阅读说明：本技术 蛋白质CkWRKY33及其编码基因与应用 (Protein CkWRKY33 and coding gene and application thereof ) 是由 龙艳 裴新梧 梁凤萍 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了蛋白质CkWRKY33及其编码基因与应用。蛋白质CkWRKY33的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。实验证明,向野生型拟南芥Columbia-0亚型中导入CkWRKY33基因,得到转基因拟南芥；与野生型拟南芥Columbia-0亚型相比,转基因拟南芥的抗旱性提高,抗旱性提高体现在丙二醛含量降低、可溶性糖含量增加、脯氨酸含量增加、过氧化物酶活性增加、失水率降低和存活率提高。由此可见,蛋白质CkWRKY33可以提高植物抗逆性。本发明具有重要的应用价值。(The invention discloses a protein CkWRKY33 and an encoding gene and application thereof. The amino acid sequence of the protein CkWRKY33 is shown as SEQ ID NO: 2, respectively. Experiments prove that CkWRKY33 gene is introduced into a wild type Arabidopsis thaliana Columbia-0 subtype to obtain transgenic Arabidopsis thaliana; compared with the wild type Arabidopsis thaliana Columbia-0 subtype, the drought resistance of the transgenic Arabidopsis thaliana is improved, and the improvement of the drought resistance is reflected in that the malonaldehyde content is reduced, the soluble sugar content is increased, the proline content is increased, the peroxidase activity is increased, the water loss rate is reduced and the survival rate is improved. Therefore, the protein CkWRKY33 can improve the stress resistance of plants. The invention has important application value.)

蛋白质CkWRKY33及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质CkWRKY33及其编码基因与应用。

背景技术

柠条锦鸡儿是一种主要生长在荒漠或半荒漠地区的沙地的豆科灌木，其具有高度发达的根系、极强的耐旱性和耐寒性。柠条锦鸡儿不仅是重要的牧草、工业原料，而且还可以保持水土，防止土壤沙漠化，具有重要的经济和生态价值(Fang X W，Li J H，Xiong Y C，Xu D H，Fan X W，Li F M.Responses of Caraganakorshinskii Kom.to shoot removal：mechanisms underlying regrowth[J].Ecological Research，2007，23(5)：863-871.)。

截止目前，针对柠条锦鸡儿的研究主要集中在生物学特性、生理变化以及解剖结构等方面，而对其抗逆相关基因的研究甚少。

发明内容

本发明的目的是提高植物的抗逆性。

本发明提供了一种蛋白质，获自柠条锦鸡儿，命名为蛋白质CkWRKY33，可为如下a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

其中，SEQ ID NO：2由537个氨基酸残基组成。

为了使蛋白质便于纯化和检测，可在由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质CkWRKY33的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述蛋白质CkWRKY33的核酸分子可为如下b1)或b2)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO：1由1614个核苷酸组成，SEQ ID NO：1的核苷酸编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质CkWRKY33的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质CkWRKY33的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质CkWRKY33，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质CkWRKY33的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

编码所述蛋白质CkWRKY33的核酸分子具体可为编码所述蛋白质CkWRKY33的基因，命名为CkWRKY33基因。

含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点***SEQ ID NO：1所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33。所述重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33可为将pBinGlyRed3载体的限制性内切酶EcoRI和XmaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子，得到的重组质粒。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。

所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为EHA105/pBinGlyRed3-CkWRKY33。所述EHA105/pBinGlyRed3-CkWRKY33为将重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

本发明还保护上述任一所述蛋白质CkWRKY33，或，上述任一所述核酸分子，或，含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，的应用，可为A1)或A2)：

A1)调控植物抗逆性；

A2)培育抗逆性改变的转基因植物。

上述应用中，所述调控植物抗逆性可为增加植物抗逆性。

上述应用中，所述“培育抗逆性改变的转基因植物”可为培育抗逆性增加的转基因植物。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括如下步骤：提高出发植物中上述任一所述蛋白质CkWRKY33的表达量和/或活性，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物的抗逆性提高。

上述方法中，所述“提高出发植物中上述任一所述蛋白质CkWRKY33的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到提高蛋白质CkWRKY33的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中上述任一所述蛋白质CkWRKY33的表达量和/或活性”可通过向出发植物导入编码所述蛋白质CkWRKY33的核酸分子实现。

上述任一所述的方法中，所述编码蛋白质CkWRKY33的核酸分子可为如下b1)或b2)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO：1由1614个核苷酸组成，SEQ ID NO：1的核苷酸编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

所述“向出发植物导入编码所述蛋白质CkWRKY33的核酸分子”具体可通过向出发植物导入含有编码所述蛋白质CkWRKY33的核酸分子的重组载体实现。所述“含有编码所述蛋白质CkWRKY33的核酸分子的重组载体”具体可为所述重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33。

本发明还保护一种植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质CkWRKY33的含量和/或活性，从而提高植物的抗逆性。

上述任一所述植物或出发植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)野生型拟南芥Columbia-0亚型。

上述任一所述抗逆性可为抗旱性。

上述任一所述植物抗旱性提高体现在丙二醛含量降低、可溶性糖含量增加、脯氨酸含量增加、过氧化物酶活性增加、失水率降低和存活率提高中的至少一种。

实验证明，向野生型拟南芥Columbia-0亚型中导入CkWRKY33基因，得到转基因拟南芥；与野生型拟南芥Columbia-0亚型相比，转基因拟南芥的抗旱性提高，抗旱性提高体现在丙二醛含量降低、可溶性糖含量增加、脯氨酸含量增加、过氧化物酶活性增加、失水率降低和存活率提高。由此可见，蛋白质CkWRKY33可以提高植物抗逆性。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为自然干旱前、自然干旱后和复水3天后，待测拟南芥植株的生长状态。

图2为拟南芥植株存活率的统计结果。

图3为拟南芥离体叶片失水率的统计结果。

图4为拟南芥叶片中可溶性糖含量的统计结果。

图5为拟南芥叶片中丙二醛含量的统计结果。

图6为拟南芥叶片中脯氨酸含量的统计结果。

图7为拟南芥叶片中过氧化物酶活性的统计结果。

图8为在1/2MS固体培养基和含甘露醇的1/2MS固体培养基上拟南芥的生长状态。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

柠条锦鸡儿种子为2014年本发明的发明人裴新梧(010-82106120)从甘肃民勤沙生植物园采集。

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004，36:167-171.在下文中，野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。

实施例1、蛋白质CkWRKY33的编码基因(即CkWRKY33基因)的克隆

1、将柠条锦鸡儿种子播种于沙土，正常生长管理，得到生长1个月的柠条锦鸡儿植株；之后停止浇水20天，得到干旱处理的柠条锦鸡儿植株。

干旱处理的柠条锦鸡儿植株根系发达，叶片发白且有较浓的表皮毛，具有较强的抗旱性。

2、取步骤1获得的干旱处理的柠条锦鸡儿植株的叶片，先提取总RNA，然后反转录，获得柠条锦鸡儿的cDNA。

3、完成步骤2后，以柠条锦鸡儿的cDNA为模板，采用引物F：5’-ATGACTATGGATGATCATAACTG-3’和引物R：5’-TTAGAAGTCCTTTGACATAAAT-3’组成的引物对进行PCR扩增，然后回收约1614bp的PCR扩增产物。

4、将步骤3回收的PCR扩增产物进行测序。

测序结果表明，步骤3回收的PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列命名为CkWRKY33基因。

CkWRKY33基因编码SEQ ID NO：2所示的蛋白质CkWRKY33。

实施例2、转CkWRKY33基因拟南芥的获得及抗旱性鉴定

一、重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33的获得

1、用限制性内切酶EcoRI和XmaI酶切pBinGlyRed3载体(Zhang C，Iskandarov U，Klotz E T，et al.Athraustochytrid diacylglycerol acyltransferase 2with broadsubstrate specificity strongly increases oleic acid content in engineeredArabidopsis thaliana seeds.Journal of Experimental Botany，2013，64(11):3189-3200.)，回收约9kb的载体骨架。

2、以步骤一中2获得的柠条锦鸡儿的cDNA为模板，采用引物FF：5’-ACGGGGGACTGA ATTCATGACTATGGATGATCATAACTG-3’(下划线为限制性内切酶EcoRI的识别位点)和引物FR：5’-CCGCCTCGAGCCCGGGTTAGAAGTCCTTTGACATAAAT-3’(下划线为限制性内切酶XmaI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，回收约1650bp的PCR扩增产物。

3、将步骤1回收的载体骨架和步骤2回收的PCR扩增产物进行同源重组，得到重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33。

将重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33进行结构描述如下：将pBinGlyRed3载体的限制性内切酶EcoRI和XmaI识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子(SEQ IDNO：1所示的DNA分子即CkWRKY33基因)，得到的重组质粒。

二、重组农杆菌的获得

将重组质粒pBinGlyRed3-CkWRKY33导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pBinGlyRed3-CkWRKY33。

三、转CkWRKY33基因拟南芥的获得

1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)将EHA105/pBinGlyRed3-CkWRKY33转至野生型拟南芥中，获得T₁代转CkWRKY33基因拟南芥种子。

2、在绿光灯下观察T₁代转CkWRKY33基因拟南芥种子的发光情况，然后种植能够发红光的种子，得到T₁代转CkWRKY33基因阳性苗。T₁代转CkWRKY33基因阳性苗收到的种子即为T₂代转CkWRKY33基因拟南芥种子。

3、在绿光灯下观察步骤2筛选出的不同株系的T₂代转CkWRKY33基因拟南芥种子的发光情况。如果某株系中能够发红光种子的数目与不能够发红光种子的数目比例为3：1，则该株系为CkWRKY33基因***一个拷贝的株系，该株系中收到的种子即为T₃代转CkWRKY33基因拟南芥种子。

4、在绿光灯下观察步骤3筛选出的T₃代转CkWRKY33基因拟南芥种子的发光情况，均能够发红光种子的株系即为T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥。将其中3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系分别命名为L2、L9和L10，并进行后续实验。

四、分子鉴定

待测拟南芥种子为L2的T₃代种子、L9的T₃代种子、L10的T₃代种子或野生型拟南芥种子。

(1)取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化2天。

(2)完成步骤(1)后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)28天，得到待测拟南芥幼苗。

(3)提取待测拟南芥幼苗的基因组DNA并以其作为模板，采用5’-ACTGACGTAAGGGATGACGCACA-3’和5’-GTTGCTAGCACTATTGCCAAAAA-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；然后进行如下判断：如果某PCR扩增产物中含有约1700bp的DNA片段，则该PCR扩增产物对应的待测拟南芥幼苗为阳性苗。

结果表明，L2的T₃代种子、L9的T₃代种子和L10的T₃代种子获得的幼苗均为阳性苗。

五、转CkWRKY33基因拟南芥的抗旱性鉴定

待测拟南芥种子为L2的T₃代种子、L9的T₃代种子、L10的T₃代种子或野生型拟南芥种子。

培养条件为：22℃；16h光照/8h黑暗；光照强度为12000Lx。

A、自然抗旱性鉴定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取3个培养盆，每盆种植待测拟南芥种子，培养3周；之后每盆保留4株长势基本一致的待测拟南芥幼苗。

2、完成步骤1后，自然干旱15天。

3、完成步骤2后，复水，3天后统计待测拟南芥植株的存活率。

自然干旱前、自然干旱后和复水3天后，待测拟南芥植株的生长状态见图1(WT为野生型拟南芥)。结果表明，自然干旱前，野生型拟南芥和3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的表型均无显著差异；自然干旱15天后，野生型拟南芥的叶片全部失绿变黄、卷曲，甚至植株直接死亡，而3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的叶片尖端稍有变黄和卷曲；复水3天后，野生型拟南芥萎蔫脱水致死，而3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)生长良好，全部存活。

待测拟南芥植株的存活率统计结果见图2(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的存活率显著提高(P<0.05)。

B、离体叶片失水率的测定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、种植待测拟南芥种子，培养3周，得到待测拟南芥幼苗。

2、完成步骤1后，取长势基本一致的待测拟南芥幼苗，摘取叶片，用万分之一天平称重，即为鲜重。

3、完成步骤2后，将所述叶片置于培养皿，室温放置1h、2h、4h、6h、8h、10h或12h，用万分之一天平称重，即为失水后重。

4、完成步骤3后，计算离体叶片的失水率。

失水率(％)＝(鲜重(g)-失水后重(g))/(鲜重(g))×100％

以叶片放置时间为横坐标，对应的失水率为纵坐标，绘制失水曲线。失水曲线见图3(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的失水率显著降低(P<0.05)。

C、可溶性糖含量的测定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：进行步骤A中2时，采集待测拟南芥幼苗的叶片，然后采用植物可溶性糖含量检测试剂盒(Solarbio公司的产品)检测可溶性糖含量。

检测结果见图4(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的可溶性糖含量显著增加(P<0.05)。

D、丙二醛(MDA)含量的测定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：进行步骤A中2时，采集待测拟南芥幼苗的叶片，然后采用丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(Solarbio公司的产品)检测丙二醛含量。

检测结果见图5(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的丙二醛含量显著降低(P<0.05)。

E、脯氨酸含量的测定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：进行步骤A中2时，采集待测拟南芥幼苗的叶片，然后采用脯氨酸试剂盒(Solarbio公司的产品)检测脯氨酸含量。

检测结果见图6(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的脯氨酸含量显著增加(P<0.05)。

F、过氧化物酶活性的测定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：进行步骤A中2时，采集待测拟南芥幼苗的叶片，然后采用过氧化物酶试剂盒(Solarbio公司的产品)检测过氧化物酶活性。

检测结果见图7(WT为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，2个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2和L10)的过氧化物酶活性显著增加(P<0.05)，L9的过氧化物酶活性有一定程度的增加。

G、甘露醇胁迫条件下(即通过加入甘露醇模拟干旱)的抗旱性鉴定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、取20粒待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液处理5min，2.6％(v/v)次氯酸钠水溶液灭菌10min，然后用灭菌吐温水清洗5次。

2、完成步骤1后，将待测拟南芥种子播种于培养基(1/2MS固体培养基、含50mM甘露醇的1/2MS固体培养基或含100mM甘露醇的1/2MS固体培养基)，4℃春化3天。

3、将完成步骤2的培养基竖直培养6天，观察拟南芥的生长状态。

部分拟南芥的生长状态见图8(WT为野生型拟南芥)。结果表明，在1/2MS固体培养基上，野生型拟南芥和3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的表型均无显著差异；在含甘露醇的1/2MS固体培养基上，拟南芥幼苗长势均变弱，莲座叶均变黄，根长也均变短，但与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转CkWRKY33基因拟南芥株系(L2、L9和L10)的根长显著增加(P<0.05)，长势也较好，莲座叶更绿一些，存活率均有一定程度的增加。

上述结果表明，向野生型拟南芥中导入CkWRKY33基因可以提高拟南芥的抗旱性，抗旱性提高体现在丙二醛含量降低、可溶性糖含量增加、脯氨酸含量增加、过氧化物酶活性增加、失水率降低和存活率提高。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 蛋白质CkWRKY33及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1614

<212> DNA

<213> Caragana korshinskii Kom.

<400> 1

atgactatgg atgatcataa ctggggaact tctgaacttg gtagtaatca tcaaattgga 60

cttgaagctc ctaaattcaa gtctgttcaa cctccctcac tacctctctc ctcctcacca 120

atttcccctt cttgttactc agccttttca tctggtttta gccctactga gttcttaatc 180

tcacctttgt ttctttcttc tccaaatgtt tttgcatctc ccactattga tgcttttgct 240

ggccagagct tcaattggaa gaacagttca ggtgaggacc aacaaaatga caaggaggat 300

gagaaaaact actctgactt ctctttccaa acccaaacaa aacctgcatc tgattttcag 360

tcttcctcag gcatgtttca agcggaacca attaagaaac aagatatatg gaaattcagt 420

gaacctaaaa tgcaaactga tttttcatct gagaggacag cagaaaaatc tgaattcaca 480

tcaacccaga gtttctcctc agaaatagca gcaagcaaac cagaaacaca tagtaactca 540

gttcctgggt ctggttattt caactacact aatgcatctc agacagttag agaacaaaag 600

agatcagaag atgggttcaa ctggagaaaa tatggacaga aacaagtgaa aggaagcgaa 660

aatccgcgca gttattataa gtgcacacat ctgaattgct caatgaagaa gaaagttgag 720

aggtctttgg tggatggaca aatcactgaa attgtatata agggaaatca taaccacccc 780

aaaccccaat ctactagaag aacaagctct caacattctt cgtcctgcac caactcgggg 840

atttctgatc aatcagtggt gaccctaggc aatccacaga ctatctccat tcaagaagat 900

tcttcagcct ctgtgggaga ggaagacttt gaacaaacat cacaaactag ttattctgga 960

ggagacgaag acgcccttgg accggaggcc aaaagatgga agggagataa tgaaaatgat 1020

ggatattctg cccaagggag tagaactgtt aaagagccta gagttgtagt tcaaactaca 1080

agtgaaattg atatacttga tgatggctat aggtggagga aatatggaca gaaagtagtt 1140

aaaggaaacc caaatgcaag gagctattac aaatgcacgg ccccaggttg ttcggtgaga 1200

aaacatgttg agcgagctgc aaatgatatc aaagctgtga tcacaactta cgaagggaaa 1260

cacaaccacg atgtaccttc tgcacgtggc agtgcgggtt ataacatgaa cagaaattct 1320

cttaacaaca gcaatgtacc agcgcctata aggccctcgg tggtgaactg ttattcaagc 1380

tcatcaagtt tcacagattc actttataag cccaggcttc ctacaattgg aaatcaagag 1440

tcatttccac tggacatatc tcagggtcct ggaaatttcg ggtattcggc tcttggaaga 1500

tcaatgggtt catttaccaa tcactcacaa tgcttagatg atgcatactc aaaagccaag 1560

gatgagagaa aggatgactc attccttcag tcatttatgt caaaggactt ctaa 1614

<210> 2

<211> 537

<212> PRT

<213> Caragana korshinskii Kom.

<400> 2

Met Thr Met Asp Asp His Asn Trp Gly Thr Ser Glu Leu Gly Ser Asn

1 5 10 15

His Gln Ile Gly Leu Glu Ala Pro Lys Phe Lys Ser Val Gln Pro Pro

20 25 30

Ser Leu Pro Leu Ser Ser Ser Pro Ile Ser Pro Ser Cys Tyr Ser Ala

35 40 45

Phe Ser Ser Gly Phe Ser Pro Thr Glu Phe Leu Ile Ser Pro Leu Phe

50 55 60

Leu Ser Ser Pro Asn Val Phe Ala Ser Pro Thr Ile Asp Ala Phe Ala

65 70 75 80

Gly Gln Ser Phe Asn Trp Lys Asn Ser Ser Gly Glu Asp Gln Gln Asn

85 90 95

Asp Lys Glu Asp Glu Lys Asn Tyr Ser Asp Phe Ser Phe Gln Thr Gln

100 105 110

Thr Lys Pro Ala Ser Asp Phe Gln Ser Ser Ser Gly Met Phe Gln Ala

115 120 125

Glu Pro Ile Lys Lys Gln Asp Ile Trp Lys Phe Ser Glu Pro Lys Met

130 135 140

Gln Thr Asp Phe Ser Ser Glu Arg Thr Ala Glu Lys Ser Glu Phe Thr

145 150 155 160

Ser Thr Gln Ser Phe Ser Ser Glu Ile Ala Ala Ser Lys Pro Glu Thr

165 170 175

His Ser Asn Ser Val Pro Gly Ser Gly Tyr Phe Asn Tyr Thr Asn Ala

180 185 190

Ser Gln Thr Val Arg Glu Gln Lys Arg Ser Glu Asp Gly Phe Asn Trp

195 200 205

Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Gly Ser Glu Asn Pro Arg Ser

210 215 220

Tyr Tyr Lys Cys Thr His Leu Asn Cys Ser Met Lys Lys Lys Val Glu

225 230 235 240

Arg Ser Leu Val Asp Gly Gln Ile Thr Glu Ile Val Tyr Lys Gly Asn

245 250 255

His Asn His Pro Lys Pro Gln Ser Thr Arg Arg Thr Ser Ser Gln His

260 265 270

Ser Ser Ser Cys Thr Asn Ser Gly Ile Ser Asp Gln Ser Val Val Thr

275 280 285

Leu Gly Asn Pro Gln Thr Ile Ser Ile Gln Glu Asp Ser Ser Ala Ser

290 295 300

Val Gly Glu Glu Asp Phe Glu Gln Thr Ser Gln Thr Ser Tyr Ser Gly

305 310 315 320

Gly Asp Glu Asp Ala Leu Gly Pro Glu Ala Lys Arg Trp Lys Gly Asp

325 330 335

Asn Glu Asn Asp Gly Tyr Ser Ala Gln Gly Ser Arg Thr Val Lys Glu

340 345 350

Pro Arg Val Val Val Gln Thr Thr Ser Glu Ile Asp Ile Leu Asp Asp

355 360 365

Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn Pro

370 375 380

Asn Ala Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Ala Pro Gly Cys Ser Val Arg

385 390 395 400

Lys His Val Glu Arg Ala Ala Asn Asp Ile Lys Ala Val Ile Thr Thr

405 410 415

Tyr Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Ser Ala Arg Gly Ser Ala

420 425 430

Gly Tyr Asn Met Asn Arg Asn Ser Leu Asn Asn Ser Asn Val Pro Ala

435 440 445

Pro Ile Arg Pro Ser Val Val Asn Cys Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Phe

450 455 460

Thr Asp Ser Leu Tyr Lys Pro Arg Leu Pro Thr Ile Gly Asn Gln Glu

465 470 475 480

Ser Phe Pro Leu Asp Ile Ser Gln Gly Pro Gly Asn Phe Gly Tyr Ser

485 490 495

Ala Leu Gly Arg Ser Met Gly Ser Phe Thr Asn His Ser Gln Cys Leu

500 505 510

Asp Asp Ala Tyr Ser Lys Ala Lys Asp Glu Arg Lys Asp Asp Ser Phe

515 520 525

Leu Gln Ser Phe Met Ser Lys Asp Phe

530 535