阅读说明：本技术 一种诱导中国水仙产生花青素的方法及其应用 (Method for inducing Chinese narcissus to generate anthocyanin and application thereof ) 是由 彭嘉宇 曾黎辉 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种诱导中国水仙产生花青素的方法及其应用,属于植物转基因技术领域。该方法包括以下步骤：(1)百合ANS基因编码区全长序列的克隆；(2)构建ANS基因pC2300-35S::ANS植物表达载体；(3)基因枪法将pC2300-35S::ANS植物表达载体导入中国水仙受体材料中；(4)受体材料中ANS基因表达结果鉴定。本发明方法使原本不含有花青素的中国水仙产生了花青素,表现出红色现象。(The invention discloses a method for inducing Chinese narcissus to generate anthocyanin and application thereof, belonging to the technical field of plant transgenosis. The method comprises the following steps: (1) cloning the full-length sequence of the coding region of the lily ANS gene; (2) constructing an ANS gene pC2300-35S, namely an ANS plant expression vector; (3) introducing an ANS plant expression vector into a Chinese narcissus receptor material by a gene gun method, wherein the expression vector is pC 2300-35S; (4) and identifying ANS gene expression results in the receptor material. The method of the invention leads the Chinese narcissus which originally does not contain anthocyanin to generate anthocyanin and show red phenomenon.)

一种诱导中国水仙产生花青素的方法及其应用

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及一种诱导中国水仙产生花青素的方法及其应用。

背景技术

中国水仙是中国传统名花，冬季开花常作为年宵花卉，极具观赏价值和经济价值。但中国水仙花色单一，只有黄、白两种花色。中国水仙花色单一的一个主要原因是花中缺乏花色素苷。我们的研究发现中国水仙不能合成花青素的主要原因是缺少花青素合成途径关键酶ANS（花青素合成酶）基因的表达。因此，将适合的外源ANS基因导入中国水仙并有效表达是诱导中国水仙产生红色花青素的有效途径。

中国水仙是三倍体植物，高度不育，一般只能用小鳞茎进行无性繁殖，利用传统的杂交育种方式很难培育出新的品种。因此，本方法是中国水仙花色创新的有效途径。

本发明运用基因枪技术将构建的35S::ANS载体转入中国水仙，诱导中国水仙产生花青素，改变中国水仙的花色，使中国水仙产生红色性状。

发明内容

本发明为了克服中国水仙只有黄、白花色，品种颜色单一的缺陷，提供一种诱导中国水仙产生红色花青素的方法及其应用。克隆百合ANS基因，构建35S::ANS嵌合基因，确立基因枪转化参数，通过基因枪导入在中国水仙受体材料中表达ANS，使中国水仙产生花青素，表现出红色性状。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种诱导中国水仙产生红色花青素的方法，包括以下步骤：

（1）百合ANS基因编码区全长序列的克隆；

（2）构建ANS基因pC2300-35S::ANS植物表达载体；

（3）基因枪法将pC2300-35S::ANS植物表达载体导入中国水仙受体材料中；

（4）受体材料中ANS基因表达诱导产生花青素的鉴定。

上述步骤（1）中百合ANS基因编码区全长序列的克隆，具体为：根据NCBI中百合ANS基因编码区序列设计含限制性酶切位点的特异性引物，以百合cDNA为模板克隆ANS基因全长。

进一步的，所述百合ANS基因编码区序列如SEQ ID NO:1所示；所述特异性引物为：SEQ ID NO：2：ANSF：5’-GGATCCATGCCGACCGAGATCATGCCGTT-3’；SEQ ID NO：3 ANSR：5’-CTG CAGCCTCACTTGGGAGAAGTGAAGTCCTCC-3’。

上述步骤（2）中构建ANS基因pC2300-35S::ANS植物表达载体具体为：ANS全长基因和pC2300-35S质粒，先用BamH I和Pst I双酶切，然后进行连接，获得重组质粒pC2300-35S::ANS植物表达载体。

上述步骤（3）中所述受体材料为：中国水仙花瓣、副冠、鳞茎盘。

上述步骤（3）基因枪法将pC2300-35S::ANS植物表达载体导入中国水仙受体材料中，包括以下具体步骤：

1）受体材料预处理；

2）基因***准备；

3）基因枪轰击受体材料；

4）轰击后处理。

进一步的，上述步骤1）中受体材料预处理为：轰击前4-8h受体材料先接种于渗透培养基中预处理；所述渗透培养基为：MS+2mg/L2,4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，Ph5.8。

进一步的，上述步骤2）中基因***准备为：60mg/ml金粉或钨粉悬浮液50ul、1ug/ul的植物表达载体DNA 5ul、 2.5M CaCl₂50ul、0.1M亚精胺20ul。

进一步的，上述步骤3）基因枪轰击受体材料，其中鳞茎盘轰击参数为轰击距离6cm，气压1350psi，花瓣和副冠的轰击参数为轰击距离9cm，1100psi。

进一步的，上述步骤4）轰击后处理为：轰击后受体材料放置在渗透培养基上渗透处理。

上述一种诱导中国水仙产生红色花青素的方法在使无法产生花青素的中国水仙产生花青素中的应用。

本发明的优点在于：

本发明提供了一种诱导中国水仙产生红色花青素的方法，能应用于红色中国水仙品种（包括红色球，红色花）的培育，克服中国水仙花色单一，难以通过常规育种手段创新花色的难题。

附图说明

图1 为ANS基因PCR克隆电泳图。M为DL2000DNAMarker，1，2为PCR产物。

图2 为pMD19-T-ANS双酶切图。M为DL15000DNAMarker，1,2为pMD19-T-ANS基因双酶切。

图3 为pC2300-35S::ANS双酶切图。M为DL15000DNAMarker，1,2为pC2300-35S::ANS基因双酶切。

图4 为不同参数轰击水仙鳞茎盘效果图。A：6cm，1100psi；B：9cm，1100psi；C：9cm，1350psi；D：6cm，1350psi。

图5 为不同参数轰击水仙副冠效果图。A：6cm，1100psi；B：9cm，1100psi；C：9cm，1350psi；D：6cm，1350psi。

图6 为不同参数轰击水仙花瓣效果图。A：6cm，1100psi；B：9cm，1100psi；C：9cm，1350psi；D：6cm，1350psi。

图7 为pC2300-35S::ANS质粒基因枪打入花瓣后的效果图，轰击参数为9cm，1100psi。

图8为pC2300-35S::ANS质粒基因枪打入副冠后的效果图，轰击参数为9cm，1100psi。

图9为pC2300-35S::ANS质粒基因枪打入鳞茎盘后的效果图，轰击参数为6cm，1350psi。

图10 为空白载体pC2300-35S（对照）打入花瓣后的效果图。

图11 为空白载体pC2300-35S（对照）打入副冠后的效果图。

图12 为空白载体pC2300-35S（对照）打入鳞茎盘后的效果图。

图13 为导入ANS基因后中国水仙混样质控QC样本的总离子流图（Total ionscurrent，TIC，即每个时间点质谱图所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱）。

图14 为导入ANS基因后的中国水仙样本MRM代谢物检测图。A：目标检测物矢车菊素峰图；B：多物质提取的离子流谱图。

图15 为矢车菊素在样本中的定量分析积分校正结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1 pC2300-35S::ANS植物表达载体构建

1 百合ANS基因的克隆

（1）目的基因序列的获得

根据NCBI中百合ANS基因编码区序列（SEQ ID NO:1）设计特异性引物，在上下游加上限制性酶切位点，克隆全长。

目的基因序列两端设计引物如下：

SEQ ID NO：2：ANSF：GGATCCATGCCGACCGAGATCATGCCGTT（下划线为BamH I酶切位点）

SEQ ID NO：3：ANSR：CTGCAGCCTCACTTGGGAGAAGTGAAGTCCTCC（下划线为Pst I酶切位点）

根据TransZol Up Plus RNA Kit 试剂盒说明书要求，提取百合总RNA，参照RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit 逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA，以此cDNA为模板，进行PCR扩增克隆百合ANS基因目的基因，PCR体系如下：

PCR反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火1min，72℃延伸1.5min，35次循环；最后72℃延伸7min。1%琼脂糖凝胶电泳检测，跑胶获得目的片段条带（图1）。

（2）目的基因连接T载体

按照Omega Gel Extraction Kit试剂盒操作要求，对目的片段产物进行回收，将回收产物连接到pMD19-T载体，热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板后放置于37℃恒温箱过夜培养。挑取单菌落进行扩大培养，PCR检测，阳性菌参照 Omega 公司小量质粒提取试剂盒说明书提取质粒后进行测序比对。比对结果相符。

（2） ANS基因35S::ANS植物表达载体的构建

pMD19-T-ANS质粒，用BamHI和PstI进行双酶切，回收目的基因ANS片段（图2）。用BamH I和Pst I双酶切质粒pC2300-35S，回收载体大片段。将目的基因和载体大片段用T4连接酶连接，构建重组质粒pC2300-35S::ANS植物表达载体， PCR检测和双酶切验证（图3），提取重组质粒测序，确认重组质粒构建成功。

实施例2 ANS基因在中国水仙中表达

（1）受体材料预处理

基因枪轰击前4-8h将受体材料中国水仙花瓣、副冠、鳞茎盘事先接种于渗透培养基（MS+2mg/L2,4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，Ph5.8）中预处理，轰击前将其集中在培养皿的中心（直径2.5cm）位置。

（2） 轰击前准备工作

可裂膜支持帽和载体膜组件使用前高压灭菌，载体膜、可裂膜，铜网使用前在75%乙醇中浸泡5-8min，无菌条件下晾干，超净台紫外灭菌，其余组件用75%乙醇表面灭菌，晾干。

（3） 基因***制备

调整重组质粒pC2300-35S::ANS植物表达载体或pC2300-35S原始载体的浓度为1ug/ul。

制备子弹所用材料浓度及用量：60mg/ml金粉/钨粉悬浮液 50ul、重组质粒pC2300-35S::ANS植物表达载体或pC2300-35S原始载体DNA 5ul、2.5M CaCl 50ul、0.1M亚精胺 20ul（最终浓度：CaCl 1M，亚精胺 0.016M），涂抹于载体膜上。子弹制备好后2h内使用完毕（可打6次）。

（4） 基因枪轰击中国水仙受体材料

轰击参数选择：受体材料与载体膜距离6cm、9cm，气压1100psi、1350psi，共4种参数组合方式（6cm，1100psi；6cm，1350psi；9cm，1100psi；9cm，1350psi），经过试验以后选择最佳轰击参数组合（如图4、5、6）。

图4结果表明鳞茎盘最佳轰击参数为轰击距离6cm，气压1350psi；图5、图6结果表明花瓣、副冠最佳轰击参数为轰击距离9cm，1100psi。

轰击操作如下：打开变压器、主机、真空泵电源；打开氦气阀门，将压力调整到比所需压力高出200psi（若所需压力1100psi则将氦气压力调至1300psi以上，若所需压力1350psi则将氦气压力调至1550psi以上）的范围；将可裂膜、涂有子弹的载体膜、铜网一起安装进固定位置，调好距离；将事先准备好的装有受体材料的培养皿放在基因枪室内托盘上，关闭好基因枪门；按下抽真空键Vac，待真空表达到28inches Hg时，使键置于Hold档，保持真空；按下Fire键直至轰击结束；取出培养皿；重复操作直到所有材料操作完毕。

（5）轰击后处理

轰击后受体材料继续放置在渗透培养基上渗透处理盖好培养皿，用封口膜封好，处理1天进行后续观察。

实施例3 ANS基因表达结果鉴定

（1）将受体材料放置在体式显微镜下观察表型变化。

重组质粒pC2300-35S::ANS轰击的受体材料，受体材料均表现出红色性状，见图7、图8、图9，而对照质粒pC2300-35S轰击的受体材料，受体材料均未表现出红色性状，见图10、图11、图12。

（2）样品中花青素含量检测

材料处理：

轰击结束，观察表型变化后的样品真空冷冻干燥，利用研磨仪（MM 400,Retsch）研磨（30Hz，1.5min）至粉末状。称取100mg，溶解于1.0ml提取液（70%甲醇水溶液）中，4℃冰箱过夜，期间涡旋3次，提高提取率。离心（转速10000g，10min）后，吸取上清，用微孔滤膜（0.22umpore size）过滤样品，并保存于进样瓶中，用LC-MS/MS分析。

液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析检测样品中花青素含量：

液相色谱条件：色谱柱：Water ACQUITY UPLC HSS T3 C18 2.1mm×100mm，1.8μm；流动相流动相：水相为超纯水（加入0.04%的乙酸），有机相为乙腈（加入0.04%的乙酸）；流速：0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；梯度洗脱程序：0min，水/乙腈（95:5 V/V），11.0min为5：95V/V，12.0min为5：95V/V，12.1min为95:5V/V，15.0min为95:5V/V。

质谱条件：电喷雾离子源；质谱电压 5500V；帘气 25psi。

导入ANS基因后中国水仙混样质控QC样本的总离子流图（Total ions current，TIC，即每个时间点质谱图所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱）见图13。

导入ANS基因后的中国水仙样本MRM代谢物检测图见图14。

矢车菊素在样本中的定量分析积分校正结果见图15。图15中积分图面积为矢车菊素在样本中的相对含量。说明通过基因枪法，将pC2300-ANS外源植物表达载体导入中国水仙后，能够使其产生矢车菊素，即能使原本无法产生花青素的中国水仙产生花青素，表达出有别于黄、白色的红色性状。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种诱导中国水仙产生花青素的方法及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1334

<212> DNA

<213> SEQ ID NO:1

<400> 1

taccactacc attctattgc catcaaccaa accaagctcc atgccgaccg agatcatgcc 60

gttgccggag agagttgaga gcctggccag cagtggtctc accacaatcc caaaagagta 120

tgttcgtccc gagtcggagc gcgacagcct cggtgacgct ttcgacgaag ccatgaagtt 180

gaactcgagt ggaccgcagg tgccggtagt cgacctagcg ggattcgatt cgcccgatga 240

ggcggtgagg gcgaagtgtg tggaggaatt gaagaaggca gcggaggatt ggggggtgat 300

gcatattgtg aaccatagaa ttccgttgga gttgattgat agggtgaggg aggtgggaaa 360

gggctttttc gaccttccgg tggagcagaa agagaagtat gcgaatgatc aggcgtctgg 420

agagatacag ggttacggca gtaaactggc gaataatgag agcgggcagc ttgagtggga 480

ggattactat tttcacctta tatttccaga ggaaaagacc aatttgtccc tctggcccaa 540

agaaccagaa gactatatag aagtaactaa ggagtttgcc aaggagctga gagtggtggt 600

gaccaagatg ctgtccatgc tctctcaagg tctcggcctc gaatccggca agctcgagaa 660

agagatcggg gggatggaag agctactcat gcagatgaag atcaactact acccgaaatg 720

tccacaaccg gagctcgccc tcggtgtcga agcccacacc gatgtcagct ccctaacctt 780

cctcctcacc aacatggtac cgggccttca gctctactat ggtggcaaat gggtcatcgc 840

ccagtgcgtc cccgattcgc ttctcgtcca cattggcgac actctagaga tcctcagcaa 900

tgggcgctat aggagcattt tgcataggag tttggtgaac aaggagaggg tcaggatctc 960

gtgggcagtg ttctgcgagc cgccgaagga gactatagtg ctgaaaccat tgccggagct 1020

ggtgacggag gcggcgccgg cgaagttccc gccgaggact ttcaagcagc acatccagca 1080

taagttgttc aagaagacgc aggaggactt cacttctccc aagtgaggat gcagattatt 1140

gtctaccgag actgcgtgta ggaatgaata taagtatttc tggattgtag aggggaatta 1200

cgaaataaat gatttgagag gtgagccccc caccccccac ccccattggt ttaaggtatt 1260

tataatttta agtaaatgaa tttatcagtg tgtaagtctc taagaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaa 1334

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：2：ANSF

<400> 2

ggatccatgc cgaccgagat catgccgtt 29

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：3 ANSR

<400> 3

ctgcagcctc acttgggaga agtgaagtcc tcc 33