阅读说明：本技术 一种焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型的构建方法及其应用 (Construction method and application of animal model with cognitive decline caused by anxiety combined with continuous sleep deficiency ) 是由 钟倩霞 周勇 丁刘刚 杜志云 潘春杏 李宜鸣 于 2019-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型的构建方法及其应用。该方法包括联合噪音干预、电刺激干预、光干扰干预刺激实验动物,干预结束后对所述实验动物进行动物行为学测试。本发明方法同时关注了焦虑联合连续睡眠缺失导致的认知下降,构建方法操作简单、造模周期短、建模效果好,且对动物不具侵入性。本发明获得的动物模型能更加贴近因压力大、工作负荷重、情绪紧张而产生焦虑和连续睡眠不足状态,进而导致出现认知下降的目标人群健康症状的场景,可用于对生活方式、饮食与药物对焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的症状进行有效性评价,也为相关食品保健品筛选、药物研究开发等提供可靠的评价模型。(The invention discloses a construction method and application of an animal model with cognitive decline caused by anxiety combined with continuous sleep deficiency. The method comprises the steps of stimulating experimental animals by combining noise intervention, electrical stimulation intervention and light interference intervention, and carrying out animal behavior test on the experimental animals after intervention is finished. The method disclosed by the invention simultaneously focuses on cognitive decline caused by anxiety combined with continuous sleep deficiency, and the construction method is simple to operate, short in modeling period, good in modeling effect and non-invasive to animals. The animal model obtained by the invention can be closer to the situation that anxiety and insufficient continuous sleep are generated due to high pressure, heavy workload and emotional stress, so that the health symptoms of target people with cognitive decline are caused, can be used for evaluating the effectiveness of the cognitive decline caused by the combination of life style, diet and medicine on anxiety and continuous sleep deficiency, and also provides a reliable evaluation model for screening related food health products, researching and developing medicines and the like.)

一种焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型的构建 方法及其应用

技术领域

本发明属于动物模型构建技术领域。更具体地，涉及一种焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

现代社会由于科学技术的迅猛发展，工作日益紧张，生活节奏加快，激烈竞争中的压力不断增大，使得越来越多的人长期处于焦虑、睡眠缺失状态，尤以脑力劳动者和在校学生为甚。长期处于焦虑状态会提高焦虑症及抑郁症病发的可能性；长期睡眠不足会带来许多身心的伤害如思考能力下降、警觉力与判断力削弱、免疫功能失调等。焦虑状态与睡眠不足之间互有关联，相互促进，将加深失眠与焦虑的症状。现有研究已证明，睡眠缺失及焦虑状态的出现都会导致认知能力下降。对于脑力工作者而言，认知能力的下降会使其工作效率显著降低。而寻找一种能贴近因压力大、工作负荷重、情绪紧张而产生焦虑和连续睡眠不足状态进而导致认知能力下降的动物模型，有助于有效认识疾病发生、发展规律和研究防治措施。

目前尚未有同时关注焦虑及睡眠缺失共同导致的认知下降的动物模型的研究与报道。

而现有构建睡眠缺失动物模型的方法有慢性夹尾刺激和腹腔注射氯***酸复合因子造模法，咖啡因腹腔注射叠加多平台水环境持续睡眠剥夺法，平台水环境法，强迫运动法。现有构建焦虑动物模型的方法有明暗箱实验与悬尾实验结合法，慢性束缚应激模型，社会隔离模型，不确定性空瓶应激模型，天敌暴露模型。现有的构建模型方法虽然众多，但模型构建过程周期都较长，具有侵入性，且不能达到同时关注焦虑及睡眠缺失共同导致的认知下降的目的，无法满足研究需求。

本发明要解决的技术问题是克服现有动物模型不能同时关注睡眠缺失及焦虑状态导致的认知下降，以及现有构建方法具有建模周期长、侵入性的缺点和不足，提供一种焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型的构建方法，该方法同时关注了焦虑及睡眠缺失共同导致的认知下降，且具有周期短、费用低、操作简便、非侵入性、场景模拟度高、建模效果好的优点。

本发明的目的是提供一种焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型构建方法。

本发明另一目的是提供所构建得到的焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型构建方法，所述方法是联合噪音干预、电刺激干预、光干扰干预刺激实验动物，干预结束后对所述动物模型进行动物行为学测试。

本发明通过联合噪音干预、电刺激干预、光干扰干预方式，高频率、多维度地刺激实验动物，造成实验动物情绪焦虑及连续无法入睡的场景，最大程度地去模拟现实生活中人们在多方面的外界因素如工作压力大、工作时间长、工作负荷重的干扰下而出现焦虑、连续睡眠缺失状态进而导致认知下降的场景。干预结束后，通过动物行为学测试去判定是否建模成功，其中判定建模成功的标准为实验动物出现认知下降的表现。所述方法对实验动物不具侵入性，且操作简便、造模周期短，可大幅度降低实验成本。

优选地，所述噪音干预为对所述实验动物施加声音频率为0.1-2kHz、声强为30-200dB的噪音，噪音循环频率可根据实验要求自拟，每次噪音干扰时间为1s-180s，循环次数≥15次/d，干扰间隔≤1.5h，干扰时间段为0:00-24:00。

优选地，所述电刺激干预为对所述实验动物施加0.4-2mA的刺激电流，由10-200VAC多倍压整流后获得，电刺激循环频率可根据实验需求自拟，每次电刺激时间为0.5-30s，刺激次数≥15次/d，刺激间隔≤1.5h，刺激时间段为0:00-24:00。

优选地，所述光干扰干预为对所述实验动物持续通过日光灯照射，照射时间段为0:00-24:00，持续照亮周期可根据实验要求自拟。

本发明通过优化噪音、电刺激及光干扰干预时间和强度，获得动物行为学和相关生理指标符合焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型，建立的动物模型效果更优。

优选地，所述干预周期为1-7天。

优选地，所述动物行为学测试为Morris行为学测试。通过Morris行为学测试可比对实验动物是否出现认知下降的症状，如果所述动物模型的Morris行为学测试指标显著低于正常对照(p<0.05)，则表示所述模型动物建模成功。

进一步，优选地，所述Morris行为学测试指标包括：

定向航行指标：测定所述实验动物到达指定求生平台的时间长短；

空间探索指标：测定在撤去求生平台的条件下所述实验动物穿越平台区域次数；测定在撤去求生平台的条件下，所述实验动物在一分钟的航行时间中，活跃在平台所在象限的时间与总时间的占比。

优选地，所述实验动物为啮齿动物。

进一步，优选地，所述实验动物为小鼠。

根据上述方法得到的动物模型在筛选或鉴定可减轻或治疗焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的治疗剂中的应用。

其中，所述筛选或鉴定过程包括以下步骤：

(1)根据上述方法获得的动物模型分为对照组和测试组，对测试组施用测试化合物，对测试组和对照组分别进行所述Morris行为学测试；

(2)对比测试组和对照组动物模型行为，若测试组动物模型Morris行为学测试指标得到改善，则表明所述测试化合物可作为焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的治疗剂。

此外，通过对所述实验动物预设给药周期，在进行多维度刺激，构建焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型过程后，运用上述的动物行为学实验可评测出各个测试化合物的抗认知下降的效果优劣。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过联合噪音干预、电刺激干预、光干扰干预方式，高频率、多维度地刺激干扰实验动物构建动物模型，本发明同时关注睡眠缺失及焦虑状态导致的认知下降，所述动物建模方法具有非侵入性，建模周期短、操作简单、费用低，建模效果好的优点。本发明构建的动物模型可有效用于抗认知下降、提神的食品或药物的研究，如用于筛选或鉴定可减轻或治疗因睡眠缺失、焦虑导致认知下降的食品或药物，同时可对这些食品或药物在改善认知能力、提神功效进行很好的评价。

附图说明

图1为对比例1中小鼠定向航行轨迹图；

图2为对比例1中小鼠定向航行花费时间。

实施方式

以下结合说明书附图和

具体实施方式

来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型的构建

雄性昆明小鼠18-22g 8只，购于广东省医学实验动物中心。实验前将它们适应性饲养3天。按体重分为空白对照组、模型组共2组，每组4只，并做好标记，使每组小鼠体重无显著性差异。

实验建模周期为两天。建模期间设置噪音、电刺激及光干扰(以下简称声光电)的实验参数为以下数据：噪音干扰时通过使用电铃进行噪音刺激(120dB)，循环频率为1min/0.5h；电刺激由53-63V的交流电连接自制电网进行刺激，循环频率10s/0.5h；光信号为日光灯信号，持续48h。模型组接受声光电刺激，空白组不做任何处理。在声光电建模24h后进行水迷宫定向航行测试，48h后进行水迷宫空间探索实验。

2、建模结束进行Morris水迷宫行为学测试，测试结果如下：

表1各组别定向航行花费时间

注：####代表模型组与空白组相比，P＜0.0001

表2各组别空间探索实验目标象限逗留时间所占总时间比

注：####代表模型组与空白组相比，P＜0.0001

表3各组别空间探索实验穿越平台次数

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

由表1、表2及表3可总结出，声光电建模的小鼠模型可在48h内引起小鼠出现认知能力下降。在定向航行实验中模型组对比空白组，明显出现因睡眠缺失、焦虑出现认知能力下降的状态(p<0.0001)。在空间探索实验中模型组对比空白组，穿越平台次数明显减少(p<0.01)，在目标象限逗留时间也明显降低(p<0.0001)，说明模型组小鼠因记忆力下降无法判定求生平台所在区域。

结合定向航行、空间探索实验结果，声光电建模的小鼠模型可以在2天的建模周期内模拟出因睡眠缺失、焦虑致认知能力下降的状态。

实施例2

1、焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型构建

雄性昆明小鼠18-22g 8只，购于广东省医学实验动物中心。实验前将它们适应性饲养3天。按体重分为空白对照组、模型组共2组，每组4只，并做好标记，使每组小鼠体重无显著性差异。

实验建模周期为两天。建模期间设置噪音、电刺激及光干扰(以下简称声光电)的实验参数为以下数据：噪音干扰时通过使用直径为55mm的电铃进行噪音刺激(120dB)，循环频率为1min/0.5h；电刺激由20-30V的交流电连接自制电网进行刺激，循环频率10s/2h；光信号为日光灯信号，持续48h。模型组接受声光电刺激，空白组不做任何处理。在声光电建模24h后进行水迷宫定向航行测试，48h后进行水迷宫空间探索实验。

2、建模结束进行Morris水迷宫行为学测试，测试结果如下：

表4各组别定向航行花费时间

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表5各组别空间探索实验目标象限逗留时间所占总时间比

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表6各组别空间探索实验穿越平台次数

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

由表4、表5及表6可总结出，声光电建模的小鼠模型可在48h内引起小鼠出现认知能力下降。在定向航行实验中模型组对比空白组，明显出现因睡眠缺失、焦虑出现认知能力下降的状态(p<0.01)。在空间探索实验中模型组对比空白组，穿越平台次数明显减少(p<0.01)，在目标象限逗留时间也明显降低(p<0.01)，说明模型组小鼠因记忆力下降无法判定求生平台所在区域。

结合定向航行、空间探索实验结果，本次声光电建模的小鼠模型能模拟出因睡眠缺失、焦虑致认知能力下降的状态。

实施例3

1、焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型构建

雄性昆明小鼠18-22g 8只，购于广东省医学实验动物中心。实验前将它们适应性饲养3天。按体重分为空白对照组、模型组共2组，每组4只，并做好标记，使每组小鼠体重无显著性差异。

实验建模周期为两天。建模期间设置噪音、电刺激及光干扰(以下简称声光电)的实验参数为以下数据：噪音干扰时通过使用电铃进行噪音刺激(60dB)，循环频率为1min/2h；电刺激由53-63V的交流电连接自制电网进行刺激，循环频率10s/0.5h；光信号为日光灯信号，持续48h。模型组接受声光电刺激，空白组不做任何处理。在声光电建模24h后进行水迷宫定向航行测试，48h后进行水迷宫空间探索实验。

2、建模结束进行Morris水迷宫行为学测试，测试结果如下：

表7各组别定向航行花费时间

注：###代表模型组与空白组相比，P＜0.001

表8各组别空间探索实验目标象限逗留时间所占总时间比

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表9各组别空间探索实验穿越平台次数

注：#代表模型组与空白组相比，P＜0.05

由表7、表8及表9可总结出，声光电建模的小鼠模型可在48h内引起小鼠出现认知能力下降。在定向航行实验中模型组对比空白组，明显出现因睡眠缺失、焦虑出现认知能力下降的状态(p<0.001)。在空间探索实验中模型组对比空白组，穿越平台次数明显减少(p<0.01)，在目标象限逗留时间也明显降低(p<0.05)，说明模型组小鼠因记忆力下降无法判定求生平台所在区域。

结合定向航行、空间探索实验结果，声光电建模的小鼠模型可以模拟出因睡眠缺失、焦虑致认知能力下降的状态。

实施例4

1、焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型构建

雄性昆明小鼠18-22g 8只，购于广东省医学实验动物中心。实验前将它们适应性饲养3天。按体重分为空白对照组、模型组共2组，每组4只，并做好标记，使每组小鼠体重无显著性差异。

实验建模周期为两天。建模期间设置噪音、电刺激及光干扰(以下简称声光电)的实验参数为以下数据：噪音干扰时通过使用电铃进行噪音刺激(60dB)，循环频率为1min/0.5h；电刺激由53-63V的交流电连接自制电网进行刺激，循环频率10s/0.5h；光信号为日光灯信号，持续48h。模型组接受声光电刺激，空白组不做任何处理。在声光电建模24h后进行水迷宫定向航行测试，48h后进行水迷宫空间探索实验。

2、建模结束进行Morris水迷宫行为学测试，测试结果如下：

表10各组别定向航行花费时间

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表11各组别空间探索实验目标象限逗留时间所占总时间比

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表12各组别空间探索实验穿越平台次数

注：#代表模型组与空白组相比，P＜0.05

由表10、表11及表12可总结出，声光电建模的小鼠模型可在48h内引起小鼠出现认知能力下降。在定向航行实验中模型组对比空白组，明显出现因睡眠缺失、焦虑出现认知能力下降的状态(p<0.01)。在空间探索实验中模型组对比空白组，穿越平台次数明显减少(p<0.01)，在目标象限逗留时间也明显降低(p<0.05)，说明模型组小鼠因记忆力下降无法判定求生平台所在区域。

结合定向航行、空间探索实验结果，声光电建模的小鼠模型可以模拟出因睡眠缺失、焦虑致认知能力下降的状态。

实施例5

1、焦虑联合连续睡眠缺失导致认知下降的动物模型构建

雄性昆明小鼠18-22g 8只，购于广东省医学实验动物中心。实验前将它们适应性饲养3天。按体重分为空白对照组、模型组共2组，每组4只，并做好标记，使每组小鼠体重无显著性差异。

实验建模周期为两天。建模期间设置噪音、电刺激及光干扰(以下简称声光电)的实验参数为以下数据：噪音干扰时通过使用电铃进行噪音刺激(60dB)，循环频率为1min/2h；电刺激由20-30V的交流电连接自制电网进行刺激，循环频率10s/2h；光信号为日光灯信号，持续96h。模型组接受声光电刺激，空白组不做任何处理。在声光电建模72h后进行水迷宫定向航行测试，96h后进行水迷宫空间探索实验。

2、建模结束进行Morris水迷宫行为学测试，测试结果如下：

表13各组别定向航行花费时间

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表14各组别空间探索实验目标象限逗留时间所占总时间比

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表15各组别空间探索实验穿越平台次数

注：#代表模型组与空白组相比，P＜0.05

由表13、表14及表15可总结出，声光电建模的小鼠模型可在96h内引起小鼠出现认知能力下降。在定向航行实验中模型组对比空白组，明显出现因睡眠缺失、焦虑出现认知能力下降的状态(p<0.01)。在空间探索实验中模型组对比空白组，穿越平台次数明显减少(p<0.01)，在目标象限逗留时间也明显降低(p<0.05)，说明模型组小鼠因记忆力下降无法判定求生平台所在区域。

结合定向航行、空间探索实验结果，声光电建模的小鼠模型可以模拟出因睡眠缺失、焦虑致认知能力下降的状态。

对实例1至实例5展开对比，梳理出下表(表16-18)。

表16各组别定向航行花费时间

注：####代表模型组与空白组相比，P＜0.0001，###代表模型组与空白组相比，P＜0.001，##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表17各组别空间探索实验目标象限逗留时间所占总时间比

注：####代表模型组与空白组相比，P＜0.0001，##代表模型组与空白组相比，P＜0.01

表18各组别空间探索实验穿越平台次数

注：##代表模型组与空白组相比，P＜0.01，#代表模型组与空白组相比，P＜0.05

对比例1

1、本发明方法动物模型构建与平台水环境法动物模型构建对比

雄性昆明小鼠18-22g 12只，购于广东省医学实验动物中心。实验前将它们适应性饲养3天。按体重分为空白对照组、声光电模型组、平台水环境法组、每组4只，并做好标记，使每组小鼠体重无显著性差异。

本发明方法动物模型构建：设置噪音、电刺激及光干扰的实验参数为以下数据：噪音干扰时通过使用直径为55mm的电铃进行噪音刺激(120dB)，循环频率为1min/0.5h；电刺激由53-63V的交流电连接自制电网进行刺激，循环频率10s/0.5h；光信号为日光灯信号，持续48h。模型组接受声光电刺激，空白组不做任何处理。在声光电建模48h后进行水迷宫定向航行测试。声光电组实验建模周期为两天。

平台水环境法动物模型构建：在6*6*10cm的空间中，空间的正中央搭有2.5*2.5*4cm的平台，将小鼠放置在平台上后，空间注水高度为距离平台高度1cm处，水温控制在20-22℃，早9:00-21:00保持日光灯照射。在平台水环境法开展96h后进行水迷宫定向航行测试。平台水环境法组实验建模周期为四天。

2、Morris行为学测试结果

由图1及图2可总结出，声光电建模的小鼠模型可在48h内引起小鼠出现认知能力下降，建模时间比平台水环境法(96h)短。在定向航行实验中对比空白组，声光电建模组与平台水环境法组均明显出现因模拟睡眠缺失联合焦虑导致认知下降的状态(p<0.01)。但是，相比于平台水环境法组，声光电建模组到达指定求生平台轨迹更曲折，所花时间更长，因此声光电建模组的建模效果比平台水环境法更好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。