泛菌，命名为Pantoea agglomerans strain HX-1。现保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏中心登记入册编号（CGMCC No. 17646）；经保藏中心于2019年4月29日检测结果为存活；建议的分类命名为：Pantoeaagglomerans。

（6）生物刺激素制备：基于前期我们从藿香健康叶片中分离出的内生细菌HX-2巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）能分泌吲哚乙酸和溶解无机磷，菌株HX-2适宜生长的pH范围是5.0-9.0，NaCl含量为0.5％-8.0％条件下能生长等重要结论（江绪文,李贺勤,谭勇. 藿香内生细菌HX-2的鉴定、耐性及对宿主植物的促生作用.草业学报，2018，27：161-168）。经试验发现HX-1和HX-2混合使用对提高玉米种子萌发抗盐胁迫效果更好，故HX-2也被用于本发明目标生物刺激素的制备。

所述生物刺激素由成团泛菌Pantoea agglomerans strain HX-1（2.0×108—2.5×108cfu/mL）、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium HX-2（2.0×108—2.5×108cfu/mL）按体积比1：1充分混合，调混合菌液pH到5.0－8.0之间即可。

生物刺激素应用实效检测：2018年在山东东营和菏泽进行盐碱地田间出苗率试验，种子间距0.03m，行间距0.05m，行长0.3m，3次重复。播种前将生物刺激素稀释2-3倍，以郑单958玉米品种种子为试验材料，浸种12h后沥干播种，以未浸种处理种子为对照，播种后15天统计田间出苗率。实施效果：与对照相比，处理后的种子出苗更快，出苗更整齐，两地田间出苗率分别提高了8.3%和10.2%。

综上所述，本发明基于生物次激素可对植物的自然进程起到刺激作用，特别是具有能够提高非生物胁迫抗力等功效。为提高玉米种子萌发抗盐能力，研发了一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素，其中重要菌株成团泛菌Pantoea agglomerans strain HX-1具有产生吲哚乙酸并兼具溶磷能力，能有效提在盐胁迫条件下玉米种子萌发活力，此外结合前期我们获得的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium HX-2成功制备了一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素，为该产品后期的正式商业化使用奠定重要基础。本发明可以广泛的应用于盐碱地玉米生产中。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的设计精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 一种提高玉米种子萌发耐盐性生物刺激素制备及应用方法

<130> 2019104555632

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1444

<212> DNA

<213> 成团泛菌HX-1(Pantoea agglomerans strain HX-1)

<400> 1

tgaatgcgac ccgcagctac catgcagtcg gacggtagca cagagagctt gctctcgggt 60

gacgagtggc ggacgggtga gtaatgtctg gggatctgcc cgatagaggg ggataaccac 120

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gtac 1444