阅读说明：本技术 一种脂质体转染细胞保护剂 (Liposome transfected cell protective agent ) 是由 杨大旺 张帆 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种脂质体转染过程中的细胞活性保护剂,其特征在于所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为1～10mmol/L的维生素A,终浓度为5～15g/L的甘油,终浓度为10～40g/L的葡萄糖,终浓度为3～20g/L的人血白蛋白。本发明配制的细胞保护剂易于保存且具有较长的货架期,配制好的细胞保护剂在4～8℃下可以保存1年。与在转染容器,本保护剂与转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染,不仅可以保持细胞的活性,而且极大提高转染效率,特别是对于比较难转染的免疫细胞,转染效率提高了40％以上。(The invention provides a cell activity protective agent in a liposome transfection process, which is characterized by comprising the following components: vitamin A with the final concentration of 1-10 mmol/L, glycerol with the final concentration of 5-15 g/L, glucose with the final concentration of 10-40 g/L and human serum albumin with the final concentration of 3-20 g/L. The cell protective agent prepared by the invention is easy to store and has a long shelf life, and the prepared cell protective agent can be stored for 1 year at 4-8 ℃. When the protective agent is transfected with the mixed solution of transfected DNA and liposome transfection reagent in a transfection container, the activity of cells can be maintained, the transfection efficiency is greatly improved, and particularly for immune cells which are difficult to transfect, the transfection efficiency is improved by more than 40%.)

一种脂质体转染细胞保护剂

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，更特别地，涉及一种脂质体转染过程中的细胞活性保护剂。

背景技术

转染是将外源遗传物质转入到真核细胞内的一种专门技术，随着基因与蛋白功能研究的深入，转染已成为现代分子生物学研究中经常涉及的基本方法，它解决了外源遗传物质导入细胞的难题，为在细胞水平上进行基因功能研究奠定了基础。随着近年来基因工程技术的不断发展，出现了多种多样的转染技术。一般的转染方法多采用脂质体法和电穿孔的方法。阳离子脂质体表面带正电荷，与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹成DNA-脂质体复合物，能吸附在表面带负电荷的细胞膜，通过膜的融合或细胞内吞作用进入细胞体内。有时也通过细胞膜上小孔的直接渗透作用将DNA传递进入细胞。电穿孔法或电转法，是通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而将外源分子，如DNA、mRNA、蛋白、糖类等送入宿主细胞的胞浆内。病毒法对原代细胞进行感染时，往往需要较高的病毒滴度且通常效果不甚理想。而电穿孔的方法在操作简易度和实验周期上相比病毒法感染原代细胞更具优势。然而，该法的普及受制于电转效率、细胞存活率、实验仪器差异等诸多因素。加之原代细胞对于多种转染方法都具有较强的抵抗性，使得关于细胞进行高效基因编辑的手段较为匮乏。

有研究发现，在转染过程中，细胞活性状态对转染效率有很大的影响。特别是在免疫细胞的转染过程，细胞活性对转染效率影响非常大。目前，市面上细胞活性保护剂一般为复方柠檬酸钠保存液(ACD)、EDTA或肝素。为了保证免疫细胞的活力，加入复方柠檬酸钠保存液(ACD)、EDTA或肝素的抗凝血必须在6小时之内使用。抗凝血的保存时间如果超过10小时，其中的淋巴细胞会部分或者全部死亡，无法进行后续的转染实验。所以需要开发一种新的细胞保护剂，在保护血液中的免疫细胞，特别是淋巴细胞，T细胞的活力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脂质体转染过程中的细胞活性保护剂，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为1～10mmol/L的维生素A，终浓度为5～15g/L的甘油，终浓度为10～40g/L的葡萄糖，终浓度为3～20g/L的人血白蛋白；

所述的细胞保护剂，优选的，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为4～8mmol/L的维生素A，终浓度为10～15g/L的甘油，终浓度为15～20g/L的葡萄糖，终浓度为10～17g/L的人血白蛋白；

所述的细胞保护剂，更优选的，所述细胞保护剂含有以下组分：终浓度为5mmol/L的维生素A，终浓度为10g/L甘油，终浓度为16g/L的葡萄糖，终浓度为14g/L的人血白蛋白；

所述的细胞保护剂，更优选的，所述细胞保护剂的pH值为7.1-7.5；

所述的细胞保护剂与转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。

本发明配制的细胞保护剂易于保存且具有较长的货架期，配制好的细胞保护剂在4～8℃下可以保存1年。与在转染容器，本保护剂与转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染，不仅可以保持细胞的活性，而且极大提高转染效率，特别是对于比较难转染的免疫细胞，转染效率提高了40％以上。

附图说明

图1是采用试剂转染pEGFP-C1的T细胞在白光(左)和GFP激发光(右)下显微照片；

图2是采用本试剂结合TransLipidHL转染试剂转染GFP过表达逆转录病毒载体的T细胞在GFP激发光下的荧光显微照片；

图3是采用本试剂转染shRNA逆转录病毒载体的T细胞在RFP激发光下的荧光显微照片。

具体实施方式

实施例1

将血液中分离的浓度为1.0×10⁵的T细胞接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为无血清免疫细胞培养基(购自Gibco公司)，培养6～12个小时候填加入5mmol/L的维生素A，终浓度为10g/L甘油，终浓度为16g/L的葡萄糖，终浓度为14g/L的人血白蛋白，同时将4μgpEGFP-C1质粒(一种表达绿色荧光蛋白的真核表达载体，由实验室保存)与8μLLipofectamine 2000(购自Invitrogen公司)按照说明书步骤孵育混合后加入6孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，于不同时间观察转染效果。转染后的荧光显微照片如图1所示，这表明本发明提供的细胞保护剂可获得较好的转染效果。

实施例2

将血液中分离的浓度为1.0×10⁵的T细胞接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为无血清免疫细胞培养基(购自Gibco公司)，培养6～12个小时候填加入7mmol/L的维生素A，终浓度为15g/L甘油，终浓度为18g/L的葡萄糖，终浓度为17g/L的人血白蛋白；同时将4μgRCASBP.B-MSTN-GFP质粒(一种表达绿色荧光蛋白报告基因的MSTN基因过表达逆转录病毒载体，由实验室构建并保存)与10μLTransLipid HL(购自全式金公司)按照说明书步骤孵育混合后加入6孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，于不同时间观察转染效果。转染后的荧光显微照片如图2所示，这表明本发明提供细胞保护可获得较好的转染效果。

实施例3

将血液中分离的浓度为1.0×10⁵的T细胞接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为无血清免疫细胞培养基(购自Gibco公司)，培养6～12个小时候填加入8mmol/L的维生素A，终浓度为13g/L甘油，终浓度为20g/L的葡萄糖，终浓度为20g/L的人血白蛋白；同时将20μg RCASBP.B-RFP-U6-sh1质粒(一种表达红色荧光蛋白报告基因的MSTN基因shRNA逆转录病毒载体，由实验室构建并保存)与40μL Lipofectamine 2000按照说明书步骤孵育混合后加入10cm培养板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，观察转染效果转染后的荧光显微照片如图3所示，这表明本发明提供细胞保护可获得较好的转染效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。